小鼠胚胎成纤维细胞的分离和饲养层细胞的制备
张学明,李德雪,赖良学,李子义,文兴豪,杜惜明,曾发贵
(解放军农牧大学基础部组胚教研室,吉林长春130062)
关键词:胚胎成纤维细胞;饲养层;小鼠
摘 要:通过实验确定分离小鼠胚胎成纤维细胞的最适胚龄,探讨小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的效果及其寿命。结果表明,从10、11d小鼠胚胎所获的胚胎成纤维细胞中混有大量神经母细胞和红细胞;用14、15d的胚胎则基本不能获得胚胎成纤维细胞;消化3～4个12～13d胚胎所获细胞悬液可接种8～9个25cm2的培养瓶。从一只孕鼠的所有胚胎所获的成纤维细胞可接种约20个25cm2的培养瓶。所获细胞悬液的活细胞百分率可达90%,接种成活率达85%。胚胎成纤维细胞贴壁时间为5～6h,12h后进入增殖期,48h形成细胞单层。ES细胞克隆在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上形态典型、增殖迅速、不分化。饲养层寿命可维持2～3周。
中图分类号:S865.13 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(1999)09-0005-02
目前,体外培养已成为人们研究细胞的分裂增殖、发育分化、运动以及衰老死亡过程调节机制的不可缺少的手段。对一些特殊细胞如胚胎干细胞、[1]原生殖细胞[2]及哺乳动物各种组织的干细胞,为改善其体外环境,往往需要将其接种在一定的饲养层细胞上。养层细胞能够分泌L IF和a-FGF、b-FGF 等生长因子,具有同化培养液,改善接种细胞生长环境和抑制细胞分化的作用,因此用途广泛。经常用来制作饲养层的细胞有S TO(一种已建系的小鼠胚胎成纤维细胞)、小鼠原代胚胎成纤维细胞等。[3]用STO细胞系制作饲养层具有细胞性状稳定均一、寿命较长等优点。但目前国内ST O细胞使用不多,价格较贵,不易获得。因此,小鼠原代胚胎成纤维细胞不失为其很好的替代品。关于用于分离小鼠胚胎成纤维细胞的适宜胚龄,一般资料[1,3]均报道为12～15d,日龄范围较大,用此范围内的小鼠胚胎有时根本不能获得足够的细胞,因而会延误时间,浪费有限资金。实验以小鼠胚胎为主要实验材料,确定了分离原代胚胎成纤维细胞的最适胚龄,很好地解决了上述问题;同时以小鼠胚胎干细胞(ES细胞)为被培养细胞,探讨了所做饲养层的效果及寿命等问题。
1 材料与方法
1.1 材料
实验用昆明白小鼠购自解放军农牧大学实验动物中心,自然交配后准确记录怀孕天数,按常规方法饲养管理。ES细胞为农牧大学组胚教研室冻存。主要设备及药品有B5060EK/ CO2培养箱(Bereich T hermo tech),倒置显微镜(重庆),胰蛋白酶(1:250,Sigma),D-M EM(Gibco),新生牛血清(NBS, G ibco),胎牛血清(F BS,Gico),L(+)谷氨酰胺(中国医药公司),丙酮酸钠(天津苏庄化学试剂厂),核苷酸(Sigma),β-巯基乙醇(Gibco),注射用青霉素钠(国营天津华津制药厂,160万IU),注射用硫酸链霉素(大连制药厂,100万I U),二甲基亚酚(DM SO,天津化学试剂一厂),丝裂霉素C(Boehring er M annheim)。
收稿日期:1999-05-07
基金项目:国家自然科学基金项目,项目编号:39770554.
作者简介:张学明(1972-),男(汉族),解放军农牧大学组胚教研室96级在读硕士,目前正从事小鼠精原干细胞的研究.1.2 方法
1.2.1 分离培养 分别取妊娠10、11、12、13、14、15d母鼠断颈处死,无菌取出一侧子宫,置于盛有PBS的培养皿中;用尖镊子撕开子宫壁和胎膜,取出3～4个胎儿,仔细去除胎儿的头、尾、四肢、心脏及所有内脏;PBS漂洗数次,洗净血污后将组织充分剪碎;加入0.25%try psin-EDT A消化液,在37℃下孵育10～15min,加入新鲜培养液(D-M EM+10%N BS+1%青链霉素)8mL,用吸管用力吹打15～20次,移入10mL离心管中静置3min;吸取上清液接种于15mL培养瓶中,在37℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度条件下培养;每隔2～3d传代一次。
1.2.2 冻存与复苏 培养2～3代后收集细胞,转入冻存液(4 mL N BS+2mL DMSO+14m L D-M EM),分装于冻存管中;将冻存管用保温材料包裹,置-70℃低温冰箱中过夜,再转入液氮中保存。复苏时,从液氮中取出冻存管,立即放入37℃温水中,不停搅动,令其快速解冻;将细胞悬液转入10mL离心管中,1000r/min离心3min,弃上清,加入新鲜培养液,吹起接种后传1～2代。
1.2.3 饲养层的制备 细胞接近80%汇合时,吸去培养液;加入5μg/mL丝裂霉素C1mL(2μg/2×106个细胞),继续培养1.5～2h,使其失去增殖能力;用PBS清洗至少3次,加入消化液,在培养箱中孵育2～3min;加入新鲜培养液,吹打成单细胞悬液;调整细胞密度至3×105后重新接种,放入培养箱中继续培养24h之后即可使用。
1.2.4 ES细胞的复苏及接种 ES细胞的复苏方法同胚胎成纤维细胞。ES细胞复苏后须用培养液(D-M EM+10%F BS +0.1mMβ-巯基乙醇+核苷酸[4]+4mM谷氨酰胺+1mM 丙酮酸钠)洗2次,以避免残留冻存液对细胞的损害。然后将其接种在已制备好的饲细胞层上,培养条件同前。
2 结果
2.1 细胞收获量及活细胞百分率
用10d及11d的胚胎可获得大量细胞。但除了成纤维细胞外,其中还混有大量的神经母细胞及红细胞。前者迅速生长后形成许多大小不一的细胞集落,可伴随胚胎成纤维细胞的生长而生长;后者则成团、成串存在,3～4d后逐渐死亡消失。用12d、13d的胚胎获得了大量高纯度的胚胎成纤维细胞。一般
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小鼠胚胎成纤维细胞的分离和饲养层细胞的制备-张学明DOI:10.13881/https://www.doczj.com/doc/905670140.html, ki.hljx m sy.1999.09.003
消化3～4个13d胚胎所获细胞悬液可接种8～9个25cm2的培养瓶。每个昆明白种孕鼠一般可获取8～10个胚胎。因此,由一只孕鼠所获的细胞可接种约20个25cm2的培养瓶。4次实验的平均值表明,所获细胞悬液的活细胞百分率可达90%,接种成活率85%。用14d、15d的胚胎基本不能获得胚胎成纤维细胞。一般同样条件下消化吹打后,培养液中基本无细胞;增加消化时间后,培养液中出现大量组织或细胞碎片和极少量胚胎成纤维细胞,但这些细胞状态极其不良,表现为细胞内颗粒增多,细胞轮廓增强,生长缓慢。
2.2 成纤维细胞的贴壁时间及其形态
胚胎成纤维细胞接种后,游离期一般为3～4h,5～6h后绝大部分细胞贴壁,12h之后即可进入增殖期,细胞增殖较快,当达到一定的密度(60～70%汇合)时,生长更为迅速。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。生长旺盛的细胞之间的连接非常紧密,48h后即可形成细胞单层。倒置显微镜下观察,细胞透明,颗粒很少,大多数细胞的胞质形成2个突起,呈长梭形,胞质轮廓不清,核不清楚;细胞稀疏时,在相差镜下观察,可大致分清其轮廓。一般胞体的中心部,即核存在的位置稍稍隆起,立体感强。
2.3 ES细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上的培养效果
ES细胞接种在小鼠胚胎原代成纤维细胞制作的饲细胞层上之后,一般约48h,最迟3～4d即可出现典型的ES细胞克隆。克隆内细胞紧密地聚集在一起,细胞间界限不清,形似鸟窝,克隆周边与饲细胞层界限清楚,无分化迹象。ES细胞克隆一旦出现,即可快速生长。表现为克隆逐渐增大,中央逐渐隆起。一般3～4d后,饲细胞层上即可布满大量的克隆。此时宜即时传至新的饲细胞层上或立即冻存。
2.4 饲养层细胞的寿命
用丝裂酶素C处理胚胎成纤维细胞制作的饲养层细胞,其一般性状均无明显变化,只是不再发生增殖。饲细胞层制备后,恢复培养24h之后即可投入使用。细胞胚胎成纤维细胞在体外可分裂15～20次,使用寿命可达2～3周。一般3周后细胞逐渐衰老,表现为胞质内颗粒物质增多,透明度变差;胞质内积聚多量的脂肪滴,脂滴很大时可将胞质及核挤到一侧;细胞轮廓增强,逐渐收缩,附壁不牢;最终可从皿底脱落,收缩成一团。3 讨论
对于小鼠胚胎成纤维细胞的分离,所用胚胎的日龄对收获细胞的纯度及收获量影响很大。实验结果表明,用10～11d 的胚胎虽然也能获得大量的细胞,但由于此时胚龄太短,胚胎很小而且太柔软,因此操作极不方便,难以完全去除胎儿的头、尾、四肢及所有内脏,致使获得的细胞内混有大量神经母细胞和红细胞,从而严重影响了所做饲养层的质量。本实验用14～15d的胚胎基本没有获得成纤维细胞。这是因为小鼠的孕期较短,胚胎发育很快,14～15d时其骨骼已经发育,因此组织难以剪碎;其次是因为胚龄越大,细胞之间的连接越牢固,因而难以消化。即使增加消化时间,也只能获得极少量的细胞,而且细胞表现为明显消化过度,状态不良。而选用12～13d的胚胎则完全保证了所获细胞的纯度和产量。体外培养表明,所获细胞可在3～4h内贴壁,12h后进入增殖期。因此可在较短时间内获得足够多的细胞用以制作饲细胞层。实验结果表明, 12～13d的胚胎最适于用于分离小鼠原代胚胎成纤维细胞。此外,在体外培养时,对已进入对数生长期的细胞,应及时制作饲养层或传代、冻存,以避免因密度过大产生接触抑制而使细胞过早老化。培养中应把握传代的最佳时机,即大约80%汇合时就应传代。否则,细胞密度过大会使细胞之间的连接更加牢固而难以再制成单细胞悬液。
ES细胞接种到小鼠胚胎成纤维细胞饲细胞层上后,出现的克隆形态典型、增殖迅速、不发生分化,与使用ST O细胞为饲养层培养ES细胞所获克隆[4]完全一致。表明用小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲细胞层具有良好的抑制干细胞发生分化并促进其增殖的作用,能完全满足干细胞体外培养的需要。
参考文献:
[1] 赖良学.家兔胚胎干细胞的分离培养[D].哈尔滨:东北农业大学动物科技学院,1995,7～8.
[2] M atsui Y,Toksoz D,Nishikaw a S,et al.Effect of steel factor and l eukaemia inhibitory factor on mu rine primordial germ cells in culture[J]. Nature,1991,353:750～752.
[3] 严云勤,李光鹏,郑小民.发育生物学原理与胚胎工程[M].哈尔滨:黑龙江科学技术出版社,1995.307～308.
[4] R obertson E J.In Teratocarcinomas and emb ryonic stem cells, apractical approach[J].IRL,1988,71～112.
Isolation of Embryonic Fibro blasts of the Mouse and
Preparation ofFeeder Layer
ZHANG Xue-ming,LI De-xue,LAI Liang-xue,DU Xi-ming,LI Zi-yi,WEN Xin-hao
(Faculty of Basic Courses,Uni of Agri and Anim S ci,C hangchun130062,Jilin,China)
Key words:embryonic fibroblast;feeder layer;mouse
Abstract:The presen t experiment w as carried out to investigate properage of the mouse embryos fitted to isolate embryonic fibrobl asts andeffectiveness of embryonic fibroblast feeder layer and their life span.The results indicated:Embryonic fib robalsts isolated from11,12dmouse embryosblnded with a l arge number of neuroblasts and eryth rocytes.Embryonic fibrobal sts couldnt be is olated from1,15d mouse embryos.T hcell s uspension digested from3～4 embryos of12～13d old w as enoughplanting in8～925cm2flasks.The suspension digested from all embryosof one pregnan t mouse w as enough planting in about20flasks of thesame size.After plan ting,the rate of l iving cells reached at90%and the surviving rate w as85%.he time for cell attachmnt taken place w as5～6h.After12h,fibroblasts began to divide and a monol ayers w asformed by48h.Cultured on the surface of mouse embryonic fibroblastfeeder l ayer, ES cells clonies grew typicall y and fast withoutdifferentiation.The life spn of feeder layer w as about2～3w eeks.(007) 6黑龙江畜牧兽医1999年第9期