标本采集和保存技术要求一览表

附件1

注：

1、以上标本分别用于开展病毒和细菌等病原体检测

2、采集咽拭子标本、下呼吸道标本、痰液、心脏穿刺组织、肺穿刺组织、心包液、胸腔积液使用的样品保存液应不含抗生素或不用样品保存液，现场无菌接种，并将接种后剩余的标本立即冷冻（-20℃以下）保存。漱口液、尿标本和粪便标本现场无菌接种，并将接种后剩余的标本立即冷冻（-20℃以下）保存。

附件2

手足口病例标本送检登记表

患者姓名性别出生日期年月日（阴/阳历）

家长姓名家庭住址市乡（镇、街办）村（居）号

家庭电话

发病日期年月日

初诊日期年月日；初诊单位（省级/市级/县级/乡级/村级）初步诊断：_______________________________

住院治疗（是/否），如住院，则：

入院日期年月日，入院诊断

出院日期年月日，出院诊断

病程天

预后：痊愈/好转/未愈/死亡/其他；后遗症（有，；无）

标本统一编号：

注：送检标本编号为“标本统一编号+标本类型”，其中“T”为咽拭子代码，“S1”为急性期血清代码，“S2”为恢复期血清代码，“F”为粪便标本代码，“CSF”为脑脊液代码，“H”为疱疹液代码。

采样人：采样单位：送样人：

附件3

手足口病实验室检测方案

（试行）

为规范手足口病的标本采集、运送及实验室检测操作程序，提高检测准确性，从而为手足口病的明确诊断和相关实验研究提供可靠的依据，特制定本方案。

手足口病的实验室检测原则和程序

手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合适的临床标本，或无法进行病毒分离，也可以通过血清学检测（如中和实验）来检测血清中的中和抗体，或直接从临床标本中检测病毒的核酸来诊断（见下图：手足口病的实验室诊断流程图）。

一般是由省级病毒实验室进行病毒的分离，爆发疫情范围较大时，国家参比实验室也可以提供技术支持。病毒分离成功后，送至国家参比实验室进行鉴定或复核，同时对全国手足口病的病原进行病毒学监测。国家参比实验室接到标本后，在30日内将结果反馈给省级实验室。

很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD细胞（对CA16和EV71敏感）、HEp-2细胞（对某些柯萨奇B组病毒敏感）等，联合使用上述两种或更多细胞（如Vero细胞）有助于分离到更多的肠道病毒。

使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验是肠道病毒鉴定的基本方法，如果使用了适当的抗血清，实验结果是比较可靠的。因为肠道病毒包括若干个血清型，通常使用组合抗血清进行鉴定，有些组合抗血清已经商品化。

当无法进行病毒分离或得不到适用于病毒分离用的标本时，血清学检测可以为肠道病毒的感染提供一个间接的证据。一般用急性期血清与恢复期血清的检测结果进行比较，抗体滴度呈四倍或以上增高证明有急性感染。但是，无症状的肠道病毒感染也是常见的，所以对检测结果的解释要慎重一些。

为了提高检测速度，也为了辅助中和实验法进行毒株鉴定，最近很多实验室都使用分子生

物学方法。目前，用分子生物学方法对肠道病毒进行定型还没有统一的标准，而且要根据检测目的选择使用适用的方法。

检测结果的评价

如果从临床标本中分离到肠道病毒，尤其是分离自脑脊液、疱疹液，那么很可能该病毒就是病因病原。当无法进行病毒分离或未分离到病毒时，血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据。对于难以分离到的肠道病毒，分子生物学方法如RT-PCR是很有用的。肠道病毒有时引起无症状感染，所以实验结果的实际意义应结合临床过程和流行病学资料进行解释。

实验室诊断标准

根据手、足、口等部位典型皮疹即可作出HFMD临床诊断，流行病学接触史有助于诊断，临床诊断病例中符合下列之一，即为实验室诊断病例：

1，患者的粪便标本、咽拭子标本中病毒分离阳性率远高于对照人群；

2，肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256；或恢复期血清中肠道病毒型特异性中和抗体较急性期有4倍或4倍以上增高；

3，在病变组织中如疱疹液或脑脊液中分离到病毒；

4，自患者血清、疱疹液或脑脊液等标本中检测到病原体核酸。

一、标本采集对象

标本采集对象是暴发疫情出现时手足口病的临床诊断病例和病例发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构的5岁以下的儿童（作为健康对照人群）。

用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以采集脑脊液标本。对于血清学诊断，需要在急性期和恢复期采集双份血清标本。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，如果不能确保-20℃的条件，应该在0~8℃运输和保存。标本应冷冻运输，运输时要附有必要的信息，如标本编号、发病日期和标本采集日期。

二、标本种类及采集、运送

（一）粪便标本

采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量5~8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

（二）咽拭子标本

采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥。4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

（三）血清标本

采集急性期（发病0~3d）和恢复期（发病14~30d）双份配对血清用于抗体检测。静脉采集3~5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于－20℃以下冰箱中冷冻保存。

（四）疱疹液

在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液（维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

（五）脑脊液标本

出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

（六）病例密切接触者的标本采集

选择典型病例所在的托幼机构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪便和血清标本。

（七）健康对照的标本采集

选择患儿发病所在社区（村）的临近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪便和血清标本。

三、标本采集注意事项

在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离病毒具有很高的诊断价值，但对

于不同血清型的肠道病毒，脑脊液中的病毒分离率是大不相同的。用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。

四、实验室检测操作流程

（一）病毒分离

1.试剂配置

（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表

生长液（GM）维持液（MM）Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml

L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml

胎牛血清10.0ml 2.0ml

7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml

P.S溶液*(青霉素及链霉素) 1.0ml 1.0ml

（2）粪便标本的处理液

完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500μg/ ml。

2．病毒分离细胞系

许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CA16）生长。

对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CA16的标本均需接种到以下两种细胞系：

RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。

HEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。

3．标本的处理

（1）粪便标本的处理

操作步骤：

1.1在离心管上标记标本号；

1.2每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

1.3在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；

1.4剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；

1.5确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；

1.6在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；

1.7在生物安全柜中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理一次）；

1.8一管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另一管存于4~8℃以备接种。

（2）疱疹液标本的处理

疱疹液标本通常直接用于病毒分离。

（3）脑脊液标本的处理

脑脊液标本通常直接用于病毒分离。

（4）咽拭子标本的处理

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，10000 rpm离心20min，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。

4．接种和观察（病毒分离）

（1）显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。一个健康的单层细胞会在传代后3d 左右形成；

（2）倒掉生长液（GM），换上1~1.2ml的维持液（MM）；

（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；

（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；

（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃（对于AHC标本的病毒分离，尤其是EV70的分离培养，强烈建议降低培养温度，一般可为34~35℃）；

（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；

（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+~4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%; 2+, 25%~50%; 3+, 50%~75%; 4+, 75%~100%）；

（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化

（3+ CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代。同一病例的二次传代的病毒分离物可以放到一起用于进一步的鉴定；

（9）第1代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；

（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定。

（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。（注意：同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：不同细胞的培养物应单独传代）；

（12）盲传2代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；

（13）注意：如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应。

（14）几个概念：

A：毒性反应：如果在接种后1~2d内细胞快速地调亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。这些已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml 接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS 稀释10倍，再次接种到同种细胞中。这时应被认为是第一代。

B：微生物污染：由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE 无法确定或根本无法出现。重新取原始标本，用氯仿处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。

C：盲传：有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。这时已接种标本的试管应在－20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7~10d。如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。

5．病毒分离结果解释：

RD细胞支持HFMD的主要病原体——CA16和EV71的复制，CA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。但相同滴度的CA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。

若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其它

可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。但CA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。

从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围患同样疾病者中也检出相同的病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊断的参考价值。

（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。

作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清（或脑脊液）中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。但是，不明显的肠道病毒感染（隐性感染）也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CA16原型株为G-10株），有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。

使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C 液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清（CSF）中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，当然，分离株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先测定。

中和实验的检测原理：病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现致细胞病变效应（CPE），特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。

1．液体配制

A液：血清处理液：（100ml中含下列液体）

MEM 85ml

3% L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氢钠2ml

胎牛血清2ml

青、链霉素（各10000U/ml）10ml

B液：细胞营养液：（按生长液配方配制，100ml中含下列液体）

MEM 85ml

3% L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氢钠2ml

HEPES 1ml

胎牛血清10ml

青、链霉素（各10000U/ml）1ml

C液：病毒（血清）稀释液：（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）

MEM 93ml

3% L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氢钠2ml

HEPES 1ml

胎牛血清2ml

青、链霉素（各10000U/ml）1ml

2．攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备

（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于2支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余者应废弃；

（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；

（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液+50μl细胞悬液），36℃培养7d，观察细胞病变；

（4）按Behrens-K?rber公式计算出分离病毒株的CCID50；

log CCID50 = L-d (S -0.5 )，其中：

L = 实验中使用的最低稀释度的log值；

d = 稀释梯度的log值；

S = 终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。

（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2~3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒载量；

（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100 CCID50/0.05ml）；

（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；

（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即10 CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

3．稀释血清

（1）发病1~3d内采取患者急性期血清，发病后2~4周采取恢复期血清，分别－20℃冻存备检。

（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：4稀释血清。次日56℃、30min灭活。

（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：16），吹吸8~10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：64），依次至1：1024，血清稀释的过程中不必换吸尖。即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。

4．病毒中和抗体测定的操作步骤：

（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀释度的待测血清0.05ml，不必换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、

E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；

（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100 CCID50/0.05ml）；

（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；

（4）另取一块96孔板纵向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂存；

（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；

（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃CO2孵箱中孵育培养；

（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100 CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）；

（8）注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。

5．结果判定：

当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。

对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:128判定

为可疑阳性。

（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

1．RNA提取

可使用商业化试剂盒来提取RNA，如使用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CA T：52904）从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒RNA；

（1），向一支1.5ml离心管中加入560μl的A VL缓冲液（含Carrier RNA）；

（2），再向这支离心管中加入140μl临床标本或病毒分离培养物，充分混匀至少15s；

（3），室温下（15℃~25℃）放置10min，然后瞬时离心；

（4），加入560μl纯酒精，充分混匀至少15s，瞬时离心；

（5），小心加入约630μl的混合溶液至QIAamp柱中（试剂盒附带），将QIAamp柱套在收集管上，然后8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；

（6），弃去收集管中的液体，重复第6步骤；

（7），弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW1缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；

（8），弃去收集管中的液体，小心加入750μl的AW2缓冲液，8000 rpm离心5s，使液体通过滤膜；

（9），弃去收集管中的液体，13000 rpm再次离心1min；

（10），将QIAamp柱放入一支干净的1.5ml的离心管中；

（11），向膜上加入40μl的EB缓冲液，然后室温下静置2~5min；

（12），在离心机中以8000 rpm的速度离心1min，离心下来的液体即为所需的核酸溶液。

2．RT-PCR扩增

（1）引物序列合成

1）人肠道病毒（包括EV71、CA16）核酸检测通用引物序列：

PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA A TG CGG CTA A TC C -3`

PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

2）EV71核酸检测引物序列：

EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

3）CA16核酸检测引物序列：

Cox A16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

Cox A16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

（2）实验设计

1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。

2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。

A：阳性对照：无感染性的对照RNA。

B：细胞对照：使用未接种病毒的细胞悬液，最好使用与扩增病毒所用的细胞类型与代数相同的细胞。每一次实验设2个细胞对照。

C：试剂对照：用去离子水代替标本。

（3）RT-PCR扩增

1）在冰面上融化病毒标本和各种PCR试剂；

2）配下列试剂主溶液：

10×PCR Buffer···································································5.0μl

dNTPs（2.5mM each）·······················································2.0μl

上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

RNA酶抑制剂（R Nasin,40U/μl）······································0.5μl

Taq DNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl

AMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl

模板RNA··········································································3.0μl

RNase Free dH2O···························································36.0μl

50.0μl

3）在PCR仪上进行RT-PCR反应，反应步骤如下：

42℃························45min

95℃························3min

95℃························20s

45℃························25s ×32个循环

72℃························30s

72℃························10min

4℃························Soak

3．电泳分析

1）将已经聚合的3%的琼脂糖凝胶放在电泳装置上；

2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 ×电泳载样缓冲液（每个反应需1μl）。再加上5μl 的PCR反应产物与之混合；

3）将电泳缓冲液倒在电泳装置中，用吸尖将样品与载样缓冲液的混合溶液加到孔中；

4）盖上盖子，接通电源，以10V/cm电压（恒定电压）电泳，大约35~40min，直到溴酚蓝跑到凝胶的底部的时候，停止电泳；

5）将胶取出，并注意保持凝胶的方向；

6）在1μg/ml的溴化乙锭溶液中染色15min，——注意：溴化乙锭溶液是有毒、致畸、并且致肿瘤的物质，操作时要加小心，并戴双层手套。如果储存在避光的容器中，溴化乙锭溶液可以重复使用；

7）在蒸馏水中涮一下凝胶；

8）在紫外透射仪下观察PCR产物电泳结果，并照相作记录。

4．结果解释

通过比较标本的PCR产物与阳性对照的PCR产物在凝胶上的位置以及大小来解释结果。

RT-PCR实验结果解释表

待检标本RT-PCR结果鉴定结果

EV（＋），EV71（－），CA16（－）非EV71、CA16的其它肠道病毒

EV（＋），EV71（＋），CA16（－）EV71

EV（＋），EV71（－），CA16（＋）CA16

五、生物安全

根据2006年1月11日卫生部制订的《人间传染的病原微生物名录》，柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒71型和目前分类未定的其它肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全II级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。

操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全，要在II级生物安全柜中进行标本处理、病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。

灭活后的血清抗体检测与PCR检测可在生物安全I级实验室进行。

所有操作应遵守国家相关法律法规。

附件4

手足口病个案调查表

编号：调查单位：__________________________ （按照国家标准编码：省编码＋市编码＋县编码＋病例序号）

一、一般情况

患者姓名性别出生日期年月日（阴/阳历）

职业工作单位（就读学校或托幼机构）

家长姓名家庭住址市乡（镇、街办）村（居）号家庭电话：

二、发病及就诊情况

1、发病日期年月日

2、初诊日期年月日；初诊单位（省级/市级/县级/乡级/村级）

初步诊断：_______________________________

3、住院治疗（是/否），如住院，则：

所住医院____________________ ，

入院日期年月日，入院诊断，出院日期年月日，出院诊断，病程天。

4、预后：痊愈/好转/未愈/死亡/其他；后遗症（有，；无）

三、临床情况

（一）临床症状如有请打“√”

1、发热（有，℃/ 无）；

2、皮疹（有，主要部位：/ 无）

3、口腔炎：口腔粘膜上出现红色溃疡型疱疹是□否□

4、呼吸系统：流涕□咳嗽□咽痛□其他：__________________________

消化系统：恶心□呕吐□腹痛□腹泻□其他：_______________

神经系统：头痛□喷射状呕吐□精神异常□嗜睡□意识障碍□昏迷□惊厥□

心血管系统：心律失常：有□无□

（二）体征

1、颈项强直：有□无□；巴氏症：有□无□；

克氏症：有□无□；布氏症：有□无□

2、腱反射：正常□亢进□减弱□；

肌张力：正常□亢进□减弱□

（三）辅助检查

1、血象：有，无。有则：WBC（×104/L），N（%），L（%）

2、脑脊液：压力（Pa），外观（正常/异常），细胞记数（个），

蛋白（）糖含量（）

3、X线检查结果：有□，表现为，无□

4、心肌酶谱：肌钙蛋白酶肌红蛋白酶

（四）合并症及并发症

合并症：有□，无□；

并发症：有□，无□

四、流行病学资料

（一）患者接触史（填写病例发病6天前与手足口病、病脑、病毒心肌炎的接触史）：

备注：1、与病例关系，指本调查病例发病前与相关患者的关系。包括（填写）家人、亲戚、同班、同校、同村或其它等关系。

2、临床诊断填写：手足口病、病脑、病毒心肌炎、肺水肿等。

细胞学标本采集规范

细胞学标本采集规范 一、宫颈刮片 1.检查前48小时禁止性生活，避免阴道冲洗及上药。 2.避开月经期。 3.充分暴露宫颈，以宫颈外口为圆心，在宫颈外口鳞柱上皮交界处和宫颈管内，用特制刮板或宫颈刷轻轻刮取或刷取1-2周 4.阴道不规则流血者，用无菌棉棒轻轻拭净出血，再取材。 5.白带过多者，用无菌棉棒轻轻拭净粘液，再取材。 6.将刮下细胞立即一次涂在干净玻片上，顺同一方向，轻轻均匀推平于玻片的右侧2/3，切忌来回涂抹。 7.在玻片磨砂端清楚写上病人姓名/编号。 8.立即将涂片置95%酒精固定至少15分钟。 9.从95%的酒精中取出玻片，晾干，根据切片的多少或与病理实验室的约定，将细胞片按顺序排放于自封袋或切片盒内。 二、液基细胞 1.检查前48小时禁止性生活，避免阴道冲洗及上药。 2.避开月经期。 3.充分暴露宫颈，将扫帚状采样器的毛刷中央部分轻轻

插入宫颈口，按同一方向旋转5-10周（切忌来回转动）。 4.阴道不规则流血者，用无菌棉棒轻轻拭净出血，再取材。 5.白带过多者，用无菌棉棒轻轻拭净粘液，再取材。 6.将毛刷置于装有保存夜的专用瓶内，漂洗扫帚状采样器。上下反复地将扫帚状采样器推入瓶底，迫使刷毛全部分散开来，共10次；最后，在溶液中快速地转动扫帚状采样器以进一步的将细胞样本保存下来，拧紧瓶盖。 7.在标本瓶的标签上清楚填写受检者的姓名、年龄，并和申请单核对无误 三、胸、腹水 1.血性胸、腹水应用肝素抗凝。 2.液体应尽量多送，并及时制片。 四、痰 1.可以送清晨第一口痰，但不局限于第一口痰，血痰为好。 2.一定是深咳出的痰，而不是唾液。 3.最好放在密封的容器内送检，以防标本干涸。 4.支气管镜检查后第一口痰阳性率较高，应送检。 5.最少应连续送三次。 6.应及时送检、及时制片，避免细胞退变。 五、尿液检查

各种标本的采集操作程序

[目的] 规范标本采集保证实验室检测前标本质量。 [范围] 微生物实验室所有标本. [职责] 采集、运送微生物标本的临床各科室工作人员. [标准操作程序] 1.血液、骨髓标本 1.1采集指征 对可疑血流感染患者未进行抗菌药物治疗前应及时进行血液培养可疑血流感染的患者出现以下一项或几项体征时应及时采集血培养： 1)发热(≥38℃)或低温(≤36℃)。 2)寒战。 3)白细胞增多(计数大于10,000X1 O9/L 特别有 “核左移’‘未成熟的或带状的白细胞)。 4)粒细胞减少(成熟的多核白细胞小于 1000X109/L)。 5)血小板减少。 6)皮肤粘膜出血。 7)昏迷。 8)多器官衰竭。 9)血压降低。 10)呼吸加快 11)降钙素原升高(PCT) 12) C 反应蛋白升高(CRP) 在评估可疑新生儿败血症时除发热或低烧夕卜很少培养出细菌应该补充尿液和脑脊液培养肺炎链球菌与流感嗜血杆菌菌血症的患儿(特别是2岁或以下的幼儿)一般出现于门诊,常伴有明显发热(>38.5 C)和白细胞增多(总数互20,OOOx 1 O 9/L )。老年菌血症患者,可能不发热或低体温，如伴有身体不适肌痛或中风可能是感染性心内膜炎的重要信号。 1.2血培养次数和采血时间 采血应该尽量在使用抗菌药之前进行推荐同时采集2-3套(不同部位)血培养以助于提高阳性检出率，区别病原菌与污染菌。(一套血培养为一瓶需氧培养加一瓶厌氧培养。一次静脉采血只能注入到1套培养瓶中)。尽可能选用可中和或吸附抗菌药物的培养基。临床对可疑菌血症患者应立即采集血培养标本，对间歇性寒战或发热可在寒战时或体温高峰到来之前0.5-1 h 进行采血。 除特殊情况之外（如怀疑细菌性心内膜炎），采集血培养后的2至5天内，无需重复采血培养。 1.3特殊的全身性和局部感染患者采集血培养的建议: 1.3.1急性心内膜炎:对于可能的心内膜炎患者必须在经验使用抗菌药物前30min 之内抽取血培养起始采集3套血培养，如果在24h 内仍报告为阴性则继续采集2套血培养，全部培养一共为5套。 1.3.2亚急性心内膜炎:需在24h 之内连续从不同部位抽取3套血培养，间隔30-60min 。如24h 内为阴性，则继续采集2套血培养，全部培养一共为5套。 1.3.3对于亚急性心内膜炎的评估皮肤消毒尤为重要，因为其主要的病原菌为皮肤定植菌如凝固酶阴性葡萄球菌。因此，血培养必须取自外周静脉而非留置的静脉导管。取自导管的血培养会伴有很高的污染风险从而导致错误的心内膜炎的结论。建议采用正确的皮肤消毒，从不同的外周静脉部位分别采集血培养不能从留置的导管采血。 1.3.4急性脓毒症:10min 内从不同的部位采集2-3套血培养。 1.3.5可疑菌血症但血培养持续阴性，应改变血培养方法如延长培养时间或增加特殊培养基以获得罕见的或苛养的微生物(真菌、结核菌等)。 1.3.6不明原因发热，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热从不同体位先采集2一3套血标本24-36h 后估计体温升高之前(通常下午)再采集2套以上 4皮肤消毒剂: 1.4.1推荐使用碘酊、次氯酸和洗必太或碘伏。 1.4.2碘酊、次氯酸和洗必太的消毒效果要优于碘伏。 1.4.3消毒剂需要有足够的作用时间以保证消毒效果 (碘酊作用30s;碘伏作用1.5--2 min)。 1.4.4洗必泰的作用时间和碘酊一样但是没有过敏反应，因此不必擦去，但不能用于小于2个月的婴儿。 1.5静脉穿刺点皮肤消毒程序: 1.5.1 70%酒精消毒皮肤(以采血点为中心，螺旋式用力由内到外直径5cm 以上)，作用60秒; 1.5.2用碘伏消毒皮肤(以采血点为中心螺旋式用力由内到外直径5cm 以上)作用1.5-2min 或用碘酊消毒皮肤作用30秒； 1.5.3再用70%酒精脱碘(以采血点为中心，螺旋式用力由内到外直径5cm 以上)； 1.5.4静脉穿刺采血。 注:血液培养须特别注意消毒因许多微生物，尤

检验标本采集要求

检验标本采集要求 一、病人准备 1．病人状态 一般需在安静状态下采集标本，因运动能影响许多项目的测定结果。活动的影响可分暂时和持续性两类。暂时性影响如使血浆脂肪酸含量减少；丙氨酸、乳酸含量增高。持续性影响，如激烈运动后使CK、LDH、ALT、AST和GLU等的测定值升高，有些恢复较慢，如ALT在停止运动1h后测定，其值仍可偏高30％～50％。 2．饮食 多数试验要求在采血前禁食12h，因为饮食中的不同成分可直接影响实验结果。 (1) 餐后血液中ALT、GLU、BNU、Na等均可升高，但空腹达24h以上，可出现低血糖，血中TG、游离甘油及脂肪酸可增高。 (2) 高脂餐后2～4h采血，多数人ALP含量增高，主要来自肠源性同工酶，且与血型有密切关系，O型或B型兼为Le+分泌型者增高更为明显。 (3) 高蛋白质餐使血浆尿素、血氨增加，但不影响肌酐含量。 (4) 高比例不饱脂肪酸食物，可减低胆固醇含量；香蕉、菠萝、番茄可使尿液5-羟色胺增加数倍。 (5) 含咖啡因饮料，可使血浆游离脂肪酸增加，并使肾上腺和脑组织释放儿茶酚胺。 食物如含有动物血液，可引起粪隐血假阳性。 (7) 饮酒后使血浆乳酸、尿酸盐、乙醛、乙酸等增加，长期饮酒者高密度脂蛋白胆固醇偏高、平均血细胞体积增加、谷氨酰转肽酶亦较不饮酒的病人为高，甚至可以将这三项作为嗜酒者的筛选检查。 吸烟：瘾大者血液一氧化碳血红蛋白含量可达8％，而不吸烟者含量在1％以下。此外，儿茶酚胺、血清可的松亦较不吸烟者为高，血液学方面亦有变化，白细胞数增加、嗜酸粒细胞减少、中性粒细胞及单核细胞增多、血红蛋白偏高、平均红细胞体积偏高。吸烟组血浆硫氰酸盐浓度明显高于非吸烟组。 3．药物 药物对检验的影响非常复杂，在采样检查之前，以暂停各种药物为宜，如某种药物不可停用，则应了解可能对检验结果产生的影响。 4．体位 体位影响血液循环，由于血液和组织间液因体位不同而平衡改变，则细胞成分和大分子物质的改变较为明显，例如由卧位改为站位，血浆ALB、TP、酶、Ca、胆红素、Tch及TG等浓度增高；Hb、HCT、RBC等亦可增加。由于体位的因素，在确立参考值时，应考虑门诊和住院病人可能存在的结果差异，故采集标本时要注意保持正确的体位和保持体位的一致性。 5．时间 病人准备还应考虑病人的生物钟规律，特别是激素水平分析，如女性生殖激素与月经周期密切相关；胆固醇则在经前期最高，排卵时最低；纤维蛋白原在经前期最高，血浆蛋白则在排卵时减少。生长激素于入睡后会出现短时高峰。胆红素、血清铁以清晨最高；血浆蛋白在夜间降低；血Ca往往在中午出现最低值。故采血时间应在相同时间进行。 二、标本采集

检验标本采集规范

检验标本采集规范 一、常规标本采集规范 （一）静脉血标本采集规范 1．真空采血标本对应真空管 真空管项目备注 血培养瓶血培养 儿童1-2ml 成人8-10ml 枸橼酸抗凝管（1：9抗凝）（蓝帽） 凝血全项 （PT、APTT、FIB、TT、D-D、FDP、 AT3） 标本采集2ml （不能多不能少） 枸橼酸抗凝管 （1：4）抗凝（黑色）血沉 至刻度线 （不能多不能少） 促凝剂管（黄帽）生化全项、肝功能、肾功能、血糖、血 脂、心肌酶、电解质、RF、ASO、血 清铁、血清同型半胱氨酸、淀粉酶 标本采集量4-5ml 促凝剂管 （黄帽） 肌钙蛋白I、人绒毛膜促性腺激素标本采集量4-5ml 无添加剂管 （红帽） 乙肝三系、病毒四项标本采集量4-5ml 无添加剂管甲状腺激素五项，雌激素五项，甲胎蛋标本采集量4-5ml

（红帽）白、癌胚抗原、CA125、CA19-9、CA15-3 总前列腺特异性抗原 无添加剂管 （红帽） 结核抗体、肺炎支原体标本采集量4-5ml 无添加剂管 （红帽） PCR 标本采集量4-5ml EDTA-2K 抗凝管（红帽）血常规、血型、CRP 标本采集量2ml 可以使用同一管 血 网织红细胞计数 外周血涂片 糖化血红蛋白标本采集量2ml 交叉配血标本采集量2ml 2．理想的采集血标本的时间是早晨7∶00～8∶00。 3．采血部位和数量成人首选肘部血管：正中静脉、贵要静脉、头静脉等，婴幼儿可采用大隐静脉、颈外静脉、股静脉等。 4．采血顺序 为血培养管→凝血项目管（蓝帽）→血沉管（黑帽）→促凝剂管（黄帽）→无添加剂管（红帽）→EDTA管（紫帽） 5．在实际工作中，如患者静脉条件较差，有可能采血不足，血培养优先考虑需氧瓶，其他管应首先考虑凝血（蓝帽）和血沉（黑帽）检测管，因为这2种标本对血量要求最严格，且二者抗凝剂均为枸橼酸钠。 6．检验申请条码贴在采血管上时，请注意不要将采血管完全包裹，应留出空白，以便观察液面高和血液状态，若未打印条码，请将采血管上的

微生物标本采集 送检及处理原则

微生物标本采集、送检及处理原则 一、标本采集的一般原则： 1、病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。 2、无菌采集应无污染，严格进行无菌操作。 3、根据目的菌的特性用不同的方法采集适量标本，采集量不应过少。 4、注意在不同病程采集不同部位标本。 5、采集标本时要防止传播和自身感染。 二、标本的处理： 1、标本保存在4℃环境中，在2h之内送检。脑脊液则要在25 ℃保存，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。对环境敏感的细菌应保温并立即送检。 2、标本中可能含有致病菌，必须注意安全防护。切勿污染环境。对于烈性传染病标本运送时更要由专人运送，严格按规定包装。 3、厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送。 Ⅰ血液及骨髓标本： 血液标本的细菌培养是诊断菌血症或败血症的基本方法。如从患者血液中检出细菌，一般应视为病原菌。 常见的病原菌主要有金黄色或表皮葡萄球菌、链球菌（A、B群、肺炎链球菌等）、肠球菌、产单核细胞李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、伤

寒及副伤寒沙门菌和厌氧菌等。 1、采血时间及次数 2、抽血部位及抽血量 3、报告方式：培养5d无菌生长者报告“培养5d无菌生长”。 查见细菌报告菌名和药敏结果。 4、菌血症、败血症的诊断标准：1）两次培养均出现同一种细菌（可排除污染）； 2）发病星期后血中抗体滴度上升。 Ⅱ脑脊液标本： 脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的诊断有重要价值。正常人的脑脊液是无菌的，检出细菌提示有细菌性（急性化脓性、结核性等）脑膜炎。 常见的病原菌主要有脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、链球菌（A、B群和肺炎链球菌）、葡萄球菌、产单核细胞李斯特菌、结核分枝杆菌等。 1、涂片检查： (1) 一般细菌涂片检查：例如：革兰阴性、凹面相对的球菌，可能是脑膜炎奈瑟菌；链状排列的革兰阳性球菌；长丝状等多形态性的革兰阴性杆菌，可能是流感嗜血杆菌。 (2)结核分枝杆菌涂片检查 (3)新生隐球菌涂片检查

临床检验标本采集、运输、保存操作规程

临床检验标本采集、运输、保存操作规程 目录 第一章、体液标本的采集、运输、保存操作规程 一、尿液标本采集、运输、保存 二、阴道分泌物标本采集、运输 三、精液标本采集、运输、保存 四、粪便采集、运输、保存 第二章、血液一般检验的标本采集、运输、保存操作规程 一、未梢血标本采集 二、静脉血采集、运输、保存 第三章、生化检验标本采集、运输、保存操作规程 前言 在临床工作中，检验标本的分析结果是临床医生诊断疾病、制订治疗方案的重要依据，而标本采集及送检工作的合格与否直接影响检验结果的真实性，进而影响疾病的诊治工作。为了进一步提高检验结果的准确性和可靠性，除了要求检验科提高检验质量水平外，还要求临床医护人员正确采集标本。为确保标本的正确采集、运输和保存，检验科特编写了临床检验标本采集、运输、保存操作规程，要求医护人员严格按操作规程采集、运输和保存标本。 第一章体液标本的采集、运输、保存操作规程 一、尿液标本采集、运输、保存 （一）检查项目 1．尿液干化学测定：尿液比重、pH 值、尿胆原、胆红素、潜血、酮体、蛋白质、白细胞、亚硝酸盐、葡萄糖、抗坏血酸。 2．尿液有形成份检测：包括红细胞及白细胞形态等。

3．其它：尿HCG、尿液红细胞显微镜形态分析。 （二）标本采集 【容器及采样量】 门诊病人由检验科提供专用塑料尿杯，采样量20-30ml。住院病人使用清洁容器取尿，再将尿液倒入专用的试管内，量约5-10ml。24小时尿液收集于清洁容器中，如小的带盖的塑料桶。 【标本种类及适用人群或项目】 （1）晨尿 即清晨起床后的第一次尿标本，为较浓缩和酸化的标本，血细胞、上皮细胞及管型等有形成分相对集中且保存得较好。门诊患者可采集清晨第二次尿标本。适用：住院病人、可疑或已知泌尿系统疾病的动态观察及早期妊娠试验等。 （2）随机尿（随意一次尿） 即留取任何时间的尿液。本法留取方便，但易受饮食、运动、用药等影响，可使低浓度或病理临界浓度的物质和有形成分漏检，也可能出现饮食性糖尿或药物如维生素C等的干扰。适用：门诊和急诊病人。 （3）其他 包括留取中段尿（女病人易受阴道分泌物污染，应采集中段尿）、导尿、耻骨上膀胱穿刺尿等。 【注意事项】 （1）避免阴道分泌物、月经血、粪便等污染，女性病人应采集中段尿，尽量避免经期做尿常规检查； （2）避免干扰化学物质（如表面活性剂、消毒剂）混入； （3）住院病人送检的标本要标上病人姓名，门诊病人的标本和检验申请单放在指定的标本收集盘上。

标本采集、运送、保存程序

标本采集、运送、保存成序 1.目的 规范标本采集程序，保证实验室检测前标本质量。 2. 范围 微生物标本。 3. 职责 3.1 医护人员和检验人员负责指导病人如何正确留取标本。 3.2 标本运输人员负责收取标本和运输标本至微生物室。 4. 程序 4.1 采集标本前，采样人员根据检验申请单检验项目的要求，确认采样计划并进行适当的准备工作，包括核对遗嘱、打印条形码、选择合适的标本容器、粘贴条形码及指导病人做好采样前的准备工作等。 4.2 认真核对病人、标本容器和检验申请单是否一致，严防差错。 4.3 标本送到微生物室，标本运输人员必须与微生物室标本接收人员对标本进行核收登记并签名 4.4 所有标本必须记录采样时间并立即送检，一般不得超过2h. 5 采集方法 5.1 血液及骨髓 5.1.1 血液 5.1.1.1采血时间：①在抗菌药物治疗前；②尽可能在患者寒战开始时、发热高峰前30-60分钟内采血；③如患者已经应用抗菌药物进行治疗，应在下一次用药之前采血培养；④同时或短时间内完成几套血

培养采集，除非怀疑存在持续性菌血症时（如亚急性感染性心内膜炎1-2小时从不同部位采集3套标本） 5.1.1.2采血量：成人一次采血5～10ml,儿童2～5 ml婴幼儿为1～2ml。（附注：儿童的采血量不能超过其总血容量的1%）。 5.1.1.3采血方法：①成年病人，推荐同时在不同部位采集2～3套（每套包括一瓶需氧瓶、一瓶厌氧瓶）；对于感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；对于婴幼儿病人，推荐同时在不同部位采集2～3瓶。因为儿童患者很少见厌氧菌感染，因此推荐仅使用需氧瓶而不常规推荐同时做厌氧培养。②采血量充足时，应先注入厌氧瓶，后注入需氧瓶；采血量不足时，应先注入需氧瓶，后注入厌氧瓶。 5.1.2 骨髓标本用骨髓穿刺针从髂骨采集。 5.1.3 标本保存：采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，切勿放入冰箱。冬季血培养瓶在送检过程中应采取一定的保暖措施。 5.2 脑脊液标本：由临床医师以无菌要求做腰椎穿刺，抽取脑脊液2～3ml,盛于无菌容器中送检。脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自酶，会迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌离体后也易死亡，因此，脑脊液无论图片或培养，必须于采集后立即送检。 5.3 上呼吸道标本 5.3.1 鼻咽标本：将鼻咽拭子缓缓地伸进鼻孔直至鼻咽喉部（注意：不可用力），轻轻转动，并于该深度停留20～30s,然后迅速地抽出（注意：避免受口或咽部中细菌的污染）。

微生物标本采集及保存要求

微生物标本采集及保存要求 一、总则：用于培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。 二、临床标本的采集 （一）下呼吸道分泌物（痰液） 令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。 （二）、尿液（中段尿） 护理人员协助采取中段尿约3ml入无菌试管中，及时送检。 （三）、粪便：取有粘液、脓血部分的粪便置玻璃大便专用管中，如为稀水便，可直接收集于玻璃管中，及时送检。 （四）、眼、耳、鼻、喉拭子：将棉拭子沾取少许无菌生理盐水（如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份），然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌试管内,及时送检。 （五）、脓液：用沾有生理盐水的棉拭子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌试管中，及时送检。 （六）、： 1、凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也可。 2、成人每次采血5—10ml，小儿采血2—3ml； 3、严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀， 4、从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。 （七）、穿刺液：胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液： 严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中，轻轻颠倒试管10余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。 （八）、胆汁：由专科医生以无菌方法取引流液10ml注入无菌试管。 （九）、脑脊液：以无菌方法取脑脊液3-5ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。 （十）、生殖器官标本：阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌试管内送检。如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。（十一）、烧伤标本：以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌试管中. （十二）、支原体（解脲、人型）培养+药敏的标本采集 1、支原体对干、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。 2、男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内2.5-3cm。 三、临床标本的保存 细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。

标本采集规章制度

标本采集制度 1. 标本采集核对规章制度 2. 标本采集及送检规章制度 3. 检验标本采集、运送规章制度 4. 标本采集与管理规章制度 5. 标本采集与管理规章制度 1、标本采集核对规章制度 一、护士应掌握各种标本的正确留取方法。 二、采集标本严格遵医嘱执行。 三、标本采集前认真执行查对制度，医嘱和检验单逐项核对无误后，方可执行。 四、标本采集时要携带检验单再次核对确认病人（必要时病人参与确认）。 五、输血、配血抽取标本时，必须两人核对后抽取并签名。 2、标本采集及送检规章制度 一、目的：确保实验室标本的安全、有效，保证检验质量。 二、适用围：适用于检验科全体工作人员。 三、容：

1、标本的采集 1）、血液标本的采集：静脉采血时，除卧床病人，采血时一般取坐位，成人多用肘前静脉，肥胖者可用腕背静脉，婴幼儿常用颈静脉，偶用前囟静脉。静脉采血用止血带应一人一用一消毒。使用止血带的时间不应超过一分钟，穿刺成功后应立即松开止血带。正在静脉输液者应停止输液三分钟，从未输液的另一侧或输液部位以下的部位采血。血清(浆)标本的收集各室应根据所检验项目的要求采用相应的标本收集管，并确定采血量。动脉采血一般由临床科室护士采集。 2）、尿液标本的采集一般由患者或护理人员按医嘱留取。取样时应注意明确标记，避免污染，使用合格的一次性洁净专用尿杯收集尿样。中段尿、导管尿等特殊尿样的采集一般由医护人员行相关操作留取标本。 3）、粪便标本的采集由患者留取后收集于合格的一次性洁净专用粪杯送检。应取新鲜标本，选取异常成分的粪便，如含有黏液、脓、血等病变成分的标本，外观无异常的从表面、深处及粪端多处取材，取3～5g及时送检。

临床检验标本采集规范

临床检验标本采集规范 一血常规检验标本 1用EDTA-2K（EDTA-K2.2H2O）1.5~2.2mg/ml抗凝（EDTA抗凝管、紫色帽）采血。 2注意事项： A 按抗凝管刻度准确采血至2ml。 B 采血后立即上下颠倒混匀5~10次，不可用强力震荡，以免造成溶血。 C 采血后尽快送检（为保证结果准确，必须在2h内完成检测）。 二红细胞沉降率（血沉、ESR）检验标本 1静脉采集枸橼酸钠（109mmol/L，即32.06g/L）抗凝血（枸橼酸钠抗凝管、黑色帽）。2注意事项： A 单独采1管血，按抗凝管刻度准确采血至2ml（抗凝剂:全血=0.4:1.6）。 B 采血后立即上下颠倒混匀5~10次，不可用强力震荡。 C 采血后尽快送检（为保证结果准确，必须在2h内完成检测）。 三凝血检测（PT、APTT、Fbg、TT、D2-聚体）标本 1静脉采集枸橼酸钠（109mmol/L，即32.06g/L；抗凝剂:全血=0.2:1.8）抗凝血（枸橼酸钠抗凝管、蓝色帽）。 注意事项： A 单独采1管血，按抗凝管刻度准确采血至2ml。 B 采血后立即上下颠倒混匀5~10次，不可有凝块。 C 采血后尽快送检（为保证结果准确，必须在2h内完成检测）。 D 空腹采血（餐后脂血会影响检验结果）。 四血型与交叉配合标本 1用EDTA-2K（EDTA-K2.2H2O）1.5~2.2mg/ml抗凝（EDTA抗凝管、蓝色帽）采血。 2注意事项： A 按抗凝管刻度采血至2~3ml。最好单独采血，便于标本保存。 B 采血后立即上下颠倒混匀5~10次，不可用强力震荡，以免造成溶血。

五血流变检查标本 1 用肝素钠抗凝管（肝素钠、绿色帽） 2 注意事项： A 按抗凝管刻度采血至4~5ml。 B 采血后立即上下颠倒混匀5~10次，不可用强力震荡，以免造成溶血。 六尿液常规检查标本 1住院病人尽量留取晨尿（安静状态下留取清晨第一次尿）。 2门急诊病人可留取随机尿，但结果受多种因素影响。 3尿液采集于洁净尿杯中，不可使用其它未经洗涤的器皿如药瓶、试剂瓶等。 标本留取后尽快送检（为保证结果准确，必须在2h内完成检测）。 七尿液特殊检查标本 1尿液成分定量检查应根据检查目的选择并在检验科领取防腐剂。 A 尿爱迪氏计数或3h计数：甲醛（40%），5ml/L尿液；3h和12h尿沉渣计数的留尿时间 分别为（5：30-8：30）和（20：00-次日8：00）。 B 尿蛋白或尿糖定量：甲苯，5~20ml/L尿液。 C 尿17-羟、17-酮、肾上腺素、儿茶酚胺和尿钙等：浓盐酸，10ml/L尿液。 2尿稀释浓缩试验：试验日正常进餐，上午8点排尿弃去，没隔2h留尿一次，至晚上8点共六次标本；晚8点至次晨8点为夜尿，收集于一个容器中，分别标记时间后送检。 八粪便常规检查标本 1一般应为新鲜的自然排出的粪便3~5g，必要时可肛试子取出，但需注明。 2样品置于洁净容器中，最好用带盖塑料盒。 3粪便应选取含脓、血、粘液等异常成分进行检查。 4做隐血试验时，应嘱病人检查前3天禁食肉类、含动物血的食物。 九浆膜腔积液检查标本 1标本一般由临床医师无菌穿刺采取。

(推荐)血液标本采集、送检留样保存制度

血液标本采集、送检、留样保存管理制度 1、病人血液标本采集由两名护士共同配合采集静脉采血 5ml,血清和血浆都可以用于交叉实验和抗体检测，最好是血清标本，标本使用限制在3 天内含有肝素等抗凝标本可以用凝血酶或硫酸鱼精蛋白处理使其凝集析出血清。 2、允许通过静脉输液口采集标本，但必须丢弃受残留静脉输液影响的 5ml 标本。 3、一般不允许使用溶血标本，对急性溶血性贫血和烧伤病人的溶血标本，在实验前后必须做溶血程度的比较。 4、标本和输血申请单上的所有资料必须填写清楚 5、确定输血后，护士输血申请单和贴好标签的试管，当面对患者姓名，性别，年龄，病案号，病室/门急诊、床号、血型和诊断，同时采血样。 6、由护士及时将受血者血样与输血申请单送配血室，双方进行逐项核对。 7、患者标本管上必须有标签，收到标本时应当面与医护人员核对血样标签与输血申请单是否相符，即双方逐项核对患者姓名、病案号、病室/门急诊、床号、血型和采血日期等，并检查送检标本的质量是否与申请项目的要求相符，不符合要求的样本一律退回，并进行书面记录。收到标有“急”字样的标本应及时处理。 8、配血室科工作人员应复核受血者（患者）ABO血型、Rh血型、抗体筛查后按科室分类保存在4℃冰箱备用。对中心血站提供的全血及红细胞悬液血液制品也应核对ABO血型后按血型分类保存在4℃冰箱备用。 9、预约输血患者的血样在4℃冰箱保存不能超过48小时，逾期应重新抽取血样。对反复输血的患者更应注意抽取新的标本做不规则抗体筛查及交叉配血，以避免患者体内因回忆反应而产生抗体。

10、确定输血后，输血科工作人员对患者的血样在交叉配血之前，应再次认真查对病人姓名、性别、年龄、住院号、病区床号及血型。交叉配血时要严格按照规程进行。 11、血液发出后，受血者和供血者的血样按日期的先后保存于2－6℃冰箱，至少7天，以便对输血不良反应追查原因。逾期的血样应按医疗废物处理原则处理，并做好登记工作。 12、血液标本留样保存冰箱的温度要定期监控记录，如发生故障要立即检查原因，及时解决并记录。 （注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）

临床检验标本采集规范及注意事项(2016护理培训).

临床检验标本采集规范及注意事项 一、检验标本采集原则(书108页） 二、检验标本的种类： １、血液检验标本：全血、血浆、骨髓等 ２、体液检验标本：尿液、粪便、脑脊液、胸水、腹水、精液、前列腺液、阴道分泌物、胃液、十二指肠引流液、胆汁、痰液、羊水、泪液等。 ３、其它特珠标本：如细胞穿剌、皮屑、指甲、毛发等的成分分析。 三、检验结果的影响因素 （一)主要影响因素： 患者的状态；.患者的饮食；药物的影响。 1.不可变的生物因素：如年龄、性别等； 2.可变的生物因素：情绪、运动、生理节律变化； 3.采取标本时：体位：立位、卧位 4.止血带的使用等。 5.年龄与性别：部分检验结果与年龄和性别而有所不同： 红细胞总数：男：(4.0-5.7)*1012/L 女：(3.7-5.1)*1012/L 新生儿：(5.2-6.4)*1012/L 婴儿：(4.0-4.3)*1012/L 儿童：(4.0-4.5)*1012/L 血清碱性磷酸酶： 儿童：＜５００Ｕ／Ｌ 成人：４０－１５０Ｕ／Ｌ 6.情绪 原则上患者应在平静、休息状态下采集标本，特别是血液标本。患者对采集标本时的恐惧、紧张，有时造成标本采集的失败。有研究指出，患者处于激动、兴奋、恐惧状态时，可使血红蛋白、白细胞增高。 7.运动 血清丙氨酸氨基转移酶（谷-丙转氨酶、GPT）、血清天门冬氨酸氨基转移酶（谷-草转氨酶GOT）、乳酶脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）等一时升高；还可引起血中钾、钠、

钙、白蛋白、血糖等成分的变化。 8.劳累或受冷、热空气刺激，往往可见白细胞的增高。 9.昼夜生理变化 分析物峰值时间谷值时间范围(日均值的%) 钾14-1623-14-6 铁14-182-450-70 磷酸盐2-48-1230-40 血红蛋白6-1822-248-15 促甲状腺素20-27-135-15 甲状腺素8-1223-310-20 生长素21-231-21300-400 泌乳素5-710-1280-100 醛固酮2-412-1460-80 10.体位 从立位到卧位时 Hgb下降4%；Hct下降6%；K下降1%；Ca下降4%；ALT下降7%；AST下降9%；ALP下降9%；IgG下降7%；IgA下降7%；IgM下降5%；TG下降6%；T4下降11%。 11.饮食 一顿标准餐后，可使血中甘油三酯增高50%、血糖增高15%。进食高碳水化合物食物，可引起血糖增高；进食高蛋白或高核酸食物，可引起血中尿素氮及尿酸的增高；进食高脂肪食物，可引起血脂的大幅度增高。餐后采集的血液标本，其血清常出现乳糜状，影响到许多检验测定的正确性。 12.饮料及吸烟 咖啡：可使AMY、AST、ALT、ALP、TSH、Glu等升高。 酒：可使Glu降低,使TG、G-GT、HDL-Ch升高。 尼古丁：可使儿茶酚胺、胃泌素、皮质醇、生长激素、碳氧血红蛋白、血球压积、癌胚抗原升高；使免疫球蛋白降低。 13.药物的影响 引起WBC\RBC下降，ALT升高，凝血功能改变 四、采集标本要选择最佳时间 临床检验血液标本原则上晨起空腹时采集，其结果准确可靠，因它避免了摄入成分和生

细菌标本采集规范

临床微生物学标本采取和处理的规范化要求 正确的采取、处理与运送用于细菌培养的标本是临床细菌检验成功的关键。标本采取与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础；而标本采取与处理不当将严重影响检验结果，给临床以误导，延误对患者的正确治疗。为此，我们提出初步的参考意见，并希望在实践中不断完善。 一、血液细菌培养标本的采集和处理 临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者，需做血液细菌培养以明确病原。 1．采集方法：静脉采血，以无菌操作方法抽取血液后，直接注入血培养瓶中，轻轻颠倒混匀，以防血液凝固。如果同时作需氧和厌氧培养，应先将标本接种到厌氧瓶中，再注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。 2.采血时间以及血培养份数：在患者发热期间越早越好，最好在抗菌治疗前，用药前24小时内采集2～3次血液标本，可使细菌检出率高达99%。对间歇性寒战或发热的患者，应在寒战或体温高峰到来之前0.5～1小时采血，亦可在寒战或发热后1小时采集血液标本。特殊感染患者采血培养时应遵循以下原则： （1）可疑急性发热性菌血症、败血症患者：应在使用抗菌药物之前，在24小时内从不同部位采集2～3份血液标本培养。 （2）可疑细菌性心内膜炎患者、感染性心内膜炎患者：在1～2小时内采集3份血标本培养，如果24小时后阴性，再采集两份血标本培养。 （3）不明原因发热患者：先采集2～3份血标本，抽血间隔60 min，24～36小时后体温升高之前，再采集2份血标本进行培养。因为1次血培养不足以说明问题，可能会遗漏阳性结果。

（4）可疑菌血症但血培养持续阴性时；应改变血培养方法，以获得罕见或苛养的微生物。 （5）在急性发热性疾病如脑膜炎、细菌性肺炎，需马上做抗菌治疗；或急性骨髓炎、化脓性关节炎等要紧急手术的患者，应立即从两臂分别取2份标本。 3.采血部位：采血部位通常为肘静脉。疑为亚急性心内膜炎的患者，以肘动脉或股动脉采血为宜。疑为细菌性骨髓炎或伤寒患者，在病灶或髂前（后）上棘处严格消毒后抽取骨髓。多次采血应在不同部位的血管穿刺以排除皮肤菌丛污染的可能。要避免从血管插管内取血，因插管常被污染，其培养结果不能反映真实情况。在不同部位取血，2次分离出同样菌种才是确定病原菌的有力证据。采血时要求严格无菌操作，防止皮肤正常菌群污染。 4.采血量：采血量与血培养的检出率相关，所以采血量一定要足够。成人一般为8～10ml/瓶，新生儿与婴幼儿为1～5 ml/瓶，骨髓采血量为1～2ml/瓶。 5.标本运送与保存：含血样的培养瓶应立即送往实验室；不能及时送检的标本，应将其放在室温，切忌冰箱存放，因为某些苛养菌可在低温环境中死亡，而使培养阳性率下降。 二、下呼吸道分泌物(痰培养)的标本采取和处理 下呼吸道分泌物(痰)的细菌学检查对病原学诊断起着重要作用，但痰标本的质量往往难以保证，造成病原学诊断和实际引起感染的病原菌脱节，直接影响抗菌药物的应用、甚至耐药菌的出现或流行。痰标本的细菌学检验地带网检查应注意如下几个问题。 1.标本的采集：痰液标本最好在应用抗菌药物之前采集，以深咳晨痰最好，主 要有自然咳痰法、支气管镜采集法、胃内采痰法、小儿采痰法和气管穿刺法等。

标本采集管理制度资料讲解

标本采集管理制度