Patent No. U.S. 6,759,539
Assignee: Chaichem Pharmaceuticals International, Laval, Canada Title or Subject: Process for Isolation and Purification of Paclitaxel from Natural Sources
This is the first of three patents covering paclitaxel 10a that is a naturally occurring compound found in the bark of yew trees and has been shown to be useful in treating various cancer tumours. The amount of 10a obtained from the bark is low, and hence, large amounts of biomass and solvents are needed to obtain reasonable quantities. Synthetic procedures are under investigation. This patent, covering 10a and its derivatives, describes an improved process to extract 10a from twigs and needles of coniferous trees of the genus T axus. An earlier process from the same company to extract 10a involves several chromatography stages and recrystallisations, and it is not particularly amenable to large-scale production. The new procedure involves an initial aqueous extraction step to remove soluble impurities from the biomass. This is then followed by extraction of 10a with methanol, followed by its isolation by chromatography and crystallisation.
The various stages of the process are summarised below:
A porous bag containing twigs and needles of the tree is immersed in distilled water for 3 h at room temperature,
the water is drained from the bag of biomass, and MeOH is added to the biomass in the tank at room temperature,
the extract is collected and the solution concentrated by distilling off the MeOH,
the crude solid is precipitated by addition of aqueous NaCl solution, collected by filtration, and then dried,
the solid is dissolved in Me2CO, leaving resins and pigments,
hexane is added to the solution to produce an oil that is collected and purified by low-pressure column chromatography at least once,
the purified oil is dissolved in acetone and cooled to give crystals of 10a, and these may be recrystallised to improve the purity.
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此提取工艺比目前广泛使用的工艺最大的改进是少用了很多有机溶剂。
紫杉醇的合成：此工艺包括了一系列紫杉醇类抗癌药物的合成
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Patent No. U.S. 6,765,015
Assignee: Xechem International Inc., New Brunswick, New Jersey, U.S.A. Title or Subject: Halogenated Paclitaxel Derivatives
The second patent on derivatives and analogues of paclitaxels such as 10a is a comprehensive piece of work that describes an extremely wide range of compounds. The patent describes a range of derivatives in which there are 95 different types of the halogenated R1 substituents in 10a in which R2 is H or Ac. Not surprisingly, experimental details are not described for many types. In view of the large number of compounds involved, this review only covers two examples that are shown in Scheme 3. The chemistry is quite straightforward and involves condensation reactions of amines and bromine containing acyl or aroyl chlorides. For example, the bromo-acyl derivative 12 is formed by reaction of 10b with 11 in the presence of Et3N, and the dibromo-phenyl carbamate 14 is produced by reaction of 10a with 13. The substrate 13 is made from 15 using triphosgene as the source of COCl2.
The patent also covers the formation of compounds called cephalomannines 16 by similar methods to those used for the paclitaxels. The patent again claims a very large number of derivatives in which R3 and R4 are halogenated groups.
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紫杉醇的合成２：以下工艺提出了一条比常规方法产率更高的此类药物合成路线
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Patent No. 6,768,012
Assignee: Indena S.p.A., Milan, Italy Title or Subject: Process for the Preparation of Paclitaxel
This third patent on the subject of paclitaxels describes a synthetic route to 10a from baccatin III, 17a (R1 = H, R2 = Ac). This conversion has been examined previously and hinges on being able to protect the hydroxyl groups on the diterpene moiety. The focus of this work is to protect either the 7- or both the 7- and 10-hydroxy groups in 17a by formation of esters. Scheme 4 shows the formation of the ester 17b (R1 = Cl3CCO, R2 = Ac) from 17a and Cl3CCOCl. The ester 17b is then converted to the 19 using the epoxyacid 18.
The final stages to 10a are shown in Scheme 5 and begin with the opening of the epoxide in 19 using NaN3. At the same time the protecting group at C-7 is removed, and the azide 20 is produced. The subsequent reduction of the azide group in 20 using PPh3/H2O in CH2Cl2 (DCM) gives the amine 21. Finally, 10a is formed in a Schotten-Bauman by reaction between 21 and PhCOCl in the presence of a biphasic mixture of EtOAc and aqueous NaHCO3.
The patent also describes experiments to prepare 10a starting from deacetylbaccatin III 17c (R1 = R2 = H). This proceeds via a similar route with initial formation of the bis-trichloroacetyl ester 17d (R1 = R2 = Cl3CCO).
The epoxy acids formed in these reactions are novel compounds, and 1H and 13C NMR data are given for these and other compounds.
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紫杉醇主要靠提取，但它的含量实在太低。在提取的过程中，也得到有好几种高含量的类似化合物。把这些类似的化合物物转化为紫杉醇将大大降低此药物的成本。以下工艺就是关于此转化的合成工艺。
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Patent No. U.S. 6,495,705
Assignee: NaPro BioTheraputics Inc., Boulder, Colorado, U.S.A. Title or Subject:
Efficient Process for the Production of 10-DAB-III by Selective Hydrazinolysis of T axanes
This patent is concerned with the production of 10-deacetyl baccatin-III 7e which is a precursor to paclitaxel 6. This is a naturally occurring compound found in the bark of yew trees and has been shown to be useful in treating various cancer tumours. A synthetic route to 6 is desirable because yew trees are very slow growing, and it requires 16 000 kg of bark for 1 kg of 6. During the extraction of 6 from yew bark several structurally related taxanes are also obtained in higher yields. It is an objective to convert some of these to 7e to increase the overall yield of 6 precursors from the extracts of the yew tree.
Several of the taxanes found in the yew tree contain side chains connected to the C-13 via the sterically hindered hydroxy function. Some, such as 7a, 7b, and 7c also contain an acetate group at C-10, and as a result, hydrolysis of the C-O bonds at C-13 and C-10 will produce the desired compound 7e. However, the C-13 is sterically hindered because it is located within the concave hemispherical skeleton; thus its hydrolytic cleavage is difficult. The process described here and shown below, cleaves these bonds using hydrazine in a solvent which reacts with the hydrazine. The preferred solvent is isopropyl acetate.
The use of a solvent that reacts with the substrate is claimed to be surprising and, hence, the novel feature of this patent. Not surprisingly no explanation of this finding is offered. The preferred method is to extract the taxanes with an acetate ester and then adsorb the solution onto silica gel before treating with hydrazine hydrate.
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新型抗癌药－紫杉醇
一、简介
1.发展史
从植物中寻找有效抗癌成分的历史至少可以追溯到公元前1500年关于纸莎草（papryrus）的
研究，但真正对天然产物进行系统的科学研究却是从本世纪50年代才开始的。50年代，Hartuell及其同事着重研究了抗癌制剂鬼臼毒素（PgdoPhyllotoxin）及其衍生物的应用。同时一系列寻找天然抗肿瘤成分的研究导致了象长春花碱（Vinblastlnc）、长春新碱（Vincristine）及秋水仙碱（Colchicine）等一系列具有代表性的抗癌药物的产生。1971年，Wanj及其同要从欧洲短叶红豆杉中分离得到一种具有细胞毒性的新化合物，命名为紫杉醇(Paclltaxel，现已商品化，其注册名为T axol)，药理实验证明，它具有广谱抗癌作用，但由于其天然含量极低，故而在当时并未引起人们的注意，直到1977年，HorwitZ博士发现其抗癌机理在于能够与微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制细胞中微管的正常生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖，这一机理与上述纺锤体毒性的抗癌药物（如长春新碱与秋水仙碱）的作用机制恰好相反，从而引起随后20多年关于该属植物的广泛研究。
2.自然资源
红豆杉（俗称紫杉，yew）植物分类归于裸子植物亚门，松杉纲，红豆杉目，红豆杉科中红豆杉族下的红豆杉属。红豆杉科共5属22种，我国有4属（红豆杉属、白豆杉属、穗花杉属、榧树属）12种1变种及1栽培种。目前所见报道只在红豆杉属植物中含有紫杉醇，本属共11种，我国有4种1变种，分别为西藏红豆杉，又名喜马拉雅红豆杉；云南红豆杉型，别名西南红豆杉；红豆杉；东北红豆杉；及南方红豆杉，也称美丽红豆杉。在这些植物中紫杉醇的含量依种属、植物部位、生长环境、生长年限，采收季节、贮藏及加工方法的不同而有显著差异。在目前发现的所有含紫杉醉的红豆杉属植物中仍以欧洲短叶红豆一中含量最高（0.069％），而最低含量只有0 003％，约从38 000棵紫杉树中方可分离提纯得到99％纯度的紫杉醇约25kg，对于成树：树皮>树叶>树根>树干>种子>心材。
紫杉醇是从红豆杉科红豆杉属植物树皮、针叶中分离出的一种四环二硝酸胺类化合物．它能有效地治疗晚期卵巢癌，乳腺癌和其它癌症，被称为是过去几十年中发现的最好的抗癌药物。1992年12月29日，美国FDA正式批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药物（商品名为Pach －taxel）。由于紫杉醇在植物体中的含量相当低，大约从3～6棵60～100年生大树的树皮中才能提取到1g紫杉醇，可治疗一个癌症患者。目前全球每年200kg紫杉自的消耗量意味着要砍伐100万棵红豆杉大树，随着紫杉醇应用范围的扩大，其需求量必然会逐年增加，而红豆杉树生长速度相当慢，直径20厘米的树需生长100年。因此，伐树生产紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布，也根本无法满足人们对紫杉醇的需求
，这主要是因为资源短缺及水溶性差两大难题。就目前研究结果表明。紫杉醇的主要来源仍是紫杉树皮，这种常绿乔木生长十分缓慢，大规模的砍伐必然严重破坏植物资源．而有机化学家们关于紫杉醇的全合成研究虽已在实验室获得成功，但从大规模生产的角度考虑仍是不可行的，因此目前有关紫杉醇的研究主要集中在以下3个方面：
1. 从红豆杉属植物中寻找与紫杉醇具有相似活性的紫杉类化合物或可供半合成的天然产物
2. 非天然获取紫杉醇的方法研究：
（1）含量较高的具有紫杉醇骨架的天然产物进行半合成；
（2）全合成研究，致力于寻找更经济可行的合成路线；
（3）细胞培养方法．
3．紫杉醇及其类似物的构效关系研究，包括药效基团的寻找及作用机制的研究。
二、药理与毒副作用
红杉醇具有独特的作用机制，能诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配与微管稳定，从而阻止肿瘤细胞的生长。药理实验证明，紫杉醇具有广谱抗癌作用，其抗癌性源于它作用细胞分裂过程中形成纺锤体的微管蛋白。与常用的其它纺锤体毒物如阻止微管聚集的长春花碱、长春花新碱、秋水仙碱、鬼臼毒素等作用相反，紫杉醇在低浓度下（0．25μm）就催化激管蛋白的迅速合成微管并结合到微管上起稳定和防止微管解聚作用。正常微管在4 ℃低温或Ca2+存在下便可解聚，而紫杉醇作用后的微管则不发生解聚。这样紫杉醇的活性表现在两个方面：一是对迅速分裂的肿瘤细胞，紫杉醇冻结有丝分裂纺锤体，从而使肿瘤细胞停在G2期和M期，直至死亡。二是抑制肿瘤细胞的迁移。
紫杉醇为作用机制新颖的抗肿瘤药物。临床研究表明其对卵巢届、乳腺癌、食道涵、头颈部群状细胞癌等多种肿在有效，因此为广谱抗肿在药。但紫杉醇临床应用的某些方面有待继续研究，包括与其它抗肿在药物的联合用药、虽佳治疗方案、田注时间、耐受性等。
用紫杉醇治疗的有些病人出现严重的急性过敏反应，使必要的治疗受到干扰或停止治疗。在临床试验中，用紫杉醇治疗的少量病人出现明显的心血管不良反应；包括心肌梗塞、房倾、轻度充血性心衰、室性和室上性心动过速、窒性心律不齐等。与紫杉醇有关的其它不良反应包括几乎所有病人全部脱发；l、4％～30％的病人发生3或心粘膜炎；最主要的是轻度恶心、呕吐和局部静脉炎（4％～64％）。年龄、以往的治疗或接受紫杉醇的总累积剂量似乎对该药的耐受性无影响。
三、紫杉醇的获取
1.天然提取分离
紫杉醇（T axo）是从红豆杉属植物（Tr。。SPP）中分离获得的、具有紫杉烷独特骨架
的二两类化合物、由于其良好的抗癌活性和独特的作用机理而受到广泛关注。目前市售的紫杉醇多从天然或栽培红豆杉的树皮或枝叶中直接提取得到，主要方法有
提取－有机溶剂初步浸提、组织膜渗透、固相提取法、超临界流体提取法；
分离精制－柱层析法、薄层色谱法、沉淀法、树脂吸附分离法、化学反应法
2．细胞培养
紫杉醇资源短缺的途径是组织培养技术。虽然这一生物技术已成功地应用于类似于胰岛素这样的蛋白质的生物合成，但在紫杉醇上的应用却是在00年代才开始发展的。目前红豆杉愈伤组织诱
导与培养技术已经成熟，诱导愈伤组织的基本培养基，激素种类和浓度，外植体类型，培养条件等因素和培养程序都已经确定
3．有机合成
解决紫杉醇资源的另一个有效途径是有机合成。目前紫杉醇是从浆果赤霉素Ⅲ进行半合成得到的。因此寻找另一种来源就摆到了化学家的面前。许多化学家对紫杉醇本身复杂又新奇的结构极有兴趣，把合成紫杉醇看成是一种极富刺激的挑战，出于对商业利益的考虑，世界范围内约有30个研究小组正加速开展紫杉醒全合成的工作，以便尽快获得FDA的批准，因此竞争非常激烈。
紫杉醇的全合成是以D-A反应完成A环和C环两部分的合成，在经过Shapiro和McMurry两个关键性的C-C键联接来构建ABC三环骨架体系，在此基础上合成不稳定的环氧丙烷，然后通过成熟的半合成方法联接上13－酯侧链而完成整个分子的合成。
四．紫杉醇的全合成
1．结构分析
紫杉醇的分子结构复杂，其全合成的挑战性在于：特殊的三环［6＋8＋6］碳架、存在的桥头双性以及过多的含氧取代。除此之外分子中还有一些对外界条件敏感的基因，如环氧丙烷在亲核条件下的开环和7位羟基在碱性环境中发生异构化等。
2．合成策略
紫杉醇的全合成总策略为：紫杉醇的全合成是以D-A反应完成A环和C环两部分的合成，在经过Shapiro和McMurry两个关键性的C-C键联接来构建ABC三环骨架体系，在此基础上合成不稳定的环氧丙烷，然后通过成熟的半合成方法联接上13－酯侧链而完成整个分子的合成。
3．合成过程
a．A环前体的合成：利用Diels-Alder反应可以高收率的获得区域选择性的目标化合物。b．C环的合成
以硼酸酯为模板可以使二烯与亲二烯试剂在一个专一的方向上加成，其区域选择性恰与目前C
环所要求的一致。
C．合成过程－ABC三环体系的构建
将1，2位邻二醇羟基形成碳酸酯保护，4，20位形成甲叉二氧基则可以促使9，10位二醛基在空间上相互接近，使McMurry反应得以顺利进行。
d．D环的合成
?D环是一个含氧原子的四元环，张力较大，一般难以合成。由于D环的不稳定性I一O键易断裂，所以在A、BI环形成之后进行合成。首先，利用硼氢化一氧化反应在Q位引人氧，然后转化成三氯乙酸酯，然后用樟脑磺酸（CSA）除去三甲硅基，使h位的羟基对Q位发生分子内科亲核取代反应形成D环，令人吃惊的是反应进行得相当好，且产物的立体构型符合要求。
通过上述合成步骤就会得到紫杉醇单体：
紫杉醇的全合成的完成，使化学方法制取紫杉醇得到了突破，从而提高产量，满足人们对紫杉醇的需求，为全世界的癌症患者带来福音。
参考文献：
1．吴楠等，紫杉类化合物研究进展，天然产物研究与开发，1996，8（3），56－68；
2．刘本叶等，利用生物技术生产紫杉醇的研究进展，生物学通报，199934（7），5－7；3．王书凯等，东北红豆杉中紫杉醇的含量研究，林业科技通讯，1999，7，19－20；
4．丘德有等，紫杉醇提取分离方法的研究进展，中国药学杂志，31（11），646－648；
5．许亚杰等，紫杉醇的提取、分离与检测研究进展，国外医药－植物药分册，2001，16（4），151－154；
6．田晓兵等，紫杉醇的全合成，国外医药－合成药分册，1997，18（4），229－232；7．徐亮等，抗癌药物紫杉醇的全合成，有机化学，2001，21（
紫杉醇检测标准
【正式名】紫杉醇
【汉语拼音】Zishanchun
【标准号】WS-099（X-087）-96
【拉丁文或英文】Paclitaxel
【主要活性成分】
5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯」。按干燥品计算，含C47H51NO14不得少于98.5%
【性状】白色结晶性粉末；无臭，无味。在甲醇、乙醇、氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。熔点本品的熔点（中国药典1995版二部附录ⅣC）为208～210℃。
【鉴别】（1）取本品与紫杉醇对照品，分别加氯仿制成每1ml中含1mg的溶液，照薄层色谱法（中国药典1995年版二部附录ⅤB）试验。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G板上，以甲醇-氯仿（8∶92）为展开剂，展开后，晾干，喷以5%（V/V）H2SO4乙醇液。在80～90℃约3分钟显色，供试品溶液所显主斑点的颜色和位置应与对照品溶液的主斑点相同。（2）取本品，加甲醇制成每1ml中含15μg的溶液，照分光光度法（中国药典1995年版二部附录ⅣA）测定，在227nm的波长处有最大吸收。（3）取含量测定项下的供试品溶液和对照品溶液，照含量测定项下的色谱条件试验，分别取10μl注入液相色谱仪，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品一致。（4）本品的红外吸收图谱应与对照品的图谱一致。
【检查】
溶液澄清度与颜色取本品10mg，加甲醇溶液10ml溶解后，溶液应澄清、无色。有关物质精密称取本品适量，用流动相溶解并稀释成每1ml中含2mg和0.4mg的溶液，照含量测定项下的色谱条件试验分别取10μl注入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满标度，再分别取溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分保留时间的2倍，其显示的杂质峰数不得超过2个，各杂质峰的面积及其总和分别不得大于主峰面积的0.5%和1.0%。干燥失重取本品，以五氧化二磷为干燥剂，减压干燥至恒重，减失重量不得超过1.0%（中国药典1995年版二部附录ⅧL）。
【含量测定】
照高效液相色谱法（中国药典1995年版二部附录ⅤD）测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（3∶1）为流动相；检测波长为227nm。理论板数按紫杉醇峰计算，应不低于750。测定法取本品4mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇2ml，充分振摇，使溶解后，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。另取经减压干燥至恒重的紫杉醇对照品4mg精密称定，同法测定。按外标法的峰面积计算，即得。
【作用与用途】
【用法与用量】
【注意】
【剂量】
【标示量】
【类别】抗肿瘤药。
【制剂】
【规格】
【贮藏】遮光，密封，在2～8℃保存。【有效期】暂定一年。
第六章紫杉醇的生产工艺 6.1 概述 6.1.1 紫杉醇类药物 1、紫杉醇 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?）的化学名称为5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,13α-五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-[(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] ，英文化学名称为13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-benmethyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate。 紫杉醇具有复杂的化学结构，属三环二萜类化合物，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成（图6－1）。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式为C47H51NO14，分子量为853.92，元素百分比为C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。紫杉醇难溶于水，易溶于甲醇、二氯甲烷和乙氰等有机溶剂。 图6－1 紫杉醇的化学结构 2、多烯紫杉醇 多烯紫杉醇（多西他赛，Docetaxel，Taxotere?，图6－2）是在开展紫杉醇半合成研究过程中发现的一种紫杉醇类似物，两者仅在母环10位和侧链上3'位上的取代基略有不同。多烯紫杉醇的化学名称是5β,20-环氧-1β,2α,4α,7β,10β,13α-六羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2′R,3′S) -N-叔丁氧羰基-3′-苯基异丝氨酸酯]·三水合物，英文化学名称为-13-[(2′R,3′S) -N-carboxyl-3′-phenylisoserine, N-tertbutyl ester, 13-ester with 5β,20-epoxyl-1β,2α,4α,7β,10β,13α-hexahydroxytax-11-en-9-one-4-acetate-2-benzoate,trihydrate 。分子式为C43H53NO14·3H2O，相对分子质量为861.9。 1985年，法国罗纳普朗克乐安公司（Rhone-Poulenc Rorer）公司和法国国家自然科学研究中心（CNRS）以10-DAB作为母环骨架，通过半合成方法成功地合成出多烯紫杉醇，目
紫杉醇的提取和性能 姓名：高海艳 学号：51151300057 专业：种子植物分类学
紫杉醇的提取和性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇（T axol）是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1]（结构如图一所示），是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）和东北红豆杉（Taxus cuspidata）的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用，主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌[2]，被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉（Taxus cuspidata）幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材，幼苗的紫杉醇含量高低依次则是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外，对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究，结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉，再次为红豆杉；而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]： 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取
细胞密度 确定接种细胞培养时间 确定培养基 细胞悬浮培养配制培养基 2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]： 三、紫杉醇药用功能及体制液—液萃取 己烷沉淀 硅胶柱层析 结晶 TLC检测高效液相色谱检测 诱导愈伤组织 配制培养基添加植物激素 制备及接种外植体红豆杉幼茎30 天 转 接 继代培养筛选抗褐化剂 柠檬酸 VC 活性炭 确定愈伤组织 直接继代 剥离后继代 分离检测紫杉醇TLC-紫外分光光度法 多次继代至生长稳定 筛选高产细胞株培养方式 普通平板培养 条件培养 看护培养 植板率 稳 定 高 产 细 胞 株 添加多种代谢调节因子 确定培养方式小剂量连续添加一次性大剂量添加 确定代谢调节因子加入时间 高效诱导体系
紫杉醇规模生产工艺及方案（1500吨/年规模） 一、项目规模生产工艺方案 1、紫杉醇概述紫杉醇具有复杂的化学结构，母核部分是一个复杂的四环体系，有许多的功能基团和立体化学特征，化学名称为：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子由3个主环构成二萜核，上连1个苯异丝氨酸侧链，分子中有11个手性中心和多个取代基团，分子式为C47H51NO14，相对分子质量853.92，元素百分比（%）C：66.41，H:6.02，N:1.64，O:26.23。紫杉醇结构式为：紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。甲醇制3mg/ml 的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每咸的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外（﹥90%），经肾清除只占总清除的1%~8%。 红豆杉浸膏
1.1操作过程： （1）浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 （2）浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。（3）萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 （4）干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为-0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 1.2紫杉醇粗制工艺步骤 1.2.1操作过程 （1）配料、装柱：将紫杉醇浸膏约100kg按物料、重量比1：1的比例加入100-200目的硅胶搅拌均匀，真空干燥，装柱。 （2）一次层析、浓缩：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷
紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。
抗癌药物 ——紫杉醇 一、前沿 1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。 紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机理，现主要用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌等癌症。紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基。其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。先后共有30多个研究组参与研究，实属罕见。经20多年的努力，于1994年才由美国的R．A．Holton与K．C．Nicolaou两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和I．Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。6条合成路线虽然各异，但都具有优异的合成战略，把天然有机合成化学提高到一个新水平。 紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗.紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物,其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐,使其成为20世纪下半叶举世瞩目的抗癌明星和研究重点,包括寻找新的生物资源、化学全合成、半合成、衍生物制备、生物转化、生物合成、生物工程、构-效关系研究、作用机制研究、药理学和药效学等研究.2011年是发现紫杉醇结构40周年,对紫杉醇发现的曲折历史过程进行回顾和总结,以纪念这一伟大发现并纪念为紫杉醇的研究与第二代紫杉醇的开发作出贡献的科学家。 二、紫杉醇的制备 1.1 天然红豆杉植物提取 紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种的提取红豆杉属植物共11种，我国有4种及1种变种，它们分别是云南红豆杉、西藏红豆杉（又名喜马拉雅红豆杉）、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉（又名美丽红豆杉）。由于这些植物数量极少，自身繁殖率低，生长缓慢，且紫杉醇的含量又极低（每千克干树皮最多只能得到50~150mg 的纯紫杉醇），生产1g紫杉醇需砍伐3~4棵60年树龄的大树。在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物树皮中提取必将给红豆杉属植物的在自然界中的生存带来极大的威胁。但由于从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此，人们可利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题. 1.2人工栽培
紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学
紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀
2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。
紫杉醇综述 摘要：紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机制，它的问世被誉为20世纪90年代国际上的抗癌药三大成就之一。本文综述了近年来对红豆杉的资源概括、抗癌机制、化学成分、制备方法、不良反应等方面的新研究进展，对当前工作中存在的问题进行了探讨。 关键词：紫杉醇、红豆杉、抗癌、植物组培、不良反应 前言 全世界60亿人口中，每年约新增800万癌症患者，600多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。癌症严重地威胁着人类的生命和健康，因此寻找有效的抗癌药物成为研究的热点。早在1958年美国癌症协会就发起一项历时20余年、筛选35000多种植物物种提取物的计划。在计划实施过程中，1963年美国化学家瓦尼和沃尔首次从生长在美国西部大森林中称太平洋杉中分离到了紫杉醇的粗提物。并发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性。由于该活性成份含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇。1992年12月紫杉醇被FDA批准上市，目前紫杉醇已成为世界公认的强活性广谱抗癌药物。然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物[1]。 一红豆杉资源 紫杉又名红豆杉、赤柏松，为紫杉科紫杉属长绿针叶乔木，是世界珍稀濒危物种，国家一级保护植物。因其药用价值巨大，世界各国将其列为“国宝”，素有“植物黄金”之称。目前在我国共有4个种和1个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）。但在我国资源并不丰富。 [2]野生红豆杉一般散生在海拔2500-3000米的深山密林中，成材需50-250年，
紫杉醇 商品名：泰素?，Onxal TM 药物分类： 紫杉醇是抗肿瘤化学治疗药物，紫杉醇可分类为，植物碱类药物，紫衫烷类，抗微管生产药物（详见“治疗机制”）。 紫杉醇主要用于治疗： ?乳腺啊 ?肺癌 ?膀胱癌 ?前列腺癌 ?黑色素瘤 ?食道癌 ?卡波氏肉瘤 ?各种实体肿瘤 如果该药物已经批准使用，医生有时会选择使用该药物对于其他诊断，当他们认为紫杉醇可能是有用的时候。 紫杉醇如何给药： ?紫杉醇通过静脉注射或者滴注 ?紫杉醇是刺激性药物，静脉给药会出现血管炎症，如果漏液会出现局部组织坏死。医生，护士在给予紫杉醇时要小心谨慎。当您在使用紫杉醇时，给药部位出现红肿刺痛的情况，请立即联系您的医生。 ?紫杉醇会出现严重的过敏反应，在使用之前遵医嘱服用药物以控制或阻止不良反应的发生。 ?紫杉醇有不同的给药方案和疗程，具体方案请咨询您的医生。 ?紫杉醇没有口服制剂。 ?接受治疗的紫杉醇的量需要通过很多因素来决定，包括：身高，体重，平素的健康情况以及其他健康问题，还有所患癌症的种类。你的医生会制定你所需要接受治疗的疗程和用量。 不良反应：
你需要知道的一些重要的关于紫杉醇的不良反应： ?不是所有的人都会出现说明书所列的所有不良反应 ?不良反应通常可以对其发生的时间，程度等是可以预测的 ?当治疗完成时不良反应是可以恢复的 ?有很多方式可以减少或者阻止不良反应的发生 ?服药的效果和其不良反应的发生和程度没有关系 ?紫杉醇药物的不良反应出现取决于用药的量和用药周期 下列不良反应时大多数病人会出现的（发生率大于30%） ?骨髓抑制（主要是暂时性血细胞数量减少，包括红细胞，白细胞和血小板，会给你带来感染，贫血和出血的风险） ?脱发 ?关节和肌肉疼痛，通常发生在用药后的2到3天，之后会逐渐缓解 ?外周神经病变（手足麻木刺痛） ?轻度的恶心和呕吐 ?腹泻 ?口腔溃疡 ?超敏反应，通常出现发烧，面部潮红，寒颤，呼吸急促，红疹。大部分超敏反应出现在首次滴注紫杉醇的10分钟，如果出现这些症状请立即告知你的医师（通过预先使用药物可以预防和降低超敏反应的发生） 下列不良反应时少数病人会出现的（发生率10-29%） ?脚以及脚踝水肿 ?肝功能异常，出现此类情况请立即停药直至恢复正常 ?低血压（通常出现在首次滴注的3小时） ?放射治疗的区域出现皮肤颜色加深（放疗增敏） ?指甲改变（通常出现指甲下方皮肤皮肤发白） 最低点出现在15-21天 以上的情况包括一些常见和少见的使用紫杉醇后出现的不良反应，那些出现率小于10%的不良反应没有在此列出，然而，你应该通知医生如果你出现任何异常的症状。
紫杉醇（paclitaxel，商品名Taxol）是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年，Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效，1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而，在实际药物生产中，紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先，紫杉醇来源匮乏，其主要存在于红豆杉树皮和针叶中，其次，紫杉醇在植物中含量极低，大约为0.010%~0.013%，而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似，要将它们完全分离困难很大。 关于紫杉醇提取分离方法，已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛，在文献 报道的每一种工艺中，几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时，选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析，是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年，Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏，但所报道的分 离效果不是太理想。1995年，Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ，在于寻找一条切实可行的工艺路线，最大程度地提高紫杉醇的回收率，以充分利用有限的红豆杉资源；采用一些高效、经济的提取分离方法，减少过程步骤，快速、简捷地提取出紫杉醇。 1 材料方法 1.1 材料 红豆杉树皮提取浸膏，云南张峰植物加工厂；紫杉醇对照品，纯度大于95%，Sigma；固 相萃取柱（C18填料，10ml），大连化学物理研究所；GF254硅胶和粗孔硅胶（100~140目），青岛海洋化工厂；层析氧化铝（200~300目），上海新诚精细化学品有限公司。 DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪，Beckman公司；XZ-6A旋转蒸发器，北京科龙 仪器公司；常压层析系统，Pharmacia公司。 1.2 方法 1.2.1 液-液萃取称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中，加CH2Cl2（浸膏CH2Cl2的重量比为 1：50），充分溶解，再加入与CH2Cl2等量的水，充分混合后静置分层，分液回收有机相，弃 水相。有机相再加水萃取，重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压蒸出回收，所得固相物溶解 于甲醇中，用HPLC作定性定量分析。 1.2.2 固相萃取固相萃取过程包括四个步骤，即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化：取乙酸乙酯10ml加入柱中，抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml（乙酸铵水溶液），将液面维持在胶层上1~2mm。上样及淋洗：将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中，取0.5ml加入柱中
紫杉醇 【中文名称】：紫杉醇 【英文名称】：Paclitaxel 【定义】：从紫杉(Taxus brevifolia)的树皮中提出的一种化合物。是微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定。 【所属】：属于萜类，双萜生物碱 【分子式为】：C47H51NO14，分子量：853.90 【结构式】： 【理化性质】：从甲醇析出针状结晶或无定形粉末；熔点213～216℃(分解)； [α]D20-49°(甲醇)；UV最大吸收(甲醇)：227，273nm(ε29800， 1700)；为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮 等有机溶剂 【结构特点】：含有酯键，对碱不稳定；含有环氧丙烷环，具有抗癌活性；含有的N原子处于酰胺状态，不显碱性；紫杉醇结构中无苷键，对酸 相对稳定；紫杉醇可与MnO2发生氧化反应，且不易还原。 【高效分离纯化紫杉醇的方法】 包括：ａ、萃取，以红豆杉为原料获得含有紫杉醇的提取物；ｂ、去除胶质，除去提取物中的胶质杂质；ｃ、分离纯化。 紫杉醇生产工艺如下： 红豆杉树皮粉碎（越细越好），８５％～９５％酒精，３５－５５℃热回流浸提三次，５０－７０℃真空减压浓缩至热测比重１．１～１．２
ｇ／ｍｌ，氯仿萃取，萃取液浓缩成膏状，得紫杉醇含量１％氯仿膏，将紫杉醇含量１％氯仿膏加氯仿溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，氯仿－甲醇梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量５～８％半成品，将紫杉醇含量５～８％半成品加丙酮溶解完全，加硅胶搅拌均匀，凉干，过筛，填装到层析柱中，丙酮－石油醚梯度洗脱，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，得紫杉醇含量２０～２５％半成品，用丙酮－石油醚系统结晶３～４次，抽滤，５０℃真空减压干燥，得紫杉醇含量７５～８０％半成品，１６Ｍｐａ压力层析分离，ＴＬＣ检测，分段合并浓缩，目标段浓缩物丙酮－石油醚结晶，抽滤，干燥，得紫杉醇含量≥９９．５％成品； 去除胶质的过程为：高压硅胶层析柱层析去除胶质，同时将紫杉烷化合物分离为紫杉醇、三尖杉宁碱、７－表紫杉醇３部分。 【药理作用】 ①作用机理微管在维持正常细胞功能，包括有丝分裂过程中染色体的移动、细胞形成的调控、激素分泌和细胞受体的固定等具有重要作用。微管蛋白是微管形成的重要基础。紫杉醇就是作用于微管月踢缺管蛋白系统，可促进微管蛋白装配成微管，并抑制微管的解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使仿锤体失去正常功能，导致瘤细胞死亡闭。 ②药效学紫杉醇主要影响L一1210细胞的周期移行，使细胞阻碍断在q期和M期[51。使瘤细胞不能分裂变大，井出现多核细胞，阻断有丝分裂。 ③药效学紫杉醇静脉给药后广泛分布于各组织中，其中肝、脾、肺及大肠中放射性较高小肠、脂肪及骨髓中次之，脑及肌肉中放射性较低。给药后12h尿排泄多于粪中排泄量，给药后72h尿粪中的总排泄量占给药量的74%，.. 胆汁中排泄量在给药后3h即占给药量的59.4%，.. 终末半衰期平均为5.3-17.4ho ④量效关系紫杉醇存在个体差异，AUC波动范围较大[6,7]，在 4.367 一 16.0128mg几.h之间，疗效与剂量无多大关系，而疗效与用药后的即刻浓度(Cmax)有一定关系。提示为了改善病人的疗效而进行血浓度测定，并根据监测结果指导合理用药是必要的。
⒉紫杉醇的分离工艺 红豆杉针叶、树皮、根的采集 原料的干燥及研磨 初级萃取 次级萃取 水相（含键合相）有机相 色谱纯化 纯品紫杉醇 图11-4紫杉醇分离纯化工艺 紫杉醇的分离纯化工作开展较早，最早的分离巩义市1966年采用400根试管的逆流分配色谱法，从12g太平洋红豆杉树皮中提取了少量紫杉醇，历时两年，这种工艺十分琐碎，收率极低。随着相关科学技术的不断发展，分离工艺也获得了很大的改进。一般来说，紫杉醇的分离工艺可以分为粗提和纯化两个阶段，分离纯化过程可用图11-4表示。 ⒊紫杉醇粗提工艺 粗提阶段的目的在于从原料液中尽可能多的提取目标产物，所得到的物料在进行后续的提纯直至获得纯品。粗提过程中初级萃取和次级萃取所采用的溶剂不同可以导致除去杂质不同，不同时期研究者对这两个过程的研究结果列于表11-5中。 目前用于提取紫杉醇的最普遍的初级萃取剂是乙醇（甲醇）和水，采用95:5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间35～60min；采用纯甲醇，所需萃取时间则为16～48h。在大多数情况下还需对甲醇初级萃取物进行次级萃取。一般是在初级萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液-液萃取，该方法可以有效地除去萃取液中50％（质量比）的非紫杉醇烷类物质。如果采用一个较为复杂的分离体系，发现所有的紫杉醇都在氯仿相中。 次级萃取除了可采用各种有机溶剂进行液-液萃取外，还可以采用固相浸取法和超临界流体萃取法。这两种方法的共同特点是有机溶剂用量少，减少了环境的污染。若用枝叶为原料，由于枝叶特别是枝叶中含有许多色素和蜡质，无疑将大大增加紫杉醇的提取分离难度。这要求首先在甲醇粗提取物中加入低极性溶剂如正已烷以除去此物质，该法可除去红豆杉枝叶中多达72%的可溶于正已烷的杂质。 五、正相色谱过程为核心的紫杉醇分离纯化工艺
从紫杉植物中提取紫杉醇的简化方法 红豆杉Taxus又名紫杉，也称赤柏松，生于海拔1000～1200m处的山地，是世界上公认的濒临灭绝天然珍稀植物，从其根、皮、茎、叶中提取的紫杉醇taxol是目前世界上最有效的抗癌药物之一。全球每年大约需要1500～2500kg紫杉醇，而1 kg树皮仅能提取50～100mg。 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ又称10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ，10-deacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ为有抑制肿瘤作用的紫杉烷二萜类化合物。Bissery等报道，可利用10-DABⅢ合成具有比紫杉醇更高抗癌活性的多烯他赛docetaxel。紫杉醇主要存在于树杆和树皮中，10-DABⅢ主要存在于树叶中，其含量大大高于紫杉醇的含量。 红豆杉是国家珍稀保护植物，生长缓慢，如果直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，不仅资源有限，而且不利于资源保护。以10-DABⅢ为原料采用酶催化半合成工艺方法来制备紫杉醇，可大大简化合成过程，使紫杉醇骨架修饰所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和生产率，进而为在更大规模上进行紫杉醇生产提供了技术支持，最终使紫杉醇的化学合成半合成的产业化有了实现的可能。 目前文献报道从各种紫杉植物中提取紫杉醇的方法，均需经过繁冗的分离过程。本实验采用了一种适合于以各种紫杉植物树叶或树枝做原料，通过极性梯度溶剂萃取的方法逐步脱除大量不相干杂质，得到合成紫杉醇的前体10-DABⅢ的方法，然后通过反相层析柱加成，即可获得抗癌活性成分紫杉醇； 材料与方法 1 材料与仪器 南方红豆杉Taxus mairei枝叶取自浙江宁海红豆杉种植基地，8年树龄。10-DABⅢ对照品为Sigma公司产品，纯度98％；所用甲醇；乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、氯仿、正己烷、石油醚、乙腈等均为分析纯试剂。JJ一1精密增力电动搅拌仪，江苏金坛市江南仪器厂；SENCO R一201旋转蒸发仪，上海申顺生物科技有限公司；玻璃硅胶柱为2cm×40cm，杭州常盛科教器具厂；UV一2802PC／PCS型分光光度计，UNICO上海仪器有限公司；Sigma一3K18低温离心机4℃，转速18000rmin；LabAlliance高效液相色谱仪美国SSI公司。 2 实验方法 取南方红豆杉枝叶研磨成细粉，于燥保存。称取100g红豆杉细粉，45℃烘干，石油醚预处理，5L甲醇冷浸，辅以搅拌，超声40min，反复2次。浸渍液过滤，减压浓缩至100mL。加入75 mL正己烷萃取分液，重复操作2～3次。弃去正己烷层，萃余液旋干溶剂，制成浸膏。加入氯仿与水的混合液1：1反复提取。氯仿层减压浓缩至10～15mL上柱，用硅胶正相色谱柱分离。分段收集洗脱液，紫外监测，收集有效段合并浓缩，在甲醇／水中重结晶。 3 分析测试方法 采用反相高效液相色谱RP―HPLC方法检测。分析柱为Kromasil C18柱250mm×4.6 mm，5μm，流动相为乙腈-水30：70，流速为2.0 mLmin，每次进样体积为10μl，进样间隙用纯乙腈对柱子进行梯度冲洗。紫杉醇最大吸收波长为227nm，检测器测定波长为232nm，温度30℃，相关数据计算均采用峰面积归一化法。 结果 1 预处理 由于红豆杉枝叶中含有大量蜡质、植物色素诸如叶绿素等低极性杂质，故在提取前应首先加入低极性溶剂如正己烷、石油醚浸泡脱脂，以除去大量存在的此类非极性杂质，简化后续操作。该法可除去红豆杉枝叶中多达72％的极性比10-DABⅢ小且可溶于正己烷的杂质。 2 有机溶剂粗提 目前用于紫杉烷类物质提取的最普通的初级萃取剂是乙醇甲醇和水，Xu等采用的是体积比95：5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间为35~60min；而Hoke等和Powell等都选择的是纯甲醇，所需萃取时间为16～48h。将南方红豆杉枝叶的细粉在45℃烘干，甲醇浸渍，搅拌过夜。在搅拌的不同时间内其提取出的10-DABⅢ的含量。可以看出，有机溶剂粗提时的浸渍搅拌时间应以12h左右为佳。
紫杉醇 1.紫杉醇的发现和历史 2.紫杉醇的化学结构 3.紫杉醇的提取分离方法 4.紫杉醇的合成研究 5.常见的几种紫杉醇药物 6.个人感想 1.紫杉醇的发现和历史 紫杉醇是红豆杉科红豆杉属植物的次生代谢产物，这类植物主要分布于北半球的温带至亚热带地区，全世界共有11种。最初，紫杉醇是从短叶紫杉（Taxus brevi folia）的树皮中分离获得的，在它的抗癌作用被发现之前，林木工人通常把它砍了当柴烧或者用来做篱笆。早在1856年德国科学家Lucas·H开始对Taxus baccata Linn(浆果红豆杉)进行化学研究，并从其叶片中提取出粉状碱性成分Taxine,但在随后的100多年里没有多大的研究进展。直到20世纪60年代，随着光谱技术的飞速发展，科学家才开始对红豆杉属的植物有了比较深入的研究。20世纪初，人们发现美国西部山区的一个有一片红豆杉林的小城镇中的居民很长寿，他们的寿命最短的在95岁以上，绝大多数的人寿命超过100岁，而且百岁老人随处可见。科学家到那里考察发现当地居民除了两个与其他地方居民不同的生活习惯外，其余的都差不多。一是当地居民喜欢采摘山林中的红豆杉树叶泡茶喝；二是经常去红豆杉林中散步或运动。这种现象引起了科学家对红豆杉的研究兴趣，他们从红豆杉树皮中提取出一种对许多类型的肿瘤细胞有细胞毒作用的提取物——紫杉醇。后来研究表明其化学结构为紫杉烷类中的一种四环二萜类化合物【1】。 1962年8月，在美国农业部任职的植物学家Barclay响应由美国国立癌症研究所（National Cancer Institute ,NCI）发起的植物提取物抗癌活性成分筛选研究,收集了7Kg太平洋紫杉的树皮寄回了NCI。这些样品后来经NCI北卡罗莱纳州“研究三角学院”（Research Triangle Institute ,RTI）分馏实验室的美国化学家Wani博士和Wall博士。他们分离提取得到紫杉醇的粗提物，在筛选实验中他们发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的抑制活性，有强烈的KB细胞毒作用及抗小鼠肉瘤和抗白血病活性。1966年9月，他们分离出了一个有活性得到纯化合物，并确定了其分子式为C47H51NO14，但是得率很低，只有万分之零点四。1967年6月，Wall将这个化合物命名为紫杉醇（taxol），-ol表示醇类（因为他们确信其有一个醇羟基），而tax-指它来自taxus。1971年，Wani和Wall与杜克大学（Duke University）的化学教授Mcphail合作，研究分析并确定其结构。1971年5月，他们在美国化学会杂志（Journal of the American Chemical Society ,JACS）上报道了这个初显抗
紫杉醇提取纯化方法的研究进展 紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四 环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C 47H 51 NO 14 ，分子量853.92。 同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白 聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止 有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。紫杉醇的抗癌机理 1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978 年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。
紫杉醇 紫杉醇，白色结晶体粉末。无臭，无味，难溶于水，易溶于甲醇、乙腈、氯仿、丙酮等有机溶剂。主要以红豆杉为原料的提取物，【从紫杉醇产生菌中提取，化学合成法,利用红豆杉细胞培养生产】英文名称Paclitaxel[,p?kli't?ks?l]，别名泰素，紫素，特素，化学名称5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2R，3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子量853.92，分子式C47H51NO14。 药理作用机制：紫杉醇可使微管蛋白【组成微管的蛋白质】和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，诱导与促 进微管蛋白聚合、微管装配，防止解聚，使微管【一种具有极性的细胞骨架，微管的功能：维持细胞形态，辅助细胞内运输，与其他蛋白共同装配成纺锤体，基粒，中心粒，鞭毛，纤毛神经管等结构】稳定，从而阻止癌细胞的生长。 紫杉醇的衍生物：多烯紫杉醇是在对紫杉醇结构改造过程中合成出来的紫杉醇衍生物，生物利用度好，毒副作用小。紫杉醇的应用：紫杉醇是目前国际上抗癌效果最好，广谱性强，副作用较小，是作用机制全新的一种理想抗癌药物， 主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。目前应用相对比较成熟的有以下一些方面： 1.在治疗卵巢癌方面，紫杉醇早已经是卵巢癌治疗得到首选药物了。经过了许多临床试验表明，不管是单一使用还是联合用药，都远好于传统化疗法治疗这种癌症。紫杉醇还可联合顺铂治疗晚期卵巢癌,紫杉醇是一种新型的具有抗微管作用的抗肿瘤药物。 2.在治疗子宫颈癌方面，紫杉醇的地位没有像治疗卵巢癌那么重要，但是随着紫杉醇在这方面的应用的增加，它的地位也日显重要。在子宫颈癌治疗的研究有三方面：对于局限性晚期宫颈癌的先期化疗应用，晚期或复发性病例的治疗以及放射治疗的增敏。 3.在治疗乳腺癌方面，紫杉醇的药效相对较高，单药效大于一半，在治疗此类的药物中药效算是较好的一种。为了更好的使用紫杉醇治疗乳腺癌，紫杉醇配合其他药物使用效果会更好，比如紫杉醇加表阿霉素治疗进展期乳腺癌效果令人很满意，不良反应相对较小，对既往蒽环类耐者仍有效，值得临床推广应用。 4.在肝癌治疗方面，紫杉醇对人肝癌SMMC-7721细胞有着重要作用，可以抑制肝癌细胞的生长和增殖，并引起此类细胞出现细胞凋亡现象，达到控制并破坏肝癌细胞效果。紫杉醇对人肝癌SMMC-7721细胞有诱导凋亡的作用，以此达到治疗肝癌的效果。 紫杉醇的医疗应用远不止以上几个方面，还有治疗：局部晚期非小题细胞肺癌，晚期胃癌，食道癌等方面，都得到了广泛的应用。但是紫杉醇的使用也像其他药物一样存在副作用，只要有的不良反应有骨髓抑制，关节痛，肌肉痛，心脏毒性，神经系统毒性及胃肠道反应等。但相对其他药物的副作用是较小的，很有应用价值，也是最容易被接受的。 临床研究表明在应用紫杉醇类药剂的同时给病人服用麦芽硒【麦芽硒能阻断多种致癌因素诱导的DNA损伤,起到防癌 作用，即起到抗癌细胞增殖的作用】可以帮助降低心血管毒性和肠胃反应，部分癌细胞对于紫杉醇敏感度较低，这时麦芽硒可以起到帮助控制杀灭这类癌细胞的作用，另一方面它对于提高白细胞的活性也已经得到证实。 研究现状：当前紫杉醇的研究主要有两个方面：一方面是在对紫杉醇的生产及获取方面的研究；另一方面是对紫杉 醇的临床应用的研究探索。对于治疗方面的研究存在不小的价值,只要进一步寻找剂量的使用和疗效之间的关系，跟其他药物协同治疗【例如麦芽硒】癌症的研究和尽可能减小副作用等方面的研究。在剂量方面，现在研究学者对治疗癌症选用大剂量好还是选用小剂量好的问题上，还无法弄清楚。随着紫杉醇的研究的深入，相信在不久将来会给数以万计的癌症患者带来更大佳音。
紫杉醇提取工艺优化研究 赵万年 S1315004 立体依据 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是Wani等[1]于1971年首次从短叶红豆杉(Taxus Bravifolia Nutt.)中分离得到的一种复杂的次生代谢产物，属二萜类化合物。其抗癌机理独特[2]，活性广谱高效，是目前所发现的惟一一种具有促进微管双聚体装配成微管, 使微管稳定, 从而阻碍细胞分裂, 将癌细胞停止在G2晚期或M期，最终导致癌细胞死亡[3]，抑制肿瘤生长的作用。由于紫杉醇的作用机理独特、疗效显著，因此已用于转移性卵巢癌、乳腺癌等的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得了较大的进展［4-6］，但是要实现这些技术的工艺扩大和工业放大生产还存在一些问题，而从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。但是，紫杉醇在植物中的含量非常低(含量最高的红豆杉树皮也只有万分之几)[7]，且类似物多，具有热敏性，产物在中间过程中易于分解、变性，不同产地、不同季节的植物资源成分相差甚远，因此分离提取工作难度很大。 目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化学反应法[8-10]。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已经成功应用于工业生产，但仍需改进。本课题以乙醇为提取溶剂，探求从南方红豆杉树叶中浸取紫杉醇的最佳提取条件，旨在为南方红豆杉这一药用植物资源的开发与利用提供试验依据。 研究目标 采用乙醇浸提方法，考查粉碎度、乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间
第七章 7.4 紫杉醇的生产工艺 7.4.1 概述 紫杉醇（Paclitaxel，Taxol?，图1），最早是由美国化学家Wani 和Wall于1971年从太平洋红豆杉的树皮中提取到的一种具有抗肿瘤活性的物质。它具有独特的抗癌机制，其作用位点为有丝分裂和细胞周期中至关重要的微管蛋白。紫杉醇能促进微管蛋白聚合而形成稳定的微管，并抑制微管的解聚，从而抑制了细胞的有丝分裂，最终导致癌细胞的死亡。紫杉醇1992年12月被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌。1994年，批准用于治疗转移性乳腺癌，1997年FDA批准使用紫杉醇治疗爱滋病关联的Kaposi's恶性肿瘤；1998年和1999年，FDA又分别批准半合成紫杉醇与顺铂联合使用作为治疗晚期卵巢癌和非小细胞肺癌的一线用药。紫杉醇是近几年国际公认的疗效确切的重要的抗肿瘤药物之一。 -五羟基-紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯-2-苯甲酸酯-10-乙酰基-13-a,13b,7a,4a,2b,20-环氧-1b紫杉醇具有复杂的化学结构，整个分子由三个主环构成的二萜核和一个苯基异丝氨酸侧链组成。分子中有11个手性中心和多个取代基团。分子式C47H51NO14，分子量853.92，元素百分比C：66.41，H：6.02，N：1.64，O：26.23。化学名：5 [(2′R,3′S) -N-苯甲酰基-3′-苯基异丝氨酸酯] 紫杉醇的来源最初以天然提取为主，主要是从由红豆杉属植物的树皮中分离得到。红豆杉植物是生长极为缓慢的乔木或灌木，其树皮中紫杉醇的含量平均为万分之一点五，从中提取紫杉醇的收率大约为万分之一，这样制取1 kg紫杉醇就需树皮10吨，这种生产紫杉醇的方法严重破坏资源和环境。目前，包括我国在内的许多国家都已经禁止或严格限制用这种方法来生产紫杉醇。为解决紫杉醇的大量供应问题，人们曾探索通过组织和细胞培养、化学合成等方法制取紫杉醇。其中，化学合成是人们首先想到的解决紫杉醇药源问题的一条途径。这里的化学合成又有全合成和半合成之分。 如前所述，紫杉醇的分子结构十分复杂，分子中有众多的功能基团和立体化学特征，如此复杂的结构堪称是对化学合成的一个挑战。1994年，紫杉醇的全合成在实验室获得成功[1，2]。到目前为止，文献报道的紫杉醇的全合成路线共有3条，即1994年由Holton和Nicolaou研究组几乎同时完成的2条路线以及1996年Danishefsky小组报道的路线。紫杉醇的全合成中，反应步骤多达20—25步，大量使用手性试剂，反应条件极难控制，制备成本昂贵，虽然具有重要的理论意义，但不适合大规模工业生产。 为了避免合成紫杉醇复杂的母环部分，人们探索了半合成的制备方法。研究发现，红豆杉植物中除紫杉醇外，还有大量母环结构与紫杉醇类似的化合物，其中，最重要的是巴卡亭