综述
收稿日期 2009-01-18; 修回日期 2009-07-10
作者简介 李艳艳(1977-),女,籍贯内蒙古赤峰,检验技师,研究方向,临床免疫。
乙型肝炎病毒感染分子诊断的研究进展
Research progress in the hepatitis B virus infection with molecular diagnosis 李艳艳,薛凤凤综述,孟祥红审校
(解放军总医院第二附属医院检验科,北京100091)
关键词:乙型肝炎病毒;DNA 检测;临床应用
文章编号 1008-5041(2009)10-0900-04 中图分类号 R512 6 文献标识码 B
乙型肝炎病毒(HBV )感染是一个严重的全球问题,据估计全球大约有20亿人曾经感染乙肝病毒,慢性HBV 感染者约3 5亿~4亿人,每年有50万~120万人死于HBV 感染。我国是乙型肝炎的高发区,每年约有10%~20%的急性乙肝将转成慢性肝炎,肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健康,急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点。1 HBV 的分子生物学特性
HBV 的基因组是已知DNA 病毒中最小的,仅含3200bp,组成独特的带有部分单链区的双链DN A 环状模式。长链为负链,几乎形成完整的环,其5 末端有蛋白与之共价相连。短链为正链,长度因毒株的不同而变化较大,其5 末端有一段戴帽的寡核苷酸与之相连。因此长链与短链的5 端均不能被多聚核苷酸酶磷酸化。长链和短链的5 端的位置是固定的,短链可长可短。尽管短链的3
端
长度有不同,但通过正、负链的5 端的粘性末端互补,使HBV 基因组DNA 形成部分环形结构。在正、负链的5
端
的互补区的两侧各有由11个核苷酸构成的同向重复,分别称为DR1和DR2,其中DR1在负链的5 端,DR2在正链的5 端。
HBV 基因组非常独特,正链及负链DNA 可分别编码,所有顺式调控序列均位于编码区内,无内含子。HBV DNA 长链含有分别编码结构蛋白(pre -S 、S 和核心蛋白)以及复制蛋白(聚合酶和X 蛋白)的4个ORF ,编码区有广泛的重叠以充分扩大其编码容量。HBV 基因组高度压缩,重复利用,使有限基因得到充分的利用。这种基因组的结构特点在其他生物极为罕见。
目前根据乙型肝炎病毒HBV 全核苷酸序列的差异,可将HBV 分为A 、B 、C 、D 、E 、F 、G 、H8个基因型,基因型反映了HBV 自然感染过程中的变异特点,是病毒变异进化的结果。近年研究表明,HBV 基因型对HBV 感染者自然病程,疾病严重程度,HBV e 抗原(HBeAg )血清转换率,前C 区/C 变异以及抗病毒疗效均有一定影响。2 HBV D NA 检测
HBV 感染的病原学诊断目前主要依靠免疫血清学检测HBV 的血清学标志物和分子生物学方法检测HBV 核酸。免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手段,常用的方法是间接EL ISA,目前我国HBV 检测采用的第三代EL ISA 试剂由多种病毒抗原组合匹配,具有较好的灵敏性和特异性,但其在病毒感染的窗口期不能检测到抗体,这在很大程度上限制了EL ISA 检测的准确性,不能有效的控制病毒的传播,因而,发展新的诊断HBV 感染主要依赖分子生物学技术对病毒DNA 的检测。2 1 PCR 基因分型法
[1]
是一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基本分型(BCD )的方法,该方法通过大量分析已分型的HBV 基因组序列,寻找出HBV 各基因型的型特异性硷基的分布规律,设计型特异性的引物和探针,利用已知全序列HBV 建立荧光PCR 的基因分型方法,结果显示其与基因组分型完全一致,利用大量随机临床标本摸索的最佳反应条件为94 ,1min;94 ,10s;60 ,30s,40个循环。与PCR-RF LP 相比,分型结果一致性在84 0%;与S 基因测序分型相比,一致性为96 2%。荧光PCR 是目前最灵敏的检测方法之一,检测极限可达到100copise/ml 的DNA 浓度,以常规PCR 为基础的分型方法常常需要进行2次PCR 。荧光P CR 分型实验仅需要DN A 抽取和1次荧光PCR 就可以了,免除第2次P CR 、杂交、洗涤、显色等传统方法的诸多步骤。利用荧光PCR 法检测HBV 基因
型基本不出现混合型,下一步有必要摸索混合感染或嵌合感染的分型反应条件和体系,目前本研究实现了在1个反应管对应一型引物探针组合的检测,为更加简便地进行基因分型,下一步将研究一管多荧光检测以及其他HBV基因型的检测。荧光PCR用于HBV DNA定量检测已非常熟悉,将基因分型与HBV DN A定量作融合检测亦有望会大大地方便临床应用。
2 2 逆向斑点杂交法
其原理就是将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。本实验[2]利用该技术在同一张尼龙膜上检测HBV基因型及Y M DD变异,经济实惠、方便快捷,且易于开展。但由于该设计源于DNA芯片技术,而DNA芯片的基本原理就是逆向斑点杂交。众所周知,DNA芯片技术在研究各种疾病诊断、基因治疗和新药研发等领域中得到了广泛应用,但该技术所需仪器设备和各项条件在普通实验室均无法获得,故虽有产品问世,普及到临床应用尚待时日。
2 3 FeO/A u纳米颗粒探针法
近年来,通过纳米表面结合寡核苷酸构成纳米颗粒基因探针,用于检测靶脱氧核糖核酸。其原理是利用DN A碱基严格互补配对的特性设计的,主要应用于分子的组装。M irkin等[3]运用金纳米颗粒基因探针与合成靶杂交,形成透射镜下明显的聚集体,可判断合成靶存在与否。Elg han-i an等[4]使用双探针夹心杂交、纳米颗粒放大、显色技术,可检测合成靶DAN。Wang等[5]制备Au纳米颗粒乙型肝炎病毒DNA基因探针,在玻片上目视化检测HBV DNA的多聚酶链反应产物。研究表明,在成本较玻片大为降低的尼龙膜上,可检出低至109copies/ml合成靶DN A,可目视化检出乙肝患者血清中HBV DNA的PCR产物[5]。除Au外,多种纳米材料已被开发出来,其中,F EO(核)/A U(壳)纳米颗粒的制备及其在医学诊断中的应用引起了科技工作者的关注。其方法是分别用枸橼酸还原金氯酸法、化学共沉淀法制备AU、FEO纳米颗粒,二法结合制备F EO (核)/AU(壳)纳米颗粒[6]。通过金硫共价键,将烷氢硫醇修饰的寡核苷酸结合在纳米FEO(核)/AU(壳)颗粒上,制备纳米颗粒HBV DNA基因探针。用荧光标记法检测纳米颗粒探针表面核苷酸的覆盖率和与其互补的寡核苷酸的杂交效率及在纳米颗粒基因探针液相检测体系中加入HBV DNA,透射电镜下观察,该纳米颗粒粒径均匀,为(15 5)nm,水相分散好,具有磁性,其制备的基因探针表面寡核苷酸的最大覆盖率为(120 8)条,最大杂交效为(14 2)%,斑点杂交可检出低至1010copies/ml合成靶DNA,可目视化检出乙肝患者血清中HBV DN A的PCR的产物。在液相检测体系中加入HBV DNA,透射电镜观察到纳米颗粒组装成大的网状结构的聚集体。该探针主要用于尼龙膜上和液相中的杂交反应来检测DN A:(1)纳米颗粒基因探针在尼龙膜上的杂交反应:用捕捉链和纳米颗粒基因探针构成双探针,与待检靶杂交,在尼龙膜上形成杂交聚集体,加入银离子-对苯二酚液染色,形成棕色点,可目视化检出DNA。此法检出合成靶DN A的最小量1010 copies/ml为,可目视化检出乙肝患者血清中HBV DNA的PCR的产物。本法采用纳米颗粒标记寡核苷酸作为检测探针,替代目前常用的标记物,利用纳米颗粒聚集后显色进行检测。纳米颗粒聚集的量达到一定程度,即可出现肉眼可见的红色:A G染色后杂交点呈现棕色,可放大检测信号100倍,与其他标记物相比,使用纳米颗粒标记物进行斑点杂交耗时短,可于当天获得结果。本法是对传统斑点杂交法的改进,明显提高了敏感性,但由于斑点较大而且尺寸有时变化,故不易进行精确定量,尽管如此,仍可用其反应待检核酸的浓度。此方法具有特异性好、结果直接、简单、价廉的优点,不需要配套昂贵的仪器,可望在许多领域,尤其是在许多基因检测芯片上有潜在的应用价值。(2)纳米颗粒基因探针在液相中的杂交反应:纳米颗粒基因探针与合成靶杂交,透射电镜下可见明显的纳米颗粒聚集,敏感性较尼龙法高,并且特异性好。但是液相中杂交现象不直观,结果需要通过透射电镜观察,透射电镜价格昂贵,使用尚未普及。此外,液相中杂交受外界影响多,如某些未形成交叉连接的互补靶N DA也能引起杂交聚集体的形成[7],这可能是由于纳米颗粒之间的London-van der Wals 力作用所致。
2 4 错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法
该法利用错配PCR的原理扩增HBV前C区长194bp, C启动子区长184bp的基因片段,扩增产物分别经限制性内切酶Bsu361,Bc1I酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,建立检测HBV前CA1896,BCPT1762/A1764双变异的方法,对127份HBsA g、HBV DNA阳性的HBV 感染者血清进行分析,酶切同时测序,两份标本用克隆测序以验证酶切鉴定变异珠、野珠混合感染的准确性。对酶切、测序两种方法鉴定结果的比较分析发现在检测单纯野毒珠或单纯变异珠感染方面,两种方法的结果符合率为100%。在检测野毒珠、变异珠混合感染方面,PCR产物直接测序存在一定缺陷,它只能把其中的优势珠表达出来。而酶切法可把野毒珠、变异珠同时区分出来。此外本法仅需合成两对引物,只经过一轮PCR扩增,从模板DNA提取到酶切鉴定可在9h内完成。操作简便,一步两酶切可检测绝大数的标本,图谱简明,能同时区分HBV前C A1896、
BCP/A1764野毒珠和变异珠混合感染。适合较大样本量的分析,可用于流行病学调查及临床筛查[8]。
2 5 乙型肝炎病毒DN A等温扩增技术
HBV的病毒载量与感染状态密切相关,寻求快速、简便、灵敏、特异的定量手段是对HBV早期诊断、病程监控及流行病学调查的需求。本研究在NotomiT的环介导等温扩增(L AM P)[9]技术基础上,建立起HBV DNA等温扩增的定量检测体系。2001年,NIH颁布的指南中推荐使用HBV核酸检测,现多种检测方法中,Digene的Hybrid Cap-ture2检测范围在1 4 105~1 7 109拷贝/ml,Chiron的Bdnna1 0范围推荐在7 105~5 109拷贝/ml。Abbott的G enostics liquid hybridization最低检出下限为4 25 106拷贝/ml。在非活动性HBV携带者中,DNA载量通常<105拷贝/ml[10]。上述方法检测灵敏度的过低不能反映低拷贝患者感染的消长情况。Roche COBA S Amplicor HBV Mo nitor 试最低检出下限能测出200拷贝/ml,但其线性范围在2 102~2 105拷贝/ml之间[11]。此次等温扩增的最低检出下限为40拷贝/ml,相当于HBV DN A基因组1拷贝量[12]。线性范围在103~107拷贝/ml之间均反应良好,预示着此方法对于低拷贝或高拷贝HBV感染者均适用。茎环结构是核酸天然存在的美妙现象,它与DNA、RNA、蛋白质的相互作用对于信号传递、细胞代谢等具有重要的调节作用。热动力学分析茎环探针较线性探针具更明显的特异性。现代探针诸如分子信标、蝎形探针更多的借助于核酸茎环结构的设计。LAM P中,靶序列采用了4套引物对的设计及茎环结构的考虑,保证了扩增序列的特异性。Bst等链置换聚合酶的等温条件及核酸茎环结构中间体构想的结合能更好的模拟天然复制形态,P CR扩增核酸以2n增加,而L AM P反应初期核酸以6n倍量递增,扩增效率的显著增强使反应时间更快,灵敏度更高。同时,等温反应对于热循环仪等因素也不再受限制,从内在上保证了反应的稳定性。
2 6 实时荧光PCR技术
本研究采用T aqM an探针技术和选择性引物的实时荧光PCR进行YM DD变异检测的实验方法。核苷类似物拉米夫定作用于HBV多聚酶逆转录酶的活性部位YM DD基原抗病毒效果显著,但长期使用对拉米夫定产生耐药。随着拉米夫定耐药珠的出现,国内外研究者都在寻找有效的检测方法。目前耐药突变的检测方法中一般认为测序法是检测YM DD变异的金标准,但测序成本高,过程复杂,需要昂贵的仪器设备,从而限制了其临床应用。基因芯片技术目前尚未成熟,仍需进一步研究。目前临床用得最多的是R FL P[13],但由于病毒变异快速,即使有轻微的碱基变化,就会出现R FL P酶切位点的变化,出现新的酶切位点或原有的酶切位点消失,导致检测失败。而且RFL P完全依靠凝胶电泳来判断结果,敏感性较差,贾阴性率较高。Real-timeP CR技术的出现为核酸的检测提供了新的技术手段。汪荣生等[14]通用模板PCR技术检测乙型肝炎YM DD变异珠与本方法有许多相似之处,但从通用模板PCR技术的方法学原理可以看出它与本方法相比特异性较差。本方法应用了引物选择性原理采用相同的正向引物和探针以及三条不同的反向引物C、V、I在不同的反应管中进行YM DD、YV DD和Y IDD检测,其中C管扩增所有类型的YM DD并作为对照,V管用来扩增YV DD,I管扩增YI DD,因此V、I管的扩增曲线反映V、I不同的突变类型,有利于YV DD 和YI DD混合型耐药珠的检测。3条不同的反向引物C、V、I的3 末端碱基分别与野生珠和V、I变异的基序匹配有利于点突变的变异检测。总之,本研究采用T aqM an探针技术和选择性引物的实时荧光PCR所建立的检测HBV拉米夫定耐药突变方法,能计算突变珠比例,与测序法符合率非常高,可以作为检测慢性乙肝患者拉米夫定耐药的有效手段[15]。
3 HBV分子诊断在临床上的应用
HBV DNA检测是乙肝病毒抗病毒治疗的有效监测指标。乙肝病毒药物治疗后,HBV DNA含量持续下降,然后持续在低水平,或低至方法学能检出的含量(测定下限)以下,则说明治疗有效。观测抗病毒药物治疗效果不能凭两三次检测结果来判断,必须多次动态观察,每次检测的间隔天数不宜太短,一般为两周以上。可采用以检测次数为横坐标,HBV DNA量为纵坐标作图的方法来判断血清HBV DNA量的变化趋势,进而判断抗病毒治疗是否有效。血循环中HBV DNA浓度与HBsAg和HBeA g有一定的相关,但其浓度间并不呈正线性相关。HBeAg阳性的标本, HBV DNA通常有较高的浓度,HBeAg阴性、抗HBe阳性的标本,HBV DNA浓度通常较低。当HBV基因组前C区发生突变时,则可出现HBeAg阴性而HBV DNA仍保持在较高的浓度。单独抗HBc阳性的血液HBVDN A浓度通常很低。关于血液中HBV DNA浓度与患者传染性之间的关系,如血清中HBV DNA浓度大于109拷贝/ml,则在日常生活密切接触中即具有较强的传染性。105~106拷贝/ml,则在日常生活密切接触中的传染性较小。小于105拷贝/ ml,则日常生活密切接触中几乎没有传染危险性。但不管HBV DNA的浓度为多少,哪怕是低于相应PCR方法的下限,也均会引起输血后的感染。
4 结束语
HBV DN A检测阳性通常被当做HBV感染及复制的金标准,HBV DNA出现早于其他血清标志物,其拷贝数高低
是反映患者体内病毒复制与传染性的直接证据,因此HBV DNA检测技术对临床诊断、治疗、合用药和判断预后具有重要意义。虽然该技术还存在成本高,操作过程复杂,假性结果等问题,但是相信随着生物技术的发展,该方法将逐渐成熟和完善。
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(责任编辑:段姚尧)
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(责任编辑:段姚尧)
病毒感染实验诊断 1. （1）一般原则是特异敏感、快速和简便。首先根据流行病学和临床特点，初步判断可能感染的病毒。 （2）然后根据可疑病毒的生物学特点、机体免疫应答和临床过程，以及病人当前所处的时机，确定实验诊断方法。 2. （1）对潜伏期短，发病时尚无抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。 （2）对潜伏期超过十天的感染，可检测特异性的IgM抗体来进行早期快速诊断，及区别初次和再次感染。 （3）对可在体内形成持续感染或潜伏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无4倍以上升高，或直接检测病毒核酸。 （4）对原因不明或有新病毒感染时，应采集标本进行病毒分离，同时应采取双份血清以确认分离的病毒为病原体。 （5）对同一症状可有多种病毒引起的情况，应同时检测几种相关病毒的病毒颗粒、抗原或抗体。 （6）对由多个型别组成的病毒可测定它们的共同抗原。 第一节标本采集与运送 一、标本的采集 1. 采样时间：尽可能在发病的初期，急性期或患者人院的当天进行。 2. 标本种类的选择：根据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感染病毒种类，选择相应部位采取标本。 常见分离病毒标本的选择： 3．常见标本的采集方法 (1) 血液：以无菌取抗凝血10ml。抗凝选用100n／ml肝素钠。用于分离CMV、HSV，、黄病毒、EBV、HIV-1及新生儿肠道病毒。 (2) 脑脊液：以无菌取脑脊液1～2ml，冰浴立即送检。在4℃可存放72h。用于分离柯萨奇病毒、ECHO病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。 (3) 宫颈或阴道拭子：采取病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm停留5秒取出，冰浴立即送检。用于分离HSV、CMV。 (4) 粪便标本：取2～4ｇ粪便加10ml运送液立即送检，用于分离腺病毒、肠道病毒和轮状病毒。 (5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。用于分离流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV
乙型肝炎诊断标准( WS 299-2008)解读 《乙型病毒性肝炎诊断标准》( WS 299-2008)（简称《乙肝诊断标准》）是原国家卫生部制定的行业标准。为便于医疗卫生人员对乙型肝炎（简称乙肝）诊断标准的理解，提高乙肝病例诊断和报告的准确性，现对《乙肝诊断标准》进行解读。 一、制定《乙肝诊断标准》的背景 我国是乙肝疾病负担严重的国家，乙肝病毒( HBV)慢性感染者基数巨大。通过实施乙肝疫苗预防接种为主的综合性防控措施，我国的乙肝防控工作取得了显著成就，HBV感染率显著下降。但全国报告的乙肝发病率仍维持在较高水平，其中医务人员对乙肝病例诊断不统一，存在着较多的错报、误报、重报、漏报等是其中的主要原因。 为规范乙肝诊断和报告，根据工作需要，卫生部传染病标准专业委员会提出重新修订乙肝诊断标准，委托北京大学第一医院和中国CDC联合起草制定了《乙肝诊断标准》。2008年12月11日，原国家卫生部批准并发布《乙肝诊断标准》，并于2009年6月15日正式实施。国家质量监督检验检疫总局、国家标准委员会制定的《乙型病毒性肝炎的诊断标准及处理原则》( GB 15990-1995)（简称1995年国家标准）白《乙肝诊断标准》实施之日起废止。 二、《乙肝诊断标准》与1995年国家标准的异同 （一）适用范围和目的 1995年国家标准规定了乙肝的诊断标准和处理原则，适用于各级医疗机构作为对乙肝病例诊断及治疗的依据。制定《乙肝诊断标准》时，根据《中华人民共和国传染病防治法》的相关要求，更注重了乙肝病例诊断和报告的需要。 因此，在《乙肝诊断标准》中规定了乙肝的诊断原则、诊断分类、诊断及鉴别诊断依据，适用于全国各级各类医疗卫生机构及其工作人员根据传染病疫情报告要求，对乙肝病例做出准确的诊断和报告。 （二）诊断原则 1995年国家标准规定应根据流行病学、临床症状和体征、实验室检查和（或）肝活体组织学检查等手段进行综合分析，并根据动态观察做出诊断，更强调疾病的严重程度和临床特征。而《乙肝诊断标准》则强调疾病感染状态，根据临床症状、体征和实验室检查结果进行诊断。（三）诊断分类 1995年国家标准中，基于临床治疗的需要，将乙肝分为急性无黄疸型肝炎、急性黄疸型肝
乙型肝炎病毒感染最新综述 2014-07-08 23:02来源：丁香园作者：rain_轩 字体大小： 乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球分布，与肝硬化及肝癌的关系密切，是世界范围内重要的公共健康问题，全球人口的30%有血清学证据证实现症或既往感染HBV。HBV在不同地区的流行率和主要基因型不同，而不同流行程度的地区主要的传播模式也不同。 HBV为部分双链DNA病毒，其血清学标志物有：表面抗原（HBsAg）和表面抗体（抗-HBs）、E抗原（HBeAg）和E抗体（抗-HBe），核心抗体IgM（抗-HBc IgM）和IgG（抗-HBc IgG）。不同标志物在不同的感染阶段出现，具有各自的临床意义。 HBV为非细胞毒性病毒，肝脏损伤和病毒控制，及带来的临床结局，均依赖于病毒复制与宿主免疫应答间复杂的交互作用。慢乙肝患者的T细胞应答较弱，在自发性HBeAg血清学转换或抗病毒治疗后有所恢复。然而过度激活的免疫应答可导致爆发性肝炎。 慢乙肝自然史可分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期、再活动期。不同阶段有各自的临床和血清学特征。早期发生HBeAg血清学转换者及长期稳定在低复制期患者预后较好。总体而言，围生期感染HBV的人群中大约40%男性和15%女性将死于肝硬化或者肝细胞癌。 抗病毒治疗可以减轻肝脏炎症，逆转肝纤维化并减少肝细胞癌发生。目前已有2种干扰素α和5种核苷（酸）类似物用于慢乙肝抗病毒治疗，两类药物治疗各有优劣。各大指南对抗病毒治疗的时机和疗程都有相同或者类似的推荐。 乙肝疫苗的问世和和普及显著减少了慢乙肝的发病率，甚至带来了肝癌发病率的下降。2种干扰素和5种核苷（酸）类药物的相继上市，在抑制病毒复制、减轻肝脏炎症方面发挥了重要作用。越来越多证据表明，长期抗病毒治疗可减少肝硬化及肝细胞癌的发生率。 安全、有效的HBV疫苗已于1981年问世，虽然地区间存在差异，广泛的新生儿疫苗接种已经带来发病率的大幅下降，甚至肝癌发病率的下降。然而部分
分子诊断检测项目介绍 天津万盖得门诊部是一家由海外归国人员为主体创办的股份制民营医疗机构, 以引进、开发和推广新的医学检验技术为主要经营内容。万盖得三字来自英语“ V nguard”的音译，其意译为前哨或尖兵的意思，这表明了创办者“敢为天下人先”的意愿。希望能够凭借自身的知识、技术、信息和观念优势，为国内医学检验方面的技术进步以及医疗体制的改革做出贡献。万盖得将以严肃、严谨和科学的态度开展各项业务，为医院和社区提供高质量的医疗和检验服务。 分子诊断是我们首先开展的实验诊断服务，这是一个全新的、被称之为实验诊断一场革命的领域，因为分子技术的临床应用已经使很多用常规技术根本无法检测的病理变化可以被精确的测到。我们首先开展的用细胞DNA 定量分析系统进行肿瘤的早期诊断，处于世界领先地位，这项技术已使脱落细胞的检查成为一项客观、准确、自动化和高通量的肿瘤筛查和早期诊断的技术平台。我们自主开发的多重PCR 检测性病病原、病毒和难以培养的细菌性病原，将给感染性疾病的诊断和治疗带来新的突破性进展。在医疗服务方面，我们计划引入发达国家中行之有效的家庭医生服务模式，为中等收入以上的家庭和个人提供个体化和优质的医疗和保健服务，引导我们的服务对象建立起防病重于治病的观念，主动地提高自身的保健意识。与同等规模的医疗机构，保持一种即竞争又合作的新型关系。与大型综合医院和专科医院，我们希望能建立起互补和互利的协作关系。我们相信，万盖得在各级领导和医务界同仁的关怀和支持下，定能发展壮大。 万盖得首席科技顾问 临床微生物学博士吴 尚为2006 年元月
分子诊断目录 细胞分子生物学检测 细胞DNA定量分析系统简介 细胞DNA定量分析的基本原理 细胞DNA定量分析的临床应用价值 不同DNA指数（DI）在宫颈癌普查中的临床意义 宫颈癌和宫颈癌的早期诊断宫颈癌筛查和常规宫颈细胞学检查宫颈细胞学检查的方法宫颈细胞DNA定量分析细胞DNA定量分析的其他用途 核酸检测技术 基本概念 多聚酶链反应-PCR 人类乳头状瘤病毒的检测 人类乳头状瘤病毒人类乳头状瘤病毒与宫颈癌人类乳头状瘤病毒对宫颈癌的“预警”作用万盖得宫颈癌筛查—预警—监测和早期诊断系统宫颈标本采集、送检注意事项 慢性生殖道感染和性传播疾病病原的检测慢性生殖道感染和性传播疾病引起慢性生殖道感染和性传播疾病的常见病原诊断困难造成对发病率统计的困难实验检测方法及优、缺点分子扩增技术的应用促进了对性病的了解 PCR已成为检测性病病原的金标准 万盖得多重PCF检测性病病原 脑脊液中感染病原的检测 中枢神经系统感染和诊断 人类疱疹病毒与中枢神经系统感染 脑脊液中检测病毒的困难 万盖得多重PCR检测脑脊液中的疱疹病毒 细菌性中枢神经系统感染
慢性乙型肝炎病毒感染的自然史 首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心吴鹏尤红 编译自Brian J. McMahon, The Natural History of Chronic Hepatitis B Virus Infection, HEPATOLOGY, S45-S55. Vol. 49, No. 5, Suppl., 2009 摘要：慢性乙型肝炎病毒感染是个复杂的过程。它包括三个阶段：（1）免疫耐受期，这一期HBV DNA高表达，谷丙转氨酶（ALT）水平正常，肝脏损伤程度最小；（2）免疫活动期，HBV DNA高表达，ALT水平升高，肝脏炎症活跃；（3）非活动期，HBV DNA<2000IU/ml，ALT水平正常，肝组织活检炎症和纤维化轻微。感染者可以很快从一个阶段进展到另一个阶段但也可逆转。HBV感染最主要的不良后果是肝细胞癌（HCC）和肝纤维化。本文根据相关试验的证据强度对已发表的自然史研究进行评价和分级，通过最高证据等级的以人群为基础的前瞻性队列研究得出的HCC和肝硬化的危险因素包括男性、HCC的家族史、HBV DNA水平超过2000IU/ml、年龄大于40岁、HBV基因型为C型和F型，以及核心区启动子变异。次最高证据等级的研究提示危险因素还包括暴露于黄曲霉素、大量饮酒和吸烟。目前还需要改进研究方法以发现向HCC或肝硬化发展的高危病人，并在适当的人群中进行更早期的抗病毒治疗的干预。未来的研究应包括对已经建立的、以人群为基础的、前瞻性队列研究进行随访，还应包括建立新的队列，即来自多中心而且根据不同HBV基因型/亚型和临床分期分层的队列，以判定HBV各期、HCC及肝硬化的发生率。同时，在这些队列中应用巢式病例对照研究评价活动期或非活动期、HCC和肝硬化病人中免疫学的和宿主遗传学因素。 引言 全世界有3.5至4亿人感染慢性乙肝病毒。其两个主要不良后果是肝细胞癌（HCC）和肝硬化，均能导致肝病相关性死亡。慢性乙型肝炎病毒感染的自然史很复杂，被感染者要经过几个阶段。患者可以从高病毒载量和无肝脏疾病状态到活动期肝病，接着到非活动期，几年后又可以回复到活动期。疾病发展到进展期纤维化既可以很快，也可能很慢或偶发。在非活动期，肝脏炎症、纤维化甚至早期肝硬化也可以随时间而逆转，只有当疾病重新活动时才会复发。所以慢性乙肝是一个动态的过程，很难预测一个慢性感染者随时间进展会发生什么。因此理解慢性乙肝的自然史很重要，它可以指导临床医生是否和何时开始抗病毒治疗。这篇文章的目的是评论已发表的慢性乙肝病毒感染自然史的文献，提炼出管理病人的最可用的证
HBV感染后易导致慢性持续感染的进展研究 学号：430560511089 姓名：桂冠班级：2011级研3班 摘要：乙型肝炎病毒感染后容易形成慢性化.目前认为免疫耐受性是建立HBV持续感染最重要的因素，但在 HBV感染免疫应答过程中形成免疫耐受的确切机制尚不明确. 目前，多数学者认为 HBV 感染慢性化的主要机制是宿主对 HBV 各种抗原产生不同程度的特异性免疫无应答,即免疫耐受 HBV 感染机体后,机体免疫强度的高低,可能成为决定急性自限性感染或慢性感染的标志.本文就近年来国内外对于HBV感染后易导致慢性持续感染的免疫耐受机理的研究进展作一综述. 关键词乙型肝炎；免疫耐受；慢性持续感染 慢性乙型肝炎是一种流行性、进展性传染病，全球HBV感染者约3.5－4亿人，我国属于乙肝高流行地区，约有1.3亿感染HBV，约20%慢性HBV患者最终进展为肝硬化、甚至肝癌。然而，HBV感染后易转变为慢性持续感染状态的机制尚不清楚。通过对近年来相关文献的阅读，此文拟将就近年来慢性HBV感染的患者体内免疫耐受产生的可能机制的研究进展进行综述。 1、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B， CHB）与免疫耐受 HBV作为一种非细胞毒性病毒，在感染机体后要持续生存下来，就必然不能被机体的保护机制所清除。免疫耐受是指机体免疫系统在接触某种抗原后产生的特异性免疫无反应（或称为负免疫应答），但对其他抗原仍保持正常应答的状态。人感染 HBV后，病毒持续 6 个月仍未被清除者称为慢性HBV感染。在围产期和婴幼儿时期感染HBV者中，分别有 90%和25% 30%将发展成慢性感染。其HBV感染的自然史一般可 分为 3 个期，即免疫耐受期免疫清除期和非活动或低复制期。在青少年和成人感染 HBV后，仅 5% 10%发展成慢性感染，一般无免疫耐受期，早期即为免疫清除期，以后可为非活动或低（非）复制期。 1．1宿主因素 免疫耐受与机体免疫系统发育成熟程度有关，成熟程度是决定HBV持续感染的重要因素。新生儿免疫耐受，因新生儿免疫系统暂未发育完全，感染HBV后难以将其清除。成人的免疫耐受，成人机体的抗病毒机制包括固有免疫和获得性免疫。HBV进入机体后，首先面对的是宿主的固有免疫防御机制，此系统在宿主防御机制中有着重要而基础的作用。固有免疫系统功能低下或HBV的存在若抑制了免疫系统的作用，可导致HBV由急性感染进展为慢性感染。 免疫耐受也可能与免疫细胞受到 HBV 感染有关。对HBV疫苗无应答的慢性HBV 感染母亲所生的新生儿，多数出生时在PBMC 中就可检测到 HBV 基因组，其中只有部分新生儿血清中检测到 HBV－DNA，对疫苗应答者中 PBMC中无一例检测到HBV－DNA。进一步研究发现，对 HBS无应答是特异性的，故研究者认为不应答的原因很可能是由HBV 感染PBMC 所致。 HBV 感染慢性化的原因与HBV特异性细胞毒T淋巴细（cytotoxic T lymphocyte， CTL) 的反应密切相关。多数学者研究认为，感染早期乙型肝炎患者体内 CTL 应答的强度和质量决定。感染的发展方向在慢性感染时，HBV 特异性CTL 应答的数量和质量均大为降低。 细胞程序性死亡受体 l( programmed cell death 1， PD － 1) 是近年来
POCT设备携带方便，操作简单、检测时间短，使用成本低。在美国，70%的临床检测均由POCT完成，以小于1%的检测费用影响了超过70%的临床决策，年产值超过百亿美元。而在中国，这一比例不到10%，发展潜力极为巨大。 分子诊断从基因层次进行检测，检测对象为核酸，灵敏度和准确性高，可在感染初期识别病毒或者提早确认基因突变，基于PCR的分子诊断往往是医院对传染病诊断的“金标准”。虽然目前市场份额较低，仅有5%，但分子诊断目前还处在行业技术的起步阶段，未来将有巨大的发展空间。 应用分子诊断方法的POCT凭借其灵敏度和准确度高、携带方便、操作简单、检测时间少、对环境无要求及成本低的优点，极有可能会成为未来体外诊断行业发展的主流。然而POCT分子诊断系统技术门槛非常高，基本被Danaher、Roche、Biomerieux、Abbott等几大巨头垄断，国内很多公司想尽办法去copy这些产品都没有成功。2013年生物梅里埃以4.5亿美元收购Filmarray，丹纳赫2016年更以40亿美元的天价收购Cepheid，而国内POCT的龙头企业万孚生物采用银行贷款的方式以1.25亿元人民币投资了POCT分子诊断公司Atlas Genetics，充分显示了POCT分子诊断平台技术的稀缺性。 本篇主要介绍国外几个主要的分子诊断POCT产品。 1. Cephid GeneXpert 平台 该平台运用半巢式qPCR+微流控技术，组建了多机并联检测系统，满足不同通量的检测需求。已拥有17项FDA认证及23项欧盟认证的诊断项目，如：结核分枝杆菌、MRSA、难辨梭菌、碳氢霉烯耐药肠杆菌、甲流/乙流、B族链球菌、肠病毒脑膜炎、沙眼衣原体/淋病奈瑟菌、HPV、凝血二因子及五因子、BCR-ABL等，满足患者从常规传染病到癌症基因检测的各个领域。包括取样、加样、检测三个步骤，手工操作时间不超过1分钟，但检测时间根据检测项目不同最少需要20min，最高则需要120分钟。设备价格在5k-17k美元，17-35美元/test。Cepheid的GeneXpert在欧美和中国已经建立起比较强的竞争优势，并且背靠丹纳赫这棵大树，不容小视。 2. Roche Cobas Liat平台 该平台将qPCR和气压式微流控技术相融合，采用非传统的微流控芯片结构，通过温控进行PCR扩增，全自动触摸屏导引操作。检测项目主要有甲流/乙流，甲流/乙流和呼吸道合胞病毒，A组链球菌。需要加样、扫描和开始3步操作，20分钟出结果。设备价格大约20k 美元，约30美元/test。该平台原本由IQuum 研发，2014年4月，IQuum 被罗氏以4.5亿美元收购。
急性乙肝疑似病例诊断（符合任何一项即可诊断）： 1. HBsAg阳性+近期出现无其他原因可解释的乏力和消化道症状，可有尿黄、眼黄和皮肤黄疸。 2. HBsAg阳性+肝脏生化检查异常，主要是血清ALT和AST升高，可有血清胆红素升高。 急性乙肝确诊病例诊断（符合任何一项即可诊断）： 1. 疑似乙肝+有明确的证据表明6个月内曾检测血清HBsAg阴性。 2. 疑似乙肝+抗-HBc IgM阳性1:1000以上。 3. 疑似乙肝+肝组织学符合急性病毒性肝炎改变。 4. 疑似乙肝+恢复期血清HBsAg阴转，抗HBs阳转。 慢性乙肝疑似病例诊断（符合任何一项即可诊断）： 1. 慢性肝病患者的体征如肝病面容，肝掌、蜘蛛掌和肝、脾肿大等+ 急性HBV感染超过六个月仍HBsAg阳性或发现HBsAg阳性超过6个月 2. 慢性肝病患者的体征如肝病面容，肝掌、蜘蛛掌和肝、脾肿大等+ HBsAg阳性持续时间不详，抗-HBc IgM阴性 3. HBsAg阳性持续时间不详，抗-HBc IgM阴性+ 血清ALT反复或持续升高，可有血浆白蛋白降低和（或）球蛋白升高，或胆红素升高 慢性乙肝确诊病例诊断（符合任何一项即可诊断）： 1. 急性HBV感染超过六个月仍HBsAg阳性或发现HBsAg阳性超过6个月+ 血清ALT反复或持续升高，可有血浆白蛋白降低和（或）球蛋白升高，或胆红素升高+ 血清HBsAg阳性或可检出HBV DNA，并排除其他导致ALT升高的原因 2. 急性HBV感染超过六个月仍HBsAg阳性或发现HBsAg阳性超过6个月+ 肝脏病理学有慢性病毒性肝炎的特点+ 血清HBsAg阳性或可检出HBV DNA，并排除其他导致ALT升高的原因 3. HBsAg阳性持续时间不详，抗-HBc IgM阴性+ 血清ALT反复或持续升高，可有血浆白蛋白降低和（或）球蛋白升高，或胆红素升高+ 血清HBsAg阳性或可检出HBV DNA，并排除其他导致ALT升高的原因 4. HBsAg阳性持续时间不详，抗-HBc IgM阴性+ 肝脏病理学有慢性病毒性肝炎的特点+ 血清HBsAg阳性或可检出HBV DNA，并排除其他导致ALT升高的原因
HBV持续性感染机制？ 答：免疫耐受和免疫抑制是乙肝病毒持续性感染的关键因素 （1）机体因素：免疫抑制，免疫耐受 （2）病毒因素：主要是变异和抑制 1.HBV持续性感染的免疫学机制 HBV进入人体后，首先激活固有免疫系统，启动细胞凋亡、分泌IFN-α/β等细胞因子途径，杀灭被感染细胞，抑制病毒生长与扩散，同时促进抗原递呈细胞( APC)、HBV特异性CD4+辅助细胞( Th) 、HBV特异性CD8+杀伤性T细胞和B细胞等增殖，建立适应性免疫。CD4+激活分化为Th1或Th2表型，前者主要调节细胞免疫应答，后者则介导体液免疫，在清除病毒过程中发挥关键作用。可引起细胞毒性T细胞(CTL)快速增殖及抗病毒分子干扰素γ(IFN—γ)、α和穿孔素的产生，从而以细胞裂解和非细胞裂解的方式清除感染HBV 的细胞。在此过程中，任何一个细胞细胞因子的数目和功能失调都可导致宿主对HBV的 清除能力下降，形成HBV持续性感染。 1.1固有免疫异常 INF-α/β受体(INFAR1) 启动子突变可导致激活物PRAR-1表达下降，使INF-α和INF-γ分泌减少，HBV的清除能力降低。检测HBV感染患者外周血免疫功能，发现患者体内巨噬细胞受体( NKR) 的表达水平较低，与之关的细胞溶解效应TNF和INF等因子也低。这可能是HBV持续感染的原因之一。 1.2抗原提呈细胞(APC) 数目减少、功能降低 未成熟的浆细胞样树突状细胞( pDC) 是产生内源性Ⅰ型干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ) 的主要细胞，其可在细胞核内表达Toll样受体-7(TLR-7) 和TLR-9当病毒感染时，pDC通过TLR-7和TLR-9刺激产生大量的Ⅰ型IFN，后者不仅直接抑制病毒复制，更重要的还可激活NK细胞、B细胞、T细胞和髓系DC(mDC)细胞，诱导并增强抗病毒的免疫应答。P HBV感染可下调TLR-9介导的干扰素调节因子-1(IRF-1）的表达和核异位，上调pDCs浆膜上负调控因子SOCS-1和IFN-а的抑制性受体BDCA-2的表达，阻断TLR9-MyD88-IRF-7-IFN-а信号途径，从而使IFN-а产生减少。 1.3CD4+、CD8+分化异常 由于CD8+的上升及CD4+T细胞生成的减少，使特异性抗体产生不足，不能有效清除游离的乙型肝炎病毒，而导致病毒在体内持续存在，并影响CD8+T细胞活性。CD8+细胞主要为T抑制(Ts )/T 细胞毒性细胞(CTL ) ，正常情况下，两者保持一定的比例，以维持机体的细胞免疫功能。CD8+增加是由于抑制性T细胞的增加所致，Ts细胞能够抑制免疫反应，其增殖可加重免疫抑制，使机体对乙型肝炎病毒反应低下。 1.4Th1、Th2水平低下，而Treg水平增高 Th1主要介导细胞免疫，在IFN-γ的作用下通过MHC-Ⅱ类分子作用分化而来，主要产生IL-4、IFN-γ; Th2主要介导体液免疫，在IL-4的作用下通过MHC-Ⅰ类分子作用分化而来，主要产生IL-4、IL-6、IL-10和IL-13; 同时IL-4可抑制Th1细胞功能，IFN-γ则抑制Th-1细胞功能; 而Treg可抑制免疫反应。有学者通过观察HBV转基因小鼠(Tg鼠) DC抗原呈递功能和T淋巴细胞的免疫活化状态，发现Tg 鼠DC表面MHC-Ⅱ类分子和CD80 表达低下，DC诱导脾淋巴细胞对HBsAg刺激的增生反应减弱，TC分泌的mIFN-γ、mIL-2、mIL-6及mIL-10均显著减少。说明TC针对HBV 的免疫活化状态欠佳，包括Th1和Th2功能都受到影响。也提示HBV相关的特异性细胞免疫和体液免疫均受到抑制。另外，宿主体内细胞因子，如Th1细胞因子( IL-2、IFN-γ) 和Th2细胞因子(IL-4、IL-6如IL-10) 的多态现象亦会影响T辅助细胞的活化。有研究发现，慢性乙型肝炎(CHB ) 患者外周血Treg 频率明显高于急性肝炎组，肝脏内Treg频率增加。CHB患者外周血Treg频率与病毒载量呈
乙型肝炎病例诊断报告要求 ★乙肝诊断《乙型病毒性肝炎（WS 299-2008）》 一、诊断原则 乙肝的诊断依据流行病学资料、临床表现、实验室检查、病理学及影像学检查等进行初步诊断，确诊须依据血清HBV 标志和HBV DNA 检测结果。 二、诊断分类 根据临床特点和实验室检查等将乙肝分为不同临床类型，包括急性乙肝、慢性乙肝、乙肝肝硬化、乙肝病毒相关的原发性肝细胞癌等。 三、诊断 （一）急性乙肝 1 近期出现无其他原因可解释的乏力和消化道症状，可有尿黄、眼黄和皮肤黄疸。 2 肝脏生化检查异常，主要是血清ALT 和AST 升高，可有血清胆红素升高。 3 HBsAg 阳性。 4 有明确的证据表明6 个月内曾检测血清HBsAg 阴性。 5 抗-HBc IgM 阳性1：1000 以上。 6 肝组织学符合急性病毒性肝炎改变。 7 恢复期血清HBsAg 阴性，抗HBs 阳性。 ▲疑似急性乙肝病例 符合下列任何一项可诊断： ◆同时符合1 和3。 ◆同时符合2 和3。 ▲确诊急性乙肝病例 符合下列任何一项可诊断： ◆疑似病例同时符合4。（1、3、4或2、3、4） ◆疑似病例同时符合5。（1、3、5或2、3、5） ◆疑似病例同时符合6。（1、3、6或2、3、6） ◆疑似病例同时符合7。（1、3、7或2、3、7） （二）慢性乙肝 1、急性HBV 感染超过6 个月仍HBsAg 阳性或发现HBsAg 阳性超过6 个月。 2、 HBsAg 阳性持续时间不详，抗HBc IgM 阴性。 3、慢性肝病患者的体征如肝病面容，肝掌、蜘蛛痣和肝、脾肿大等。 4、血清ALT 反复或持续升高，可有血浆白蛋白降低和（或）球蛋白升高，或胆红素升高等。 5、肝脏病理学有慢性病毒性肝炎的特点。 6、血清HBeAg 阳性或可检出HBV DNA，并排除其他导致ALT 升高的原因。 ▲疑似慢性乙肝病例
分子诊断知识点
1、基因（gene）是含有生物信息的DNA 功能片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA 和蛋白质（多数）. 2、基因组genome, 指细胞或生物体一套完整的遗传物质，包括所有基因和基因间的区域（序列）。 3、基因组学genomics 以基因组为研究对象的一门学科，包括基因组作图、基因组测序、基因定位、基因功能分析 4、结构基因：编码RNA 或蛋白质的核苷酸序列 5、基因表达：DNA 携带遗传信息通过转录传递给RNA，mRNA 通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程 6、C 值基因组DNA 全部碱基（对）数。C 值是物种的一个重要特性常数。C 值矛盾，C 值悖论：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象 7、N 值矛盾，N 值悖论：基因组中的基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性 8、必需基因（致死基因）关系到生物体存活的
基因。可通过基因突变实验确定必需基因。：9、原核生物基因组1、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等 10、重叠基因:是指两个或两个以上的基因共有一段DNA 序列，或是指一段DNA 序列为两个或两个以上基因的组成部分。 11、操纵子：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同组成一个转录单位 12、质粒的分类致育质粒F 质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒R 质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒Vi 质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒编码细菌产生细菌素；代谢质粒编码产生相关的代谢酶。 13、严紧控制型拷贝数少，一般<10 个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染色体DNA 复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝原因），认为是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑制自身DNA 合成。松弛控制型拷贝数多，10-200 个，分子量小；调节因子是RNA，复制不受染色体DNA 复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数）质粒，以获得较多的
乙型肝炎诊断标准 乙型肝炎的临床表现形式多样，诊断的依据除病人症状，体征外，须根据流行病学，实验室检查和/或肝活检等手段进行综合分析，动态观察诊断。 1.急性型肝炎 1)流行病学资料：半年内接受过血及血制品或曾有其他医源性感染，生活中的密切接触，尤其是性接触。 2)症状：近期出现的无其他原因可解释的持续一周以上的明显乏力和消化道症状。 3)体征：A. 肝肿大，伴有触痛或叩痛。B. 皮肤，巩膜黄染。 4)肝功能检查：A. 谷丙转氨酶（ALT）明显增高。B. 血清胆红素（Bil）大于17.1μmol/L（大于1mg/dL）和/或尿胆红素阳性并排除其他疾病所致的黄疸。 5)HBV标记物检查：乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性，抗HBc-IgM高滴度（1:1000稀释仍阳性），两项阳性或仅后者阳性。 疑似病例：1-2）+ 1-3）+ 1-4）； 确诊病例：疑似病例+ (三）1-5）如患者皮肤，巩膜无黄染，肝功能检查血清胆红素正常，尿胆红素阴性为急性无黄疸性乙型肝炎，反之为急性黄疸性乙型肝炎。 2.慢性迁延型肝炎（简称慢迁肝） 1)急性乙肝病程超过半年尚未痊愈者：如无急性乙肝史，乙肝病程超过半年未痊愈者；病情较轻不足以诊断慢性活动性肝炎者 2)肝功能检查ALT持续或间歇异常 3)HBV标记物检查：符合慢性乙肝的病原学指标，抗HBc-IgM滴度低于1:32或阴性，血清HBsAg或HBV-DNA任何一项阳性，病程持续半年以上。 4)肝脏病理组织检查可出现三类情况：慢性小叶性肝炎主要是肝小叶内的炎症和肝细胞的变性及坏死；慢性间隔性肝炎主要是汇管区有纤维细胞向小叶内伸展形成间隔；慢性门脉性肝炎门脉区有少量炎性细胞浸润，致使门脉区增大。 疑似病例：2-1）+ 2-2）+ 2-3）。 确诊病例：疑似病例+ 2-4）或2-3）+ 2-4）。 3.慢性活动性肝炎（简称慢活肝）有明显的肝炎症状。 1)体征：可有肝病面容，肝掌，蜘蛛痔，脾肿大或黄疸（排除其他原因） 2)肝功能检查：ALT反复和/或持续升高，血浆蛋白降低，A/G蛋白比例失常，r-球蛋白升高和/或胆红素长期或反复异常。 3)HBV标记物检测：同2-3）。 4)肝脏病理组织学特征：临床上慢活肝轻型与慢迁肝很难区别，确诊须借助病理组织学特征与临床表现相结合加以鉴别。慢活肝的病理改变以碎屑状坏死为主要特征，小叶内点状或灶状坏死，甚至灶性融合性坏死以及变性和炎症反应。并依据坏死程度分为轻型，中型和重型慢活肝。 疑似病例：3-1）+ 3-2）+ 3-3）+ 3-4）。 确诊病例：疑似病例+ 3-5）或3-4）+ 3-5）。 4.重型肝炎 1)急性重肝 A.既往无乙肝病史，以急性黄疸型肝炎起病，并在起病后10天内迅速出现精神神经症状（II度以上的肝性脑病），黄疸迅速加深，严重的消化道症状。 B.体征：肝浊音界迅速缩小等。
SYBRgreen法定量PCR的原理： 基因芯片的原理： 杠氏肌营养不良的多重PCR诊断的原理： 核酸分子杂交技术的原理：具有互补序列的异源核酸单链在一定条件下通过碱基配对原则形成杂合双链的过程 荧光阈值：同一样本在多次扩增过程中达到某 一荧光强度值时所需循环次数是一样的，这一荧光强度值为荧光阈值 ct值（阈值循环数）：达到荧光阈值时的循环次数 扩增曲线： 癌基因：一类能够引起细胞恶性转化的基因 原癌基因：细胞癌基因在正常情况下以非激活的形式存在的基因 抑癌基因：抑制细胞生长并且具有潜在抑癌作用的基因 PCR技术：利用针对目的基因所设计的一对特异性寡核苷酸引物，以目的基因为模板，在体外合成DNA片段 内含子：基因中不编码的序列 外显子：基因中编码的序列，与mRNA的序列相对应 转座因子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列 多基因家族：一些有编码功能的重复序列 单核苷酸多态性：单个核苷酸变异而形成的FNA分子多态 病毒基因组：由一种核酸组成，包括4种类型，双链DNA单链DNA双链RNA单链RNA 单核苷酸多态性：单个核苷酸变异而形成的FNA分子多态 病毒基因组：由一种核酸组成，包括4种类型，双链DNA单链DNA双链RNA单链RNA 重叠基因：两个或两个以上基因的开放阅读框共有一段DNA序列，既某段DNA序列成为两个或两个以上共有的组成部分 基因表达：受内外因素的影响，在复杂的调控机制控制下，多数基因经历激活转录和翻译等过程，产生具有特异生物学功能的蛋白质或RNA，赋予细胞或生物体特定功能或表型 组成性表达基本表达：某些资源对环境因素不敏感，在一个生物体几乎所有细胞中表达相对恒定，且持续表达 循环核酸游离循环核酸：一种存在于人体液中的细胞外游离状态的核酸，包括游离循环DNA 和游离循环RNA 熔解温度：在热变性过程中，使被测DNA分子双链解开50％所需温度 原核生物的转座因子 ①插入序列②转座子③可转移性噬菌体 基因组DNA序列分为4类 ①单一序列②轻度重复序列③重度重复序列④高度重复序列 线粒体基因组与核基因组相比自身的特点 ①母系遗传②线粒体DNA损伤后不易修复③遗传密码与通用遗传密码有区别 基因突变和基因多态的区别 通常DNA分子中某一特定位点的变异频率低于1％认为基因突变，高于1％则为DNA分子多态，基因多态是基因组多样性的分子机制 PCR原理或PCR反应过程 变性-退火-延伸，扩增效率达100%
乙型肝炎的实验室诊断
BsAg同时被检出来。抗前S1抗体出现于潜伏期，是所有抗体中出现最早的。抗S3抗体出现在急性期，处于HBV复制终止前后，提示有清除病毒的作用。 3. e抗原（HBeAg）: HBeAg是一种可溶性蛋白抗原，一般仅见于HBsAg阳性血清中，阴性中偶见。HBeAg出现在血中稍后于HBsAg，同时消失很快，所以窗口期也不能出现。HBeAg是由HBV－DNA开放读码框前C区编码，与HBV的活动性复制密切相关，是HBV传染性的重要指标。HBcAg是HBV 复制的标记，而HBeAg是HBV正在复制的标记。 4. e抗体（HBeAb）:在病毒复制过程中，e抗原暴露诱发机体产生。有一定保护作用。HBeAb紧接着HBeAg消失而出现，表示HBV复制已经减少，传染性降低。HBeAb持续时间不长，几月后逐渐消退。血清中HBeAb的检出意味着病毒复制中止或减少。 5. 核心抗体（HBcAb）: 由病毒C区编码的HBcAg诱导产生，没有保护作用。由于HbcAg位于病毒内部，一般方法不能检出，在血清中只能检测到HbcAb。HbcAb可以作为H BV感染的标志。血清中的检出HBcAb表明病毒正在或曾经进行复制。常说的HBcAb一般是指HBcAb－IgG，是最用的两对半中最先出现的抗体，一般在HBsAg出现后2－4周出现。当HBsAg消失，而HBsAb还没有出现时，常只能检出HBcAb，因此临床将此阶段称为窗口期。HBcAb和HBsAb一样也可以
持续多年存在。HBcAb－IgM仅出现在急性期，具有鉴别诊断意义。 .乙型肝炎病毒DNA聚合酶（DNAP）DNAP位于HBV核心部分，有逆转录酶活性，是HBV复制的直接指标。 ［基因诊断］随着分子生物学技主的发展，应用DNA分子杂交和PCR技术可以检测出血清、体液和组织中HBV DNA 的存在情况，是直接、准确的病原学诊断证据。使用PCR及定量PCR技术检测HBV DNA，是乙肝诊断的重大进步。 1．HBV DNA检测或定量检测（病毒载量）： （1）灵敏度提高：WANG等对206名HBsAg阴性、ALT 阴性的健康供血者用PCR方法检测HBV DNA，检出阳性9例，占4%。这说明HBsAg虽然是HBV的感染的标志，但由于S 基因的变异或低水平表达，而常规方法难以检出，会导致漏
305名医院工作人员乙肝病毒感染状况调查 发表时间：2009-07-07T15:25:16.513Z 来源：《中外健康文摘》2009年第13期供稿作者：焦祖伟1 王艳秋2 [导读] 乙型肝炎在我国属常见、多发病。对人群危害极大,尤其对医务人员更为严重。（1吉林省通化市第三人民医院检验科吉林通化 134002) (2吉林省通化市第三人民医院预防保健科吉林通化 134002）【中图分类号】R512.6+2 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085(2009)13-0022-02 乙型肝炎在我国属常见、多发病。对人群危害极大,尤其对医务人员更为严重。它传染性强、传播途径复杂。调查医院内工作人员的HBV感 染和传播具有一定意义。现将调查结果报告如下： 1 调查对象与方法 我们以305名医务工作人员为调查对象，每例由静脉采血3ml，进行乙肝血清五项感染指标检测（两对半）。使用试剂由山东3V生物工程集团有限公司提供，采用固相放免法，按说明书操作。使用仪器为西安262厂生产的FJ2003/50G放免测量仪。对检测结果有疑问者，均做重复测定。对测HBV血清学标记五项感染指标中以抗HBc阳性为HBV感染诊断指标。 2 检测结果 2.1医院不同职务HBV感染率明显不同全院305名职工被检血清中，其中护士感染率为82.5%，医师感染率为70.2%，医技感染率为59.6%，干部感染率为51.2%，工人感染率为40%，总感染率为69.8%。 2.2医院工作人员与托幼、饮食服务人员的比较在对医院工作人员HBV感染情况调查时，与同时进行HBV普查的托幼人员和饮食服务人员262名HBV感染情况进行了比较。262名普查人员中抗HBc阳性者为8例，感染率为 3.05%。被测医院工作人员305名中HBc阳性者为213例，感染率为69.8%。医院工作人员的感染率明显高于同时普查的托幼、饮食服务人员。两组间P ＜0.05，两组间差异显著。 2.3 HBV感染检出年龄分布从调查资料显示，医院工作人员中HBV感染率随着年龄增加而上升。40-60岁年龄感染率最高。 3 讨论 从调查结果可以看出，医院工作人员HBV感染率，护士、医师、医技人员高于干部工人，同时明显高于托幼、饮食服务人员。也表明工作年限越长，感染率越高。医院工作人员属高危易感人群，被HBV感染的途径可能与注射器针头刺破皮肤自我接种，乙肝病人的血液、体液、唾液、泪液等污染医务人员皮肤粘膜小伤口有关。除某些例外，对确切的感染途径及时间没有记忆。医务人员较密切频繁接触病人血液、体液是导致自身感染的职业性因素。文献报导HBsAg阳性的血液、汗液、尿液、胸腹水等都能查出HBsAg。医务人员对HBV感染与接触周围环境（高危区）与血（尤其是HBsAg阳性血）接触频率以及从事医疗工作年限是相关的。调查还表明，医源性感染是十分严重的。因此要严格执行消毒隔离制度，加强自我保护，是减少医源性感染的重要措施。医务人员被HBsAg阳性血污染的针头刺伤后，应以碘伏处理伤口，肌肉注射高效价乙型肝炎免疫球蛋白或联合应用乙肝疫苗。控制传染源，切断感染途径，从不同环节减少感染因素，以降低医院感染率的发生。
乙型肝炎病毒感染现状分析 乙型肝炎是一种严重危害人类健康的世界性传染病。我国亦为乙型肝炎病毒(HBV)高流行区，根据2006年全国乙型肝炎病毒感染血清流行病学调查资料，我国一般人群乙肝表面抗原(HBsAg)阳性率为7．18%，5岁以下儿童HBsAg的携带率为0．96%［1］。目前HBV分为A～I共9个基因型，各基因型又可分为不同亚型。基因型的分布具有一定的地理特征，且与HBV感染后的临床表现、预后及治疗应答等都有密切关系，能影响HBV感染自然病史、乙肝e抗原(HBeAg)血清转换、抗病毒药物耐药性的发生和病毒变异的方式等。因此，了解HBV基因型的分布对于疾病的诊断、病情的判断和治疗方案的选择都有重要意义。目前研究HBV基因分型时，大多数的研究对象来自于临床，对自然人群感染HBV标本的基因分型进行研究的不多。在对深圳地区居民乙肝血清流行病学调查的基础上，对HBsAg阳性血清做进一步基因型分布研究，以初步了解本地区乙肝病毒基因型的流行特点，为指导乙肝防治工作提供科学依据。 1对象与方法 1．1对象按照国家科技重大专项“十一五”课题《艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治》的要求，以深圳市居民作为目标人群，采用多阶段整群随机抽样法，选择1岁～59岁深圳户籍人口和在深圳居住6个月以上的暂住人口作为抽样对象。 1．2仪器与试剂MultiskanMK3酶标仪(芬兰);ELx50型洗板机(Bio－Tek公司);7500型荧光PCＲ仪(ABI公司)。HBV血清学标志物试剂盒(北京万泰生物药业有限公司，批号：B20101102);HBVDNA检测试剂盒(深圳匹基生物工程有限公司，批号：20100501);HBV基因分型PCＲ检测试剂盒(广州华银医药科技有限公司，批号：20100910)。 1．3方法
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒。是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（hepa DNA vividae）。根形态与结构 HBV病毒颗粒图示 1．大球形颗粒：亦称Dane颗粒，它是一种由一个囊膜和一个含有DNA分子的核衣壳组成的病毒颗粒，直径约42nm.核衣壳为20面体对称结构。游离的核衣壳只能在肝细胞核内观察到。血中Dane颗粒浓度以急性肝炎潜伏期后期为最高，在疾病起始后则迅速下降。Dane颗粒表面含有HBsAg，核心中还含有双股有缺口的DNA链和依赖DNA的DNA多聚酶。目前认为Dane颗粒即完整的HBV。 HBV DNA的两链长短不一，长链（L）完整，为负链，长度恒定，约3200个核苷酸。短链（S）为正链，长度可变，约为长链长度的50～100%，链的增生按5′-3′顺序进行。在不同分子中短链3′端的位置是可变的，而短链和长链的5′端位置固定点为粘性末端，通过250～300个核苷酸碱基配对，以维持DNA分子的环状结构。在粘性末端两侧，两链5′端各有一个由11个bp组成的直接重复序列（Direct repeat DR）-5′TTCACCTCTCC，该DR位于第1824个核苷酸者称DR1，位于第1590个核苷酸者称DR2，在病毒复制中起作用。 2．小球形颗粒：直径约22nm的小球形颗粒是HBV感染后血液中最多见的一种。它由HBsAg，即病毒的囊膜组成。化学组成为脂蛋白，可按其特有的密度与正常血清蛋白部分分离。在此颗粒中未检出达DNA多聚酶活性。目前认为HBV的小颗粒不是HBV，可能是它感染肝细胞时合成过剩的囊膜而游离于血循环中。
3.管形颗粒：直径约22nm，长度可在100～700nm之间。实际上它是一串聚合起来的小颗粒，但同样具有HBsAg的抗原性。 基因结构 目前，已可从感染HBV病人的血清中及感染肝脏提纯的病毒核心中分离出环状双股DNA，从而确定HBV属DNA病毒。 研究Dane颗粒DNA结构发现，DNA分子含有约3，200个核苷酸。它包括两个链；一个长度固定的负链和另一长度不定的正链。由于DNA生物合成是在多聚酶作用DNA引物生长末端3′－OH 与加入的脱氧核苷酸的5'-磷酸基形成磷酸二脂键完成的，因此，链的增生按5'-3'顺序进行，而且加到链上的每种脱氧核苷酸是按模板DNA的碱基配对互补规律进行，长链在1，800或1，818核苷酸附近有一个制品。短链的5'-末端通过长达250-300个核苷酸的碱基配对而维持分子的环状结构。DNA多聚酶作用不断延长短链3′端以修补缺口。缺口可能与HBV的DNA在感染细胞内的整合有关。 目前，由于克隆化DNA完整核苷酸已经确定，现已证实HBsAg和HBcAg都是由Dane颗粒的DNA 所编码，并且二类基因存在同一DNA分子上。有人比较病毒基因编码能力和病毒多少，发现HBV DNA负链能编码全部已知的HBV蛋白质，而其正链开放读码区，不能编码病毒蛋白。 HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X（图26-2），能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分，S基因和前S基因。S基因（核苷酸155～833）能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸（2，848-154）的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。C 区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBeAg和HBcAg.P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。X区（核苷酸1，374～1，835）可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。 HBV的抗原组成 1.HBsAg：HBsAg是由HBV的基因组所特定的，为上述三种形态的颗粒所共有。 HBsAg抗原活性属于高浮力密度范围内的脂蛋白类。用CsCl密度梯度离心，表面抗原（小颗粒和管状颗粒）平均密度为1.20g/cm2.Dane颗粒的密度略高，为1.25g/cm2。纯化的22nm颗粒的平均沉降系数为33-54S，分子量约为24-2.5×106。 纯化的HBsAg含有类脂质、糖类、脂质、蛋白质及糖蛋白。它由8种多肽组成，定名为P1至P8.其中至少有二种或三种多肽过碘酸Schiff试验阳性，提示存在糖类结构。用紫外分光光度计检查提取的HBsAg，显示有典型的蛋白吸收光谱。蛋白占总量的70～90%以上，广义的HBsAg由三种蛋白组成：（1）主要表面蛋白（S蛋白，小分子HBsAg），由S基因编码的226个氨基酸组成。（2）中分子蛋白（中分子HBsAg），由前S2、S基因编码，在S蛋白226个氨基酸的N端附加一个含55个氨基酸的Pre S2蛋白组成，共281个氨基酸。（3）大分子蛋白（大分子HBsAg），由S，前S1和前S2基因编码，在中分子蛋白281个氨基酸的N端附加一个含119个氨基酸的Pre S1蛋白组成，共400个氨基酸。 S蛋白即狭义HBsAg，是HBV囊膜的主要表面抗原的主要成份，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种形式，以二硫键相连形成二聚体，代表HBsAg的结构单位，具备完整的抗原性。如二聚体解离，则HBsAg抗原性将会明显下降。