（生物科技行业）第十章微生物分类及鉴定帮助你理清基本概念规律
第十章微生物分类及鉴定
一.分类学基础
分类学(taxonomy)：生物分类的科学
微生物分类学(microbialtaxonomy):研究微生物分类理论和技术方法的学科
1.M分类学三个组成部分(既独立又相互关联的三个部分):
分类(classification)
鉴定(identification或determination)
命名(nomenclature)
分类(classification)：根据相似性或相关性(进化亲缘关系)将生物归属为类群或分类单元. 鉴定(identification或determination)：决定某一特定分离物归属于某一已确定分类单元的过程。
命名(nomenclature)：给予分类类群单元与公布规则相符的名称.
2.分类单元及其等级
分类单元(taxon,复数taxa)：是指具体的分类群，如：原核生物界(Procaryotae)、杆菌科(Enterobacteriaceae)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等都分别代表一个分类单元。
国际公认的7个生物分类单元:界(亚界),门(亚门),纲(亚纲),目(亚目),科(亚科),属(亚属),种(亚种).
除此之外,在M的分类中,还常使用一些非正式的类群术语,亚种以下常用培养物、菌株、居群和型；种以上常使用群、组、系等类群名称；近年伍斯还在界之上使用域(domain)，他把全部生物分为古生菌域、细菌域和真核生物域，域下面再分界，把"域"作为分类单元的最高等级。
(1).种(species):物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。
高等生物中，物种通常被看作是彼此杂交能繁殖的自然群体，这个群体与其他群体在生殖上是隔离的。在这里，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准。
微生物的种：菌株的一个集合，这批菌株有许多共同稳定特征，并与其他类菌株有显著区别。有相似G+C组成，DNA杂交同源性在70%以上的菌株的集合。
(2).亚种(subspecies):是正式分类单元中地位最低的分类等级。
当某一个种内的不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传性状而又不足以区分成新种时，可以将这些菌株细分成两个或更多的小的分类单元--亚种。
变种是亚种的同义词。在《国际细菌命名法规》(1976年修订本)发表以前，变种是种的亚等级，因"变种"一词易引起词义上的混淆，1976年后，细菌种的亚等级一律采用亚种，不再使用变种。
(3).属(genus):介于种(或亚种)与科之间分类等级，也是生物分类中的基本分类单元。通常是把具有某些共同特征或密切相关的种归为一个高一级的分类单元，称之属。
(4).科(family):系统分类中，把具有某些共同特征或相关的属归为更高一级的分类单元称为科。
(5).培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。
纯培养(pureculture):单一微生物细胞繁殖产生的培养物.
(6).菌株(strain)：在一个特定分类学中至少与其他一些群体是可以区别的生物群体。是来自单个或纯培养物的微生物，一个种内菌株间在许多方面有小差别。
(7).居群(population)："population"一词也有人译为群体、种群或群丛等，是指一定空间中同种个体的组合。
(8).型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状存在差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。
由于"type"一词既代表"型"又可代表"模式"，为避免混淆，现在对表示型的词作了修改，用"var"代替"type"。现将较常用的型的含义及其表达方式列于表中。
常用型的术语及其含义p322
(9).群(group),组(section),系(series):这些类群名称用在不同场合，常常有非常不同的含义，可以是种水平上的类群，也可以代表属以上等级的分类单元的集合。如《伯杰氏系统细菌学手册》第一版中，主要根据表型特征将全部原核生物分为33组。将假单胞菌属(Pseudomonas)内的90个种分为5组。
3.微生物的命名
(1).命名法则
?所有正式分类单元的学名,必须用拉丁词或其他词源经拉丁化的词命名.
?属名:一般拉丁字名词，字首字母大写,主要特征.
?种名:林奈氏双名法，由二个拉丁字组成，
属名(字首字母大写)+种名加词(全部小写) Pseudomonasaeruginosa,Mycobacteriumtuberculosis,Bacillusthuringiensis 若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp.来表示单数，spp.来表示复数.例如Bacillus sp.
Bacillus spp.
?亚种名:三元式组合;
属名+种名加词+subsp.亚种名加词
Alcaligenesdenitrificans subsp.xylosoxydans反硝化产碱杆菌氧化木糖亚种Bacillussubtilus subsp.nigar枯草芽孢杆菌黑色亚种
?属级以上分类单元的名称:特定的词尾
目alesRickettsiales(立克次氏体目)
科aceaeRickettsiaceae(立克次氏体科)
属Rickettsia(立克次氏体属)
?属名,种名,亚种名印刷体一律斜体.
(2).命名模式
模式:是一定分类单元命名的依据,即对于一个分类单元的命名,应指定一个命名模式,它是该分类单元的基本单元,但不一定是该分类单元中最典型或具有代表性的基本单元.
种和亚种的命名模式是模式菌株;属和亚属的命名模式是模式种;科(以及高于科的分类单元)的命名模式是模式属.
(3).新名称的合格发表:国际细菌命名法规规定,对于一个新名称的有效发表,必须在
InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology(IJSEM)上发表,或其他杂志发表后，必须向IJSEM递交论文拷贝，同时将该菌株培养物保存在美国ATCC或德国DSMZ。
IJSEM每期公布批准的菌种名，并为其收录在Bergey’sManualofSystematicBacteriology 中做好准备。
发表新名称时，应在新名称之后加上所属新分类等级的缩写词，如新目"ord.nov."、新属"gen.nov."、新种"sp.nov."等。例如：Pyrococcusfuriosus sp.nov.表明该菌(猛烈火球菌)是一个新发表的种。
4.细菌分类系统----Bergey’sManual
Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology
1923年宾夕法尼亚大学的细菌学教授DavidBergy和四个同事发表了细菌分类法,至1994年,发行了第9版.从1974年的第8版开始,已经成为世界通用的“官方的分类”。(如1974年第八版，撰稿人多达130多位，涉及15个国家；现行版本撰稿人多达300多人，涉及近20个国家)
Bergey’sManualofSystematicBacteriology
1984-1989年分4卷出版第一版（给出的系统基本上是表型性的），目前正在分5卷出版该手册的第二版（rRNA,DNA和蛋白质，系统发育）。
伯杰氏系统细菌学手册第一版分类大纲p326
伯杰氏系统细菌学手册第二版分类大纲p327
从1984年伯杰氏系统细菌学手册第一版开始发行以来，细菌分类已取得了巨大进展，新命名的种成倍增加、新描述的属也在170个以上，尤其是80年代末以来，rRNA、DNA、蛋
白质序列分析方法日趋实用，因而为细菌的系统发育积累了不少新的资料。
伯杰氏系统细菌学手册第二版中更多地采用了核酸序列资料对分类群进行新的调整，无疑这是细菌系统发育分类的重大进展.
二.微生物分类鉴定的特征和技术
1987年,Wayne等提出:一个种的所有菌株DNA的相似性接近或大于70%, Tm≤5℃(一个正式的微生物种的分子学定义)
1990年,Murry等提出,只根据核酸序列这种系统发育特征来确定一个属或者一个种是不切实际的.属的最初的分类应该依据表型特征,再确切的分类应该依据于分子学特征.
1.形态学特征
(1)培养特征:最重要是菌落特征：如菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽、水溶性色素等.
(2)细胞形态:形态(球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状)大小(其中最重要的是细胞的宽度或直径)排列(单个、成对、成链或其他特殊排列方式)
(3)特殊的细胞结构:鞭毛(有无鞭毛、着生位置及其数量);芽孢(有无芽孢、形状、着生位置、孢囊是否膨大)
孢子(孢子形状、着生位置、数量及排列);其他(荚膜、细胞附属物为柄、丝状物、鞘、蓝细菌的异形胞、静止细胞和连销体等);超微结构(细胞壁、细胞内膜系统、放线菌孢子表面特征等)
(4)细胞内含物:异染颗粒、聚β-羟丁酸等类脂颗粒、硫粒、气泡、伴孢晶体等
(5)染色反应:革兰氏染色、抗酸性染色
(6)运动性:鞭毛泳动、滑行、螺旋体运动方式
2.生理生化特征
以实用为主要目的表型分类中，大量原核生物的属和种，仅仅根据形态学特征是难以区分和鉴别的，所以生理生化特征往往是这些医学上或其他应用领域中重要细菌分类鉴定的主要特征。
(1)营养类型:光能自养、光能异养、化能自养、化能异养及兼性营养型
(2)对氮源的利用能力:对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N2等的利用
(3)对碳源的利用能力:对各种单糖、双糖、多糖以及醇类、有机酸等的利用
(4)对生长因子的需要:对特殊维生素、氨基酸等的依赖性
(5)需氧性:好氧、微好氧、厌氧及兼性厌氧
(6)对温度的适应性:最适、最低及最高生长温度及致死温度
(7)对pH的适应性:在一定pH条件下的生长能力及生长的pH范围
(8)对渗透压的适应性:对盐浓度的耐受性或嗜盐性
(9)对抗生素及抑菌剂的敏感性:对抗生素、氰化钾(钠)、胆汁、弧菌抑制剂或某些染料的敏感性
(10)代谢产物:各种特征性代射产物
(11)与宿主的关系:共生、寄生、致病性等
值得强调的是，由于不少生理生化特征是染色体外遗传因子编码的、加上影响生理生化特征表达的因素比较复杂，所以根据生理生化特征来判断亲缘关系进行系统分类时，必须与其他特征特别是基因型特征综合分析，否则就可能导致错误的结论。
3.血清型和噬菌体型
(1).血清型:细菌细胞和病毒等都含有蛋白质、脂蛋白、脂多糖等具有抗原性的物质
方法:凝集反应;沉淀反应(凝胶扩散、免疫电泳);补体结合;直接或间接的免疫荧光抗体技术;酶
联免疫等
抗原性组分:全细胞、细胞壁、鞭毛、荚膜或粘液层、纯化的蛋白质(以比较不同细菌同源蛋白质之间的结构相似性)。
血清学试验用于微生物分类鉴定主要适用于抗原结构同源程度高(蛋白质同源序列70%以上)的微生物种内血清型的分类鉴定。
例如，根据鞭毛抗原(H抗原)苏云金芽孢杆菌分成40多个血清型；根据荚膜抗原肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)分成近百个血清型；根据菌体(O)抗原、H抗原和表面(Vi)抗原将沙门氏菌属细菌分成约2000个血清型等等。
血清型的划分在流行病的研究中有重要意义。
(2)噬菌体型
噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性，即一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株。
但也存在宿主范围较广泛的噬菌体，是否反映属种间的系统发育相关性及其相关程度，目前尚没有明确的解析。
噬菌斑测定
4.蛋白质分析
蛋白质--大范围的结构和代谢功能.微生物菌株所产生的系列蛋白质在标准条件下电泳，就会产生特征性的电泳区带组成的电泳图谱，亲缘关系相近的菌株，它们的图谱也应相似。蛋白质指纹图(proteinprofiles，proteinfingerprinting)，已成功地应用于种和种以下分类和鉴定。对于属以上分类单元的分类或鉴定效果较差。
由于蛋白质的表达受环境因素的影响,标准的生长环境是必须的.
细菌分类鉴定研究中，常采用：
(1)可溶性蛋白或全细胞蛋白提取液进行电泳图谱比较；
(2)比较同功酶的电泳迁移率。
Whole-cellproteinprofiles
Outer-membraneproteinprofiles
5.核酸分析
(1)．质粒分析
?Plasmidprofiles
?Plasmidfingerprints
(2).G+Cmol%：
若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。
常用方法：熔点温度（Tm）测定法;CsCl浮力密度离心法
(3).染色体DNA分析
Chromosomalfingerprints
RandomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD,随机扩增多态性,9-10mer,WilliamsJGK1990)
Arbitraryprimer-PCR(AP-PCR,任意引物PCR,>20mer,WelshJ1990) DNAamplificationfingerprinting(DAF,DNA扩增指纹,5-21mer,Caetano-Anolles,1991) (4).核酸杂交
探针(probe)
核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链DNA或RNA分子。它是能与被检测的特定核苷酸序列(靶序列)互补结合，而不与其他序列结合的带标记的单链核苷酸片断。根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定。
?染色体基因组→限制性内切酶消化→电泳→分析谱系
?探针杂交:RNA探针;cDNA探针;寡核苷酸探针;基因组插入序列.
许多资料表明：DNA-DNA杂交同源性在60%以上的菌株可以认为是同一个种；同源性超过70%为同一亚种；同源性在20～60%是同属不同种的关系。
(5).rRNA的序列分析
生物大分子蛋白质、RNA和DNA序列，被看作是分子计时器(molecularchronometers)或进化钟(evolutionaryclock)，它们真实地记录了各种生物的进化过程。因此，我们可以通过比较不同类群的生物大分子序列的改变量来确定它们彼此系统发育相关性或进化距离。在众多的生物大分子中，最适合于揭示各类生物亲缘关系的是rRNA，尤其是小核糖体亚单位RNA(16SrRNA,18SrRNA)。
小核糖体亚单位RNA(16SrRNA,18SrRNA)被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”，这是因为：
?rRNA具有重要且恒定的生理功能。
?在16SrRNA(18SrRNA)分子中，高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；
?16SrRNA(18SrRNA)分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)，便于分析。如细菌5SrRNA（约含120个核苷酸）、16SrRNA(约含1540个核苷酸)、
23SrRNA(约含2900个核苷酸)。
?(4)16SrRNA(18SrRNA)普遍存在于真核生物和原核生物中因此它可以作为测量各类生物进化的工具（分子尺）。
这把"尺子"是美国学者伍斯(CarlWoese)70年代首先发现的，他用这把尺子对微生物系统发育进行了开拓性研究，发现了生命的第三种形式--古细菌。
特征序列或序列印记（signaturesequence）：通过对rRNA全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。
特征序列有助于迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位。
CarlWoese的rRNA进化树完美无缺？随着越来越多的微生物的全基因组序列的测定，人们发现生物在进化中存在着非常广泛的水平基因转移现象，很多科学家都认为不能仅靠对16SrRNA的序列比较来确定生物之间的亲缘关系，还必须借助各种信息对这个进化树进行改进。
网状树，基因的水平转移用横向树枝代表，树的基部有几个树干代表几个形成最初基因库的原始细胞组，代替了一个单一的主树干或相同的祖先。
6.化学分类特征：
(1).CW组分分析(目前主要应用于放线菌)：
根据放线菌细胞壁的化学组成和全细胞水解液糖型，将放线菌CW分为9型。
(2).磷酸类脂类分析：CM上的磷酸类脂5型
PE磷酯酰乙醇胺
PME磷酯酰甲基乙醇胺
PC磷酯酰胆碱
PG磷酯酰甘油
GluNu含葡萄糖胺未知结构的磷酸类脂
(3).枝菌酸分析：诺卡氏型放线菌（CWIV型）细胞抽提物中高分子脂肪酸
βα
R1-CH-CH-COOH
OHR2
Nocardia50个碳原子诺卡氏枝菌酸
Mycobacterium80个碳原子分枝杆菌枝菌酸
Corynebacterium30个碳原子棒状杆菌枝菌酸
(4).醌型分析:
1-14个异戊烯单位不等,多烯链上氢的饱和度不等
甲基萘醌:MK-9,MK-9(H2),MK-10(H4)
三．微生物的快速鉴定和自动化分析技术
1.微量多项试验鉴定系统（简易诊检技术，数码分类鉴定法）
针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反应底物、试剂等，分别微量(约0.1ml)加入各个分隔室中(或用小圆纸片吸收)，冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。试验时加入待检测的某一种菌液，培养2-48小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此结果编码，查检索表(根据数码分类鉴定的原理编制成)，得到鉴定结果，或将编码输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结
果。
MicrobialID/Characterization
（Carbonsourcemetabolicfingerprints）TheBiologSystemscanrapidlyidentifyover1,900speciesofaerobicandanaerobicbacteri a,yeasts,andfungi.
2.数值分类(numericaltaxonomy)
(1).数值分类法：
通过广泛比较分类单位的性状特征，然后计算它们之间的相似性，再根据相似性的数值划分类群的一种分类方法。
取代等级分类中特征对于分类的不同水平，数值分类在对于所有的特征都等量处理的基础上，进行生物之间的相似性的比较。
(2).数值分类五个步骤：
①确定分类单位和选择分类特征。数值分类最低等级的分类单位称操作分类单位(OUT,operationaltaxonomicunit)，OTU可以是菌株，也可以是种或属等。OTU确定后即选择分类特征，数值分类要求特征函盖面广,数目多(50-100以上);
②进行特征测定或从文献中收集有关OTU的各项特征的资料；
③根据所编制的计算机程序要求，将特征资料进行编码、标准化并输入计算机；
④由计算机计算各OTU之间的相似性并根据相似性的数值进行聚类分析、分群归类；
⑤输出分类结果。树状谱图法.
(3)数值分类的比较方法：
匹配系数方法
（matchingcoefficientmethod）
相似系数方法
（similaritycoefficientmethod）
匹配系数对于2个比较菌株都是阳性或都是阴性的特征计算在内，而相似系数不计算2个比较菌株都是阴性的特征，该方法认为如果对于2个比较菌株而言，都是阴性的特征根本就是不合适的比较特征。
大量的数值分类系统采用相似系数方法。
(4)．数值分类的优点和局限:
?存贮、分析、处理极为错综复杂的庞大数据;
?自动输出鉴定结果;
?工作效率高;
?奠定了微生物鉴定的快速、准确、自动化的基础。
?局限:计算机用于微生物鉴定严格说目前应是辅助鉴定，因为它不能代替人进行微生物特征的试验，而取得原始数据资料。