RNAi简介
RNA干涉又称RNA干扰，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi 的作用提供了一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段，有助于研究该基因在生物模型系统中的作用，是研究基因功能的重要工具，并且逐步成为病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究的一种手段。通过该过程，双链RNA诱导目标基因沉默。
1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo 博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。
由于基因的功能无法表达而不能显现,故又将此现象称基因沉默(gene silencing)。现在研究证明，RNAi现象存在于各种无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物中，例如果蝇、锥虫、涡虫、水螅、线虫、斑马鱼以及小鼠，甚至在原核生物如大肠埃希菌中都广泛存在。
RNAi的机制
基因所携带遗传信息(即单个基因的具体功能)的传递是通过名为信使RNA的分子进入细胞蛋白合成“工厂”而实现的，而基因功能的研究方法一直是研究工作的拦路虎。Fire和Mello通过线虫实验证实：某些分子触发了特定基因上RNA的破坏，导
致蛋白无法合成，出现“基因沉默”，而这一过程便被称为RNAi。天然的RNAi现象存在于植物动物和人类等真核生物的体内，在调解基因活力和预防病毒感染方面起到重要作用。同时他们还发现了有效关闭基因表达的方法，这样当某一特定基因被“沉默”后，其功能便反向的体现出来了。RNAi的作用机制尚未完全清楚，据目前的研究成果看来主要有3种形式，即转录水平、翻译水平和转录后水平。其中转录后水平是RNAi在各种生物中实现的主要方式，其机制研究也较深入。
转录水平和翻译水平
转录水平上的干扰机制是通过对靶基因染色质结构的改变，使其基因转录受限，导致表达系统的关闭。dsRNA被降解成21个～23个核苷酸长的小片段RNA 时,这些小的RNA分子在细胞核可以诱导组蛋白H3的基因及相应DNA的甲基化。这种序列特异性甲基化的信号与RNA和DNA结合有关。当dsRNA 含有与启动子同源的序列,即可使同源靶启动子序列甲基化,从而使靶启动子失去功能,导致下游基因沉默，则转录不能进行。若甲基化出现在编码区，转录能进行，但在转录后水平上沉默。非致病病毒造成转录水平的基因沉默，最先发现于菜花样花叶病毒上,其35 S启动子转录得到含有胭脂碱合成酶启动子(NOSpro)序列的NOSpro RNA。在转基因烟草中,据报告未腺苷酸化的NOSpro dsRNA可以诱导同源NOSpro DNA的甲基化,并使拷贝在转录水平上反式失活。在链孢霉属,DNA的甲基化可能是异染色质的siRNA介导的组蛋白H3 K9的甲基化,是由H3甲基转移酶催化的。翻译水平上的干扰机制，是通过抑制相应mRNA的翻译,使相应的蛋白质表达受阻。其中起重要作用的是微RNA(micro-RNA，miRNA)，它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体,经Dicer酶作用后形成长约21 nt～25 nt的单链RNA,与相关蛋白结合成RISC复合体。然后识别并结合在mRNA 的3′末端非翻译区上,阻止核糖体与mRNA的结合及核糖体的移行，从而抑制翻译的进行。
转录后水平
目前, 在有关RNAi发生机制的研究中, 转录后水平上的干扰是研究的最多、最清楚的一种机制。其作用大致可分为以下两个阶段。（1）siRNA形成阶段。外源性（如病毒RNA复制的中间体或人工导入的dsRNA）或内源性（如细胞中单链RNA在RdRP 的作用下形成的dsRNA）dsRNA通过Argonaute家族基因编码的蛋白质的识别，进一步诱导dsRNA与Dicer结合。目前已经分离出多个Argonaute家族蛋白,包括线虫中的
RDE-1,果蝇中的AGO-1、AGO-2、Aubergine,锥虫中的TbAGO1和TbPWI1[3],人类细胞中的PI-WI亚族(4 个)和eIF2C/AGO亚族(4个)。dsRNA和Dicer结合后，在ATP 的参与下被Dicer酶（RNase Ⅲ）切成21 nt～23 nt长度的小干扰RNA（small interfering RNA ，siRNA）。Billy E等在小鼠畸胎瘤细胞F19和P19的细胞质提取物中发现长727 bp的dsRNA被剪切为约21 nt～23 nt 片段,即siRNA,其强烈抑制了同源基因的表达。Elbashir S M等从发生沉默的果蝇细胞中分离出siRNA ,可在果蝇胚胎裂解液和果蝇S2细胞中(标准果蝇细胞系)诱发特异性的基因抑制。Dicer切出的siRNA两条链末端均为5′-P和3′-OH，3′末端各有两个突出的核苷酸。切割后的siRNA的一条链与蛋白复合物结合成RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。它由多种蛋白质成分组成,包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性酶等。Zamore P D等报道，无活性RISC存在于胚胎细胞中,并以250 ku分子质量的前体形式存在,在ATP激活下加工成100 ku的RISC,切割底物mRNA。RISC与互补的靶mRNA结合，在酶的催化下切割、降解，从而达到干扰基因表达的作用。（2）扩增循环阶段。RNAi的扩增循环机制，是由Lipardi等通过对果蝇胚胎提取物研究后提出的。如果特异性siRNA与靶mRNA结合后,没有被活性酶切割、降解；而是以siRNA中的一条链为引物, 以靶mRNA为模板, 在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polym erase, RdRp)的作用下, 延伸形成新的dsRNA,被Dicer内切酶或相关酶切割为新的21 nt～23 nt siRNA (即次级siRNA)。Dicer内切酶是Bernstein E等从果蝇中分离出一种能特异性降解dsRNA的核酸酶,属于RNase Ⅲ核酸酶家族成员。Dicer具有以下结构域，即与Argonaute家族同源的PAZ区域、Ⅲ型RNA酶活性区域、dsRNA结合区域以及DEAH/DExH RNA解旋酶活性区，在其进化中高度保守。试验发现,在对dsRNA 分子降解时,2个Dicer能够形成二聚体。每个二聚体包括4个活性中心, 在降解RNA 时其中的2个要失活, 从而使降解过程间隔进行。这个间隔正好为22个核苷酸, 即每隔22个核苷酸Dicer将dsRNA降解一次。然而, Dicer结构上的微小改变将会引起间隔的改变, 所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同。次级siRNA又能再次与相关蛋白质形成RISC, 继续反作用于靶mRNA, 令其切割、降解。这就使作为模板的dsRNA 和作为引物的siRNA都能得到循环扩增, 从而使RNAi具有惊人的潜力和强大的扩增效应。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。此外,RNAi 的扩增效应还可能存在另外两种机制:①Dicer 将长dsRNA 切成初级
siRNA ,这一放大水平取决于dsRNA的长度。②siRNA 在酶的作用下可以多次应用,产生进一步的放大效应。这些扩增机制只是一种推测,是否存在尚需进一步的实验研究确定。
研究策略与方法
siRNA的制备和获得途径包括：化学合成、载体表达、PCR表达框、酶促合成等等。其中每种方法都有自己的优缺点，不过相较而言化学合成方法因高通量、合成快速、容易控制、实验重复性好及可以根据各种要求做相应的修饰，而且在临床应用中在安全性、低副作用、高通量生产等方面的优势受到广泛的关注！
RNAi应用前景
抗病毒感染方面
dsRNA出现在许多病毒(包括单链RNA病毒)感染的细胞内,诱发RNAi,封闭病毒生存和繁殖所必需的基因,产生抗病毒效应。病毒感染后, dsRNA的出现使PKR和2′,5′-寡核苷酸聚合酶大量增加,干扰素合成增加。siRNA可望成为防治病毒的有效工具,尤其是对RNA病毒。Capodici J等将靶向抵抗HIV的siRNA双链转染到培养细胞中后能特异性的抑制HIV感染细胞株及CD4+ T 细胞。同时还发现在T细胞株和原代淋巴细胞中该siRNA 能有效的抑制HIV 的基因表达和增殖。Gag蛋白的表达可阻碍HIV感染细胞。所以应用siRNA可能成为防止HIV-1感染的一种有效手段。Mccaffrey A P等用RNAi来抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的复制，将HBV质粒和能抑制同源HBV基因表达的短发夹结构RNA(shRNA)一起转染入小鼠肝脏,Northern和Southern Blot检测发现HBV RNA和蛋白质表达水平明显降低,HBV表面抗原(HbsAg)在培养细胞中降低94.2%,在小鼠血清中降低84.5%;通过免疫组化检测HBV核心抗原(HbcAg)降低99 %。这提示RNAi 技术为抑制肝炎病毒基因的表达和感染的基因治疗提供了新的手段。Hamasaki B M等构建的siRNA特异性表达载体与HBV病毒DNA 共转染人肝癌细胞Hu H7和Hep G2,降低了RNA 及其复制中间体的水平,并引起HBeAg分泌的下降。还有许多研究人员利用RNAi技术，在流感病毒、脊髓灰质炎病毒等其他病毒的繁殖方面，做出了可喜的成果。
基因治疗和抗肿瘤方面
RNAi作用的高度特异性，有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正
常等位基因功能,所以RNAi在基因治疗上有广阔的应用前景。Zhang L等[14]针对血管内皮细胞生长因子（VEGF）不同亚型设计的特异性siRNA进行RNAi技术体外试验，结果表明可使不同亚型的VEGF发生特异性的抑制,为分析各种VEGF亚型的生物学功能提供了帮助。Elbashir S M等[15]分别用合成的仅21 nt siRNA转染入包括人Hela SS6 在内的几种培养的哺乳动物细胞中,结果发现有21种基因发生沉默,其中13种基因为细胞生长所必需的基因。值得注意的是，用RNAi技术研究的这13种基因的功能表型与过去运用其他方法研究它们的表型是一致的,说明利用RNAi 技术研究基因功能具有快速性和可靠性。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结构,传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一序列的dsRNA分子,只导入一种dsRNA 即可以产生多个基因同时沉默。在体外合成21 nt的siRNA转染入哺乳动物细胞中，能引起特异性基因抑制。转染特异性siRNA 入人胚胎肾细胞系(273细胞)和Hela细胞系后,结果靶mRNA所表达的蛋白质的量比转染前低了90% ,但并未发现非特异性基因抑制及细胞死亡。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF27乳腺癌细胞中一种与细胞增殖分化相关的基因（核转录因子基因Sp21）的异常表达。Scherr M等[16]以引起慢性髓性白血病和bcr-abl阳性急性淋巴细胞白血病的bcr-abl癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA ,并获得了87%的有效抑制率。Shu X等针对鞘氨醇激酶(SPK)的siRNA转染入培养细胞中,阻滞了VEGF诱导的Ras-GTP和磷酸化的细胞外信号调节激酶的积累,同时发现只有针对靶SPK1的siRNA 具有该作用。此研究结果不仅提示了SPK对VEGF兴奋作用的证据,即它对内皮细胞信号传导和肿瘤细胞表达VEGF受体的促进作用，同时也说明通过靶作用于SPK1的siRNA对VEGF的干扰也能间接抑制其新血管的生成及肿瘤的生长。在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低突变,以确定其功能。由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研究。
在寄生虫基因功能研究和抗寄生虫药物方面
研究表明, 多种寄生虫内均存在RNAi的现象,RNAi技术已成功地应用于多种寄生虫和媒介昆虫。迄今,运用RNAi技术已鉴定了多种布氏锥虫基因的功能,如抑制TbPMC1/2 会使钙离子流通速度下降,胞内Ca2 + 浓度上升。TbARL1对哺乳动物体内
虫体的正常发育有重要作用,对TbARL1进行RNAi后可出现虫体形态异常,多鞭毛,运动能力丧失。V ayssie L等用浸泡的方法,将针对γ-微管蛋白(γ-tubulin)siRNA质粒导入溶组织内阿米巴原虫,结果显示γ-微管蛋白位于细胞核内,能介导微管的形成。RNAi 后表型有明显的改变,抑制效应与dsRNA的量有关。Cheng G F等用RNAi技术对日本血吸虫的抱雌沟蛋白(SjGCP)进行实验发现,SjGCP被抑制后影响了雌雄虫的合抱,这种抑制效应也是与dsRNA的量有关。用RNAi研究布氏锥虫的Trys基因，发现Trys被抑制后,T(SH2)和GSP被消耗,GSH积聚,细胞表现出明显的H2O2 的增加,同时伴随着发育和繁殖受损,因此,他们认为Trys可成为抗锥虫药物作用的一个靶点。William等对伊氏锥虫的AT1进行研究时,发现AT1 能控制腺苷的运输,对AT1进行RNAi作用可产生杀灭锥虫的效应。所以，AT1可能成为药物作用的一个靶点。
在自身免疫性疾病方面
通过与Fas和Caspase 8同源的siRNA可抑制Fas和Caspase 8在肝脏中的表达，可治疗由它们介导的自身免疫性肝脏疾病。Zender L等干扰RNA考察对不同鼠急性肝脏衰竭模型的治疗效果。Caspase 8是死亡受体接到凋亡的一个关键酶，采用RNAi 抑制的Caspase 8基因在肝脏中的表达，从而防止Fas介导的凋亡。由于siRNA抑制Caspase 8基因对肝脏的保护，可以减弱Fas抗体或腺病毒表达的Fas配体诱导的急性肝脏衰竭。因此，siRNA最可能用于急性肝脏衰竭。Song E等在小鼠内用RNAi实现对Fas表达的干扰。通过给血管内注射siRNA，用RNA酶保护试验测得Fas-mRNA 减少8倍～10倍，用蛋白质免疫印迹测得Fas蛋白减少至与背景一致，并且该效果在10 d内没有减少的迹象。用Fas-siRNA处理的肝细胞对Fas抗体介导的细胞凋亡和由ConA引起的凋亡产生抗性。用ConA处理前2 d将Fas-siRNA作用于肝脏细胞，可使其不发生坏死和炎性的浸润，并且血清中转氨酶浓度降低。用ConA处理1周后再注射Fas-siRNA，则能阻止小鼠肝细胞纤维化。
其他应用
RNAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DNA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。近来的研究发现,用RNAi技术阻断Nrdpl(为ErbB3 成员)、BRUCE(为一个530×10的膜相关凋亡蛋白抑制因子)、Chkl、Weel和Mytl等进一步解释了细胞凋亡的机制,其中BRUCE通常可抑制凋亡,而Nrdpl在凋亡初始阶段起到特别重要的作用。
结语
RNAi技术的应用,不仅能推进人类后基因组计划的发展,还有可能设计出RNAi 芯片,高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、神经系统研究、生物医学研究等领域,同时用RNAi技术来抑制基因的异常表达,为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了一条新的途径。
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是1998年由Fire等在线虫中发现的一种转录后的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)能特异地抑制或沉默目的基因表达，产生如同目的基因突变的缺陷表型，这种由dsRNA介导的基因阻抑作用被称为RNAi。1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组，在矮牵牛中发现的一种转基因能同时抑制相应的内源基因以及自身表达的基因沉默现象，当时将这种现象称为共抑制。到1994 年，由Cogni等在真菌中发现转录后的基因沉默现象，在野生型粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因albino 1或albino 3时，发现在部分实验中，内源性al 1或al 3基因的表达水平反而减弱，称此现象为基因压制(quelling)。1998年，Fire等在线虫中发现了RNAi现象，并揭示了SuGuo发现正义RNA对基因表达也有抑制作用的原因，认为SuGuo发现的这种现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量的双链RNA，而且dsRNA 能比反义RNA或正义RNA更有效地抑制基因的表达，把由RNA引起的基因表达的抑制称为RNA干涉。 最初普遍认为共抑制、基因压制以及RNAi是机制完全不同的基因抑制现象。但经过科研人员的不断研究，发现在共抑制、真菌中的基因压制以及RNAi现象之间存在着密切的联系。都是由RNA引起的转录后的基因沉默，可能有共同的生物学意义和相似的作用机制。但是共抑制与RNAi并不是完全相同，在植物的共抑制中，dsRNA不仅能引起转录后的基因沉默，而且还能引起转录水平的沉默，其可能机制是dsRNA能引起染色质的重组或甲基化而改变其内源基因的序列。因此，在植物共抑制中还存在RNAi以外的由RNA指导的DNA 甲基化，而引起转录水平抑制的机制。dsRNA能特异地抑制目的基因的表达，其广泛存在各种有机体中，包括线虫、果蝇、涡虫、水螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。 1 RNAi的特征 RNAi是发生在转录后水平的基因沉默。 dsRNA具有很高的特异性，能特异地将与其同源的mRNA降解。Andrew在植物中用3种转基因诱导的转录后的基因沉默(PTGS)都检测到有约25 nt(nucleotide)长的siRNA(short interference RNA)。Shi Chenyang等从已转染dsRNA的未分化的胚胎干细胞、卵母细胞以及老鼠胚胎细胞的细胞质提取物中都发现有21～23 nt长的siRNA。这些siRNA可能具有指导核酸酶特异地识别靶mRNA 而将其降解的功能，21～23 nt以下的片段还没有发现，由于这些片段不稳定，易被胞内其他核酸酶降解。 极低浓度的dsRNA就能完全抑制基因的表达。这可能由于RNA存在复制或由于dsRNA 具有很强的催化功能。 dsRNA抑制效应具有传递性。Timmons等用含目的基因表达dsRNA载体大肠杆菌喂养线虫，RNA从肠中吸收，但在体细胞及生殖细胞中都有分布表达。此外，RNAi不仅发生在亲代动物本身，其子代伴随基因表达过程也产生了强烈而特异的抑制效应。细胞的这种抑制能力还能在细胞与细胞之间通过胞间连丝传递，甚至可以通过植物的维管组织在整个植物体中传递。Jorgenese等将有共抑制现象的植物作为砧木，没有抑制现象的植物作为接穗，一段时间以后在接穗中产生了共抑制现象。说明有某种信号分子通过植物的维管系统进行传递，由于这种系统获得的沉默具有序列特异性的特点，这种信号分子可能是一种RNA与蛋白质的复合体。
RNA干扰作用原理及其应用 【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III 启动子 【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded
RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug. 【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced silencing complex(RISC) Argonaute pol III 1 背景 20 多年前，在对矮牵牛进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。显然，在理论上，通过siRNA几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而RNAi受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，RNAi技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。可见，RNAi的应用非常广泛，具有巨大的市场发展空间。但是，由于RNAi现象刚被发现不久，仅仅才14年的时间，无论国外还是国内，目前都缺乏有效的siRNA载体，这大大制约了RNAi的应用，包括实验研究和药物开发。目前市场上主流的siRNA转染试剂是脂质体类的转染试剂，它能将siRNA转染入多种体外培养的细胞株，但原代细胞、悬浮细胞的转染效果不是很好。由于它是脂质体类的转染试剂，因而对培养细胞有一定毒性。而英格恩生物独辟蹊径，转染载体的材料不是用传统的脂质体，而是纳米聚合物材料。这种材料对细胞几乎没有毒性，转染效率在多数细胞株都可达到90%以上，在很多原代细胞中，转染效果也比较好。更为难得的是，该公司的体内RNA转染试剂Entranster-in vivo，和核酸混合后，便可注射进动物体内，完成动物体内RNA干扰实验，十分便捷，是动物体内RNA干扰实验的新创举。
RNA干扰（RNAi）实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RN A(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为R NA干扰（RNAi）。一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个A TP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer 的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： https://www.doczj.com/doc/9c11840880.html,/business/products/order2.htm https://www.doczj.com/doc/9c11840880.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html https://www.doczj.com/doc/9c11840880.html,/Stu/shilin/rnai.html https://www.doczj.com/doc/9c11840880.html,/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3
什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——
?综述?RNA干涉(RNAi)及其应用 蔡佩玲,牟林春,李新枝 (成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室 四川成都 610083) 【中图分类号】 Q752 【文献标识码】 A 基因沉默(gene silencing)是指生物体内的特定基因由于种种原因不表达的遗传现象,它有两方面的功能:一方面,它是生物遗传操作创造新的遗传修饰生物(genetically modified organisms)的障碍;另一方面,它是植物抵御外来核酸入侵(如病毒)的一种反应,为植物抗病毒的遗传育种提供了具有实用价值的策略[1]。近年来,不同的研究领域和生物中发现了许多新的使基因关闭或者沉默的类型,并赋予其不同的名称:植物中称为RNA共抑制(co2supp ression)[2],真菌中叫RNA压制(RNA quelling)[3],动物中则为RNA干涉(RNA interference,RNAi)[4]。 RNAi现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double2 st rand RNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,使相应基因沉默,从而产生相应的功能表型缺失[5]。RNAi现象广泛存在于生物界,从低等原核生物到植物、真菌、锥虫、涡虫、囊虫、水螅、果蝇、线虫、斑马鱼和老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中都发现了此现象[6],只是机制也更为复杂,下面就RNAi的发现、作用原理及其应用等进行综述。 1 RNAi现象的发现及其生物学意义 111 RNAi现象的发现 20世纪20年代,人们发现植物在受到野生型病毒感染以后,能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力[7]。十多年前,科学家在努力进行生物遗传改良时,发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。早期由美国Jorgensen和荷兰Mol带领的两个研究团体试图通过增加色素合成基因的拷贝数来创造一种紫色更深的矮牵牛,但结果出人意料,一些转基因植株部分或完全开出白花,这表明色素合成途径被关闭而不是被加强。事实上,不仅仅该转入的基因不表达,而且植株中所有的色素合成基因都失活。他们将这一现象称之为共抑制[8]。 几年后,英国植物研究人员Ruiz等在进行抗病毒的植物遗传工程研究时也发现了类似现象。他们将X病毒繁殖所必需的编码复制酶的基因转入到西红柿中,结果发现一些植株表现为抗病毒,另一些则表现为不抗病毒。进一步研究表明,抗病毒的植株产生非常少的复制酶,而染病的植株则大量表达X病毒复制酶,抗病植株不仅能使转入的基因沉默而且还能使X病毒的复制酶基因沉默。意大利的Cogoni 将类胡萝卜素合成所需的基因转入到粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中,结果30%的转化细胞自身基因失活。他们称这种现象为压制[1]。 Guo等[9]在研究建立线虫胚胎极性的par I基因作用时,将par I基因的正义和反义RNA链分别注射到野生型线虫卵巢中,均发现50%子代胚胎致死。一般认为反义RNA可与体内自身的mRNA结合,抑制基因的表达,为什么正义RNA也会产生与反义RNA类似的遗传效应呢?1998年,Fire等[4]将unc22、fem1、hlh1、myo3、gfp等基因的正义RNA、反义RNA、dsRNA分别注射到线虫中。他们惊奇地发现:dsRNA所引起的基因沉默效应要比单个正义RNA或者反义RNA都要强的多。且注射入到线虫的性腺以后,在其第一子代中也诱导出同样基因的抑制现象,说明RNAi在原核生物中具有可遗传性[4,5]。他们将这种基因沉默现象称为RNA干涉。 Kennredell等进一步研究发现,用dsRNA注射果蝇胚胎是一种抑制特定基因表达的有效方式[1]。为了解RNAi的特异性,Timmons等[10]将与unc22无关的dsRNA和unc22ssRNA一起注射到线虫体内,但并未发现非同源的dsRNA能够增强ssRNA 对unc22的干涉效应。同时他们还发现:与不同的内含子和启动子序列相对应的dsRNA片段并不产生明显的干涉效应;大多数基因的dsRNA注入可以明显减少或消除内源的mRNA转录本;dsRNA介导的干涉表现为惊人的细胞穿透力,可以传递给其他组织及后代。Tabara等[11]也发现基因沉默不仅仅局限在开始的细胞,还在动物体的各个部分激发RNAi,同时可传递给后代[1,6]。 过去认为哺乳动物细胞中不存在RNAi现象,因为较长的dsRNA在哺乳动物细胞中能诱导干扰素(IFN)生成,并激活STA T途径参与的P KR(dsRNA 依赖性激酶)的转录,同时dsRNA本身与P KR结合
简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细 胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致 基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有 传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi) RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 机理 siRNA RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补 与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的 小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干 扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与 双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复 合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引 导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA， 引发靶mRNA的特异性分解。 迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具 有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族 蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴 定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须 的因子有EGO1。这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也 存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这 一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非 必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。 microRNA 在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引 起RNA干扰现象。microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结
RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现
象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作