第七章酶分子定向进化
酶的蛋白质工程
蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子进行设计和改造。
蛋白质的功能基础
蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。
酶的蛋白质工程
现在对天然酶性质的改造主要包括以下几个方面：
1）改变酶的动力学性质以改变其催化效率；
2）取代活性部位的氨基酸残基，研究其对整个酶分子功能及稳定性的影响；
3）提高酶在非水溶剂中的稳定性和活性，目前主要是针对极性有机溶剂；
4）增强酶的专一性，减少副反应；
5）改变酶的最适温度和最适pH值；
6）增强酶抗氧化和抗水解能力，延长体内半衰期；
酶的蛋白质工程
原则上任何有功能的酶都可用蛋白质工程加以改造，但实际上选择目标时需考虑几个因素：1）有没有测定空间结构或者有没有已知结构的同源蛋白质；
2）结构功能关系是否明确；
3）所选对象有何经济效益和社会效益；
4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。
蛋白质结构的测定
运用X-射线衍射测定蛋白质晶体结构
核磁共振测定溶液中蛋白质三维结构
同时运用几种结构测定方法获取蛋白质结构的数据
建立数据库
蛋白质结构测定
一级结构测定：
直接法
间接法
三级结构测定：
X-射线晶体衍射
核磁共振(NMR)光谱
X-射线衍射技术：
蛋白质工程的主要手段
蛋白质的分子设计
蛋白质的分子设计就是为将要改造的蛋白质提供设计方案。
对蛋白质的分子设计分为三类：
（1）小改——少数残基的替换；
（2）中改——分子剪裁；
（3）大改——全新设计。
酶的蛋白质工程
定点突变
酶的定向进化
酶的定向进化
属于蛋白质的非理性设计
不需事先了解酶的空间结构和催化机制
人为地创造的进化条件，模拟自然进化机制(随机突变、基因重组和自然选择)
在体外改造酶基因
定向选择(或筛选)出所需性质的突变酶。
定向进化的原理
基本规则是“获取所筛选的突变体”。
定向进化=随机突变+选择。
通过随机突变和（或）基因体外重组创造基因多样性
导入适当载体后构建突变文库
通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子
第一节酶基因的体外随机扩增
酶突变基因获得主要采用随机诱变和基因体外重组。
随机诱变可以通过易错聚合酶链式反应（error-prone PCR）、化学诱变、紫外辐射、有毒核苷插入法等来完成。
基因体外重组可以使用：DNA改组(DNA shuffling)、随机引导重组、交错延伸法、随机延伸诱变等多种方法。
一、易错PCR
从单一基因出发，通过改变PCR反应条件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。
条件：
增加Mg2＋（稳定非互补的碱基对）
添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性）
4种底物的浓度不平衡
连续易错PCR
将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。
不足之处
遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化；
靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；
中性突变较多；
较为耗时、费力；
获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。
二、DNA改组技术(DNA shuffling)
又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。
通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。
优点
可以利用现存的有利突变，快速积累不同的有利突变；
对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十kb；
从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；
比随机突变显著提高了良性突变的概率，1%→13%；
可伴随点突变同时发生。
改进——1、交错延伸重组
改进——2、随机引物体外重组法
第二节酶突变基因的定向选择
定义：是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。
过程：突变基因与适宜的载体进行重组
组装形成突变基因文库（细胞或噬菌体）
通过高通量筛选技术获得目的基因
目的基因表达获得所需进化酶
突变基因文库的构建
质量要求：包容性、完整性
过程：
选择合适的载体
（质粒、噬菌体、黏粒、噬菌粒）
基因重组
（DNA连接酶连接突变基因和载体DNA）
组装突变基因文库
（转入受体细胞或包装成有感染活性的重
组噬菌体）
突变基因的筛选
根据定向进化的目的设定定性选择的环境条件
高通量筛选技术
特点：通量大、效率高
（短时间内简便地对大量突变进行判断）
方法：平板筛选法
荧光筛选法
噬菌体表面展示法
细胞表面展示法
核糖体表面展示法
定向进化示意图
随机突变+定向选择＝目标突变体
定向进化的选择策略
选择特定方向的突变限定了进化趋势，加快了酶在某一方向的进化速度。
筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。
选择合适高通量的筛选体系。
酶分子定向进化的作用
提高酶的催化效率
增强酶的稳定性
改变酶的底物特异性
体外定向进化的意义
蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶定向进化的基本先决条件。属于蛋白质的非合理设计，不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，体外改造酶基因，定向选择出所需性质的突变酶。
极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。
酶的定向进化 蒋本国范圣第刘宝全 (大连民族学院生物工程系大连 116600) 摘要酶的定向进化是发展迅速的重要生物工程技术之一耐酸碱性 底物特异性使酶更适于工业应用的重要途径 本文综述了酶的定向进化的意义 并综述了在最近几年内 关键词酶定向进化性质改进 Some Progresses of the Directed Enzyme Evolution Jiang Benguo, Fan Shengdi, Liu Baoquan (Dalian Nationalities University, Dalian 116600) Abstract The directed enzyme evolution is one of the important bioengineering technologies that was developed rapidly, it is also the necessary way through which the traits of enzymes ????′??ˉó?óú1¤òμéú2ú ±?è??áòy·￠ò?3?D?μ?±???[1]酶的定向进化是为满足这种需求而改变酶的结构和性质的有效途径 近年发展起来的酶定向进化技术使人们可能开发出天然酶蛋白分子不具备的选择特殊环境极地碱湖及盐湖来源的酶 可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要[4] 1 酶定向进化的策略与途径 蒋本国男副教授 2003-03-04收稿
1.1 对酶实行定向进化的重要意义 天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非自然条件的限制 经常不能很好地适应环境的转变不稳定性以及苛刻的酶促反应条件 酶在活细胞的复杂条件下 相反 在非水溶液中是活性的(这一点可能在绝大多数生物环境中是不需要的)以及酶能够接受不同的底物(在自然界中不存在的底物)??·t?aD?2?×? μ?ó?×?è????ˉ?à±è é??áê?êy?ü[7] ò22?′??úò?????±ê??·?×ó?¨?ò???ˉêμ?éóDì??¨μ? ??±ê,要求通过简捷的途径重组等手段得到比较理想的酶功能[8] ????±?μ??ùòò??????è??êá￡ ??????μ?????±í′??ú??í¨á?é????D??±eó?ì??? ?¨μ?í?±?×?1980年起用于产生具有增进性质的酶[9]?¤2aoí??è?ì?êaμ?°±?ù?áμ÷????μ?èy???á11 最适温度底物专一性 导致具有理想特性的酶的表达 大大强化了基因调控的能力 再经筛选获得所需的突变株改变反应体系中的Mg2+和dNTPs浓度便可有效的控制所引入的点突变率 然后多重这样的小步幅取代变异(每次1??μ?àí??μ???1|?ü[11]ò?ê??àμ±?yèyê?é? ?°μ??ùòò????ì??ì(少于800碱基对) 另一种途径是在基因的相对小的区域中定向高水平的随机变异[12] ?¨?òμ?±?òì?é?ü2úéúD?μ?°±?ù?áè?′ú??×éo? òò?aD?2?·ùè?′ú?D?3D??D??2ú???é?ü2￠2?ê?óDà?μ? [13] ?ò?ò×????? ???ˉμ???òì?ùòò×é ?úDòáD????é?±í??3?oü′óμ????? DNA随机重组称作有性PCR[10] 但是与体外方法得到的结果相比 其它几种方法如随机前体重组(RPR)[17] 随机插入与删除(RID)[19]增长剪截(ITCHY)和DNA
摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略. 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶. 短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径. 关键词蛋白质工程模拟定向进化 ------------------------------------------------------------- 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力. ------------------------------------------------------------- 1 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”〔2〕. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的. ------------------------------------------------------------- 2 随机突变的策略 2.1 易错PCR 易错PCR（error-prone PCR）〔3，4〕是指在扩增目的基因的同时引入
第七章酶分子定向进化 酶的蛋白质工程 蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子进行设计和改造。 蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。 酶的蛋白质工程 现在对天然酶性质的改造主要包括以下几个方面： 1）改变酶的动力学性质以改变其催化效率； 2）取代活性部位的氨基酸残基，研究其对整个酶分子功能及稳定性的影响； 3）提高酶在非水溶剂中的稳定性和活性，目前主要是针对极性有机溶剂； 4）增强酶的专一性，减少副反应； 5）改变酶的最适温度和最适pH值； 6）增强酶抗氧化和抗水解能力，延长体内半衰期； 酶的蛋白质工程 原则上任何有功能的酶都可用蛋白质工程加以改造，但实际上选择目标时需考虑几个因素：1）有没有测定空间结构或者有没有已知结构的同源蛋白质； 2）结构功能关系是否明确； 3）所选对象有何经济效益和社会效益； 4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。 蛋白质结构的测定 运用X-射线衍射测定蛋白质晶体结构 核磁共振测定溶液中蛋白质三维结构 同时运用几种结构测定方法获取蛋白质结构的数据 建立数据库 蛋白质结构测定 一级结构测定： 直接法 间接法 三级结构测定： X-射线晶体衍射 核磁共振(NMR)光谱 X-射线衍射技术： 蛋白质工程的主要手段 蛋白质的分子设计 蛋白质的分子设计就是为将要改造的蛋白质提供设计方案。 对蛋白质的分子设计分为三类： （1）小改——少数残基的替换； （2）中改——分子剪裁； （3）大改——全新设计。 酶的蛋白质工程 定点突变 酶的定向进化 酶的定向进化
第八章酶分子定向进化 一、酶分子定向进化的目的 为什么要研究酶的定向进化? 天然酶的局限性 在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低 存在产物抑制 稳定性差，活性低，催化效率低 有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质 现代生物工程的要求 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料 利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。 二、酶分子的改造 酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、晶体 学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶 分子的理性设计。 酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过 随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶 分子的非理性设计。 问题：定向进化是不是定点突变？ 澄清一个事实：定向进化不是定点突变 定向进化：突变筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应 用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR 技术为基础的。 什么是酶的定向进化? 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的
突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特 性的进化酶。 酶分子定向进化研究的历史 萌芽阶段：20 世纪60 年代Sol Spiegelman 利用RNA 噬菌体Q 巧妙地在体外模拟了自然进化的过程 奠基阶段：20 世纪80 年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶 分子的新思想 发展阶段：20 世纪末期易错PCR 和DNA 改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟 如何使酶分子定向进化? 定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选 三、酶分子定向进化的基本策略和方法 定向进化的基本策略 一般而言，定向的分子进化有三种方法： （1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含1-2 有益 突变的积累。 （2）随机突变继之筛选两个或更多的改进的突变体重组，使有益突变组合并消 除有害突变。 （3）同源基因顺序重组(族改组) 产生功能嵌合蛋白质，并且允许一步完成许多 有益突变的组合，包括非累加突变。 定向进化的两个重要环节 多样性基因文库的构建 文库中所期望的进化酶的挑选 定向进化的基本过程 酶定向进化通常分3步进行： 通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性 导入适当载体后构建突变文库 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到 预期性状的酶 定向进化的基本方法 无性进化 易错PCR、定点饱和突变、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变 和随机寡核苷酸突变等 有性进化 DNA 改组（DNA shuffling）、外显子改组（exon shuffling）、随机引物体外重组法（RPR）、交错延伸法（StEP）等。 易错PCR(error-prone PCR)技术为代表的无性进化
阅读下面的文字，完成各题。 材料一 “原来在实验室改变基因是个缓慢的过程，自从有了阿诺德的酶类定向进化技术，只需几小时就可以在试管里面实现。”中科院上海有机化学所研究员周佳海告诉记者。 据介绍，阿诺德发展了这技术，她大胆地改变了聚合酶链式反应条件，这样基因在扩增的过程中就会产生随机突变，从而改变了氨基酸，蛋白质也就改变了。这就相当于在实验室里可以人工快速地进化蛋白质。这一工作有何意义呢？“就拿洗衣粉来说， 以前去除污渍的蛋白酶，活性比较低，可能需要在热水下使用，现在催化效率提高了，只需少量就可以发挥作用，而且在冷水条件下就可以了。”周佳海说，过去，很多生物体内的天然催化剂难以进入工业应用，定向进化技术通过改变其活性、热稳定性、有机溶剂耐受性使其可以广泛使用， “也许是因为涉猎了好几个不同学科，她比较敢于想，”周佳海说，“阿诺德本科时学的是航空航天，博士时学的是化学工程，博士后阶段学的是生物工程，她后来在加州理工学院工作，主攻方向是生物技术的进化，很快就晋升到了教授。” (摘编自《用化学的办法解开生物学难题》，2018年10月4.日《解放日报》) 材料二 酶分子定向进化技术是酶催化领城上游核心技术之一。生物催化，其实并不是新鲜事物，和人工智能一样，它其实也已经经历了三次浪潮。第一次浪潮，大概发生在一个世纪前，科学家发现活体细胞的某些成分可以用于化学转化，但这个时期还停留在实验室阶段，算是生物催化的萌芽阶段。第二次浪潮，发生在二十世纪八九十年代，蛋白质工程兴起，扩宽了生物酶的底物范围，使得生物催化的领域拓宽到非天然的医药中间体和精细化工领城。但这个时期还主要处于小试规模，没有形成大规模工业化生产。第三次浪潮，发生在二十世纪九十年代中后期，也正是这次诺贝尔化学奖获奖者之一的阿诺德教授等发明的酶定向进化技术，这一技术极大地改变了生物酶催化剂的蛋白质工程改造效率。近几年，酶分子定向进化技术已经从原来的1.0时代进入了2.0时代相信随着酶定向进化技术获得诺奖，生物催化领城将进一步得到推动，进入人们的视野。 (摘編自《诺贝尔化学奖：酶分子定向进化》，2018年10月5日“医学顾事”微信公众号)材料三 自从地球上的生命出现以来，酶的自然进化就一直存在。为了提高机体对环境的适应能力，基因发生改变，蛋白质逐渐进化，几千年来，人们通过选择具有所需特性的有机体来繁殖动
碱性磷酸酶的定向进化设计方案 酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略，是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。与传统的理性设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，产生基因多样性，并结合定向筛选（或选择）技术，获得具有某些预期特征的改构酶。 方案：在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 DNA改组（DNA shuffling）又称有性PCR(sexual PCR)，原理。该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过DNA改组, 不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体。 外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。 通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。 技术路线：
酶的定向进化 关键词：酶氨基酸蛋白质试剂标准物质北京标准物质网 一、概念及一般步骤 定点诱变方法在蛋白质工程中起到了至关重要的作用。然而，定点诱变只能对天然蛋白质序列中的部分单独氨基酸进行替换或修改，因而对其生物活性提高的作用有限。同时，该方法仅适用于三维结构明确、结构与功能的相互关系也清楚的蛋白质，应用空间相对有限。这些定向诱变技术本身的局限性制约了其更为快速的发展和更广泛的应用。 酶的定向进化技术，则是在不了解酶的空间结构和作用机制的情况下，通过人为创造特殊条件模拟自然进化过程，在体外使其基因发生大量变异，并定向筛选获得具有特定性质或功能的突变酶分子。相对于传统的定点诱变蛋白质理性设计方法，定向进化被称为蛋白质的非理性设计方法。 酶的定向进化技术一般步骤为：选择已经存在的酶分子作为进化起点，确立目标酶的性质或功能；通过随机突变和基因体外重组创建基因突变文库；确定目标酶分子的筛选方法；选择结果相对最好的突变株。通常，酶的定向进化是一个循环递进的过程，以一次循环所得的最佳突变株作为下一个突变循环起点，逐渐累积正突变直至获得期望的目标酶分子。 酶的定向进化技术是一种更接近自然进化方式的蛋白质工程新策略，使原本在自然界中需要数千万年的进化过程缩短至几个月内完成，并能定向得到符合需要的新型酶分子，大大加速了蛋白质工程的发展。目前，蛋白质的合理设计策略与酶分子的定向进化方法互相补充，为研究蛋白质的结构和功能开辟了新的道路，拓宽了蛋白质工程的研究范围和应用前景。 二、定向进化的研究方法 定向进化一般包括随机诱变、体外重组、筛选鉴定三部分，每一部分都有多种研究技术。 1.随机诱变易错PCR技术是通过改变传统PCR方法的反应条件，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，进而构建突变基因库。该方法多用于较小的基因片段，其遗传变化只发生在单一分子内部，属无性进化范畴。由于在突变过程中有益突变的概率很低，因此该方法较为费力耗时。一般易错PCR过程均需要连续反复进行使得每一次的正向突变累积直至产生重要的有益突变。