V F 电泳法
等电聚焦水平板电泳法
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点（此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷）时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。
除另有规定外按以下方法测定。
1. 仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。
2. 试剂
（1）水（电阻率应不低于18MΩ·cm）
（2）A液称取丙烯酰胺5.0g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，加适量水溶解，并稀释至50ml，双层滤纸滤过，避光保存。
（3）B液10％过硫酸铵溶液，新鲜配制。
（4）甲基红试液称取5mg甲基红，溶于10mL 0.05mol/L氢氧化钠中。
（5）50%甘油
（6）正极液0.5mol/L磷酸溶液
（7）负极液1mol/L 氢氧化钠溶液
3. 操作法
（1）制胶取A液2.5ml，pH3~10的两性电解质（或其它pH范围的两性电解质）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，抽气5~10分钟，加B 液25μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺6μl，混匀后缓慢的注入水平模具内，室温下聚合。
（2）预电泳将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压200V下预电泳30分钟。
（3）对照品溶液和供试品溶液的制备将供试品对水透析（或用其它方法）脱盐，并将蛋白或多肽含量调节至0.5~5mg/ml（如供试品蛋白或多肽浓度太低，则需采用适当方法浓缩）。对照品溶液同供试品溶液制备。
（4）电泳将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上，加入供试品、对照品及等电点标准溶液5~20μl。选择恒压方式进行电泳，起始电压为200V。电泳0.5~1小时待甲基红迁出加样条后，去除加样条。调高电压至400V，电泳至电流不再变化，再调高电压至600V，待电流不再变化时停止电泳。
4. 固定和染色
（1）试剂
1
实验七. 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法 【实验目的】 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理 2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法 【实验原理】 等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。 蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。 【实验材料】 1.实验器材 小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计 2.实验试剂 (1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3一10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。 (2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。此蛋白溶液应无盐离子。 (3) 5％磷酸溶液 (4) 2％氢氧化钠溶液 (5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-2500.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。 (6) 40%蔗糖溶液 (7) 12％三氯醋酸溶液 (8) 脱色液：乙醇:冰醋酸:蒸馏水= 25：10：65(v／v)。 【实验操作】 1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。 2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40％蔗糖溶液3—4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3-5mm高），使混合液表面与空气隔绝。放置约0.5-1小时，观察凝胶的凝聚情况。 3. 管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，让蔗糖溶液流出，并用少量蒸馏水清洗，然后将小玻璃管垂直放入圆盘电泳槽中。上槽加入5％磷酸溶液，接正极，下槽加入2% NaOH溶液，接负极，于150V条件下进行聚焦，过一段时间后（约2-3小时），电流稳定不变时（基本为零），说明聚焦完毕。 4. 聚焦结束后取出小玻璃管，迅速用蒸馏水将两端洗净。用一带长针头的注射器灌满蒸
毛细管电泳的基本原理及应用 摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。 关键词：毛细管电泳原理分离模式应用 1概述 毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。 毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。 毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。
等电聚焦电泳测定血清蛋白质等电点 【实验原理】 等电聚焦电泳是利用具有pH梯度的两性电解质为载体，分离等电点(pI)不同的蛋白质等两性分子的电泳技术。在IEF电泳系统中，具有一个从阳极到阴极，pH值逐渐增大的连续而稳定的pH梯度，处于此系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的pH值的差别带上正电或负电。当蛋白质分子向相反电极移动的过程中，其逐渐靠近与其DI相同的pH位点，直至到达pH=pI，净电荷为零而停止移动，从而达到聚焦。因此，将pI不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分会分别聚焦在各自pI相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。根据电泳装置的不同，IEF可分为管型IEF和平板型IEF，本实验介绍管犁PAGE—IEF． 【试剂与器材】 1．凝胶贮备液称取丙烯酰胺(Acr)20g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0．8g，蒸馏水溶解后定容至100mL，过滤，将未溶物滤去，盛于棕色瓶中，4℃冰箱保存。 2．1％(V/V)TEMED溶液。 3．5g/L过硫酸铵称取过硫酸铵0．5g，溶于蒸馏水100mL，冰箱存放，每周新配。 4．40％两性电解质载体。 5．0．5mmol/L磷酸溶液量取85％磷酸16mL，加蒸馏水定容至500mL。 6．0．5mmol/L NaOH溶液称取NaOH10g，加蒸馏水溶解并定容至500mL。 7．1g/L考马斯亮蓝固定染色液称取考马斯亮蓝R250 lg，溶于含甲醇200mL、乙酸100mL和蒸馏水700mL的混合液中，过滤后备用。 8．酸性乙醇脱色液乙醇25份，蒸馏水25份，冰醋酸8份，混匀备用。 9．血清样本血清无须稀释，但最好透析去除离子。 10．电泳仪选用电子管或晶体管整流电源，电压0~600V，电流0~300mA。 11．电泳槽圆盘电泳槽及电泳玻管。 12．锥形瓶，250px长针头或腰椎穿刺针头，5mL或10mL注射器。 食品安全检测农药兽药残留土壤成分分析焦炭成分分析 【操作步骤】 1．凝胶制备取洁净干燥的电泳玻璃管2支，将管底用胶布封闭，垂直放置在电泳管架上。取一锥形瓶，分别加入凝胶贮存液2mL，两性电解质载体0．4mL，1％TEMED溶液2mL，人血清2μl，蒸馏水2．58mL，轻轻搅匀，注意勿带入气泡。立即用滴管将此凝胶溶液加入上述玻璃管中，直至距上端25px处为止，然后小心加入蒸馏水(3～5mm高)，注意保持凝胶表面平坦，以保证凝胶正常聚合。室温中静置1小时，让凝胶完全聚合。此时，凝胶浓度为3．8％，两性电解质载体含量为2％。 2．聚焦将聚合完毕的各凝胶管上端水层吸去，除去下端胶布。垂直插入圆盘电泳槽装置中。下槽加入0．5mmol/LNaOH溶液，接负极；上槽加入0．5mmol/L磷酸溶液，接正极。凝胶管上下端均不得产生气泡，如有气泡，可用针头或细玻棒驱除。打开电泳仪开关，调至100V处，待电压稳定后调至150~160V，电泳4小时可完成聚焦。 3．剥胶取下凝胶管，先用蒸馏水充分洗涤凝胶管两端，再用带长针头的注射器吸满 蒸馏水，将针头小心插入胶柱与管壁之间，边注水边缓慢旋转玻管，并将针头向前慢慢推进，靠水流压力和润滑力将玻管内壁与凝胶分开，然后用洗耳球在胶管一端轻轻加压，凝胶柱便缓缓从玻管中滑出，将其放在洁净的玻板上，在一端做上标记。 4．固定、染色将凝胶柱平放于玻板上，量取并记录其长度后立即浸入预热到60℃的lg/L考马斯亮蓝固定染色液中约30分钟，取出后用蒸馏水洗涤，再用酸性乙醇脱色液漂洗，洗去背景颜色。 凝胶柱经固定染色后其长度会发生变化，未经固定染色的凝胶柱长度与固定染色后凝胶柱长度之比为变形系数。量取并记录固定染色后凝胶柱的长度和蛋白质区带中心至正极端的距离，此距离乘以
【实验目的】 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理 2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法 【实验原理】 等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。 蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。 利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。 【实验材料】 1.实验器材 小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计 2.实验试剂 (1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。
(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。此蛋白溶液应无盐离子。 (3) 5%磷酸溶液 (4) 2%氢氧化钠溶液 (5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。 (6) 40%蔗糖溶液 (7) 12%三氯醋酸溶液 (8) 脱色液乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。 【实验操作】 1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。 2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5 mm高），使混合液表面与空气隔绝。放置约0.5～1小时，观察凝胶的凝聚情况。 3. 管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，让蔗糖溶液流出，并用少量蒸馏水清洗，然后将小玻璃管垂直放入圆盘电泳槽中。上槽加入5%磷酸溶液，接正极，下槽加入2% NaOH溶液，接负极，于150V条件下进行聚焦，过一段时间后（约2～3小时），电流稳定不变时（基本为零），说明聚焦完毕。 4. 聚焦结束后取出小玻璃管，迅速用蒸馏水将两端洗净。用一带长针头的注射器灌满蒸馏水，并将针头紧贴玻璃管内壁插至凝胶和管壁之间，转动玻璃管，同时推动注射器，并使针头在管壁与凝胶间前进，注入蒸馏水，使凝胶胶条从玻璃管中脱出。
电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间
毕业设计（论文）外文翻译 Electrochemical detection methods in capillary electrophoresis and applications to inorganic species 毛细管电泳电化学检测方法 在无机元素中的应用
电化学检测法在毛细管电泳 和无机元素中的应用 摘要：本文论述了毛细管电泳的三种电化学检测即电导检测法、安培检测法和电位检测法，并与较常见的光学检测方法进行了比较。详细介绍了三种检测方法的原理及其实现方法，同时介绍了它们在无机元素分析物中的应用情况。 关键字：电化学检测、毛细管电泳；无机阴离子、金属阳离子。 目录： 1.简介--------------------------------------------------------------1 2.电导检测法--------------------------------------------------------2 2.1原理----------------------------------------------------------2 2.2实现方法------------------------------------------------------3 3安培检测法--------------------------------------------------------6 3.1原理----------------------------------------------------------6 3.2实现方法------------------------------------------------------6 4电位检测法--------------------------------------------------------5 4.1原理----------------------------------------------------------9 4.2实现方法------------------------------------------------------9 5在无机元素中的应用------------------------------------------------9 6总结-------------------------------------------------------------10 7参考文献---------------------------------------------------------10 1．简介 毛细管电泳的检测方法通常采用光学方法（激光诱导荧光检测法），而毛细管电泳的三种电化学检测法即电导测定法、安培检测法、和电位测定法是非常有吸引力的一种替代方法，尽管目前开发的还相对较少。相对套色板离子法来说（其他和以前一般化的检测方法）他主要借助于电导性能而不是运用光学方法。由与针对毛细管中更小体积细胞的光学检测变得更加困难，而且事实上许多离子也不能直接由光学方法直接检测到，或许当人们意识到这些的时候会感到很惊讶。关于这一情况或许有两种解释。首先由于高性能流体套色板的广泛应用，我们在毛细管电泳中通常采用光学吸收检测法，许多毛细管电泳仪器制造商似乎已经走上
信阳师范学院 研究生课程论文 2014—2015学年第1学期 毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展提交日期：2015 年 1 月 6 日研究生签名：
毛细管电泳电化学发光联用技术及应用新进展 姓名：学号：2 摘要：生命与健康是关系人类生活和可持续发展的永恒话题。为了检测食品中的有毒物质和人类身体内的有害物质，并达到快速检测和灵敏度高的目的，毛细管电泳(CE)和电化学发光(ECL)技术相结合的方法应运而生。这种方法充分利用了CE技术快速、灵敏、需样量少的优点及ECL线性范围宽和仪器简单的特点，使其在生命和医药等方面得到了广泛的应用。 关键词：毛细管电泳；电化学发光；生命；医药 引言 毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis，CE)也叫做高效毛细管电泳(HPCE)，是二十世纪八十年代问世的高效液相分离法之一[1]，是将经典的电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。它是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性(大小、电荷、等电点、极性、亲和行为、相分配特性等)为依据的液相微分离分析技术。与传统的分离分析方法相比，毛细管电泳显著特点是简单、高效、快速和微量。另外，毛细管电泳还有经济、清洁、易于自动化和环境污染小等优点。因此，毛细管电泳迅速发展为高效的分离和检测技术，广泛应用于物质的检测与分离。 电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)是指电极表面通过电子的转移形成激发态，电子从激发态返回基态而产生的发光过程[2]，由电极上施加的电压所引发和控制[3]，以电激发为驱动力，通过电化学反应产生光信号。因此，电化学发光兼有化学发光的特点，是一种可控性强，灵敏度高的检测方法。 将毛细管电泳和电化学发光技术联用，产生了毛细管电泳-电化学发光检测技术(CE-ECL)，该技术兼有CE微量、迅速、高效及ECL高选择性、高灵敏等特点。这些特点使CE-ECL检测技术在药物分析、生命分析等领域应用越来越广泛，在实际样品的分离和分析工作中也发挥着重要的作用。本文主要简述毛细管电泳-电化学发光联用技术在各个领域的应用进展。 1. 毛细管电泳-电化学发光联用技术
实验三等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点 一、实验目的 了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定，掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。 二、实验原理 等电聚焦（Isoelectric focusing，简称IEF）是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点（pI）只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。 蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置。这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。 两性电解质载体，实际上是许多异构和同系物的混合物，它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte，价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质，价格便宜，质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下，能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀，则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强，有良好的导电性，分子量要小，不干扰被分析的样品等。 在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后，如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散，稳定pH梯度，就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质，最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时，凝胶柱内即产生pH梯度，当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位，而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时，该蛋白质即聚焦形成一条区带，只要测出此区带所处部位的pH值，即为其等电点。电泳时间越长，蛋白质聚焦的区带就越集中，越狭窄，因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点，不像一般的其他电泳，电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点，而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分185
中文5300字 毕业设计（论文）外文翻译 Electrochemical detection methods in capillary electrophoresis and applications to inorganic species 毛细管电泳电化学检测方法 在无机元素中的应用 出处：Journal of Chromatography A, 1999, 834(1): 89-101
电化学检测法在毛细管电泳 和无机元素中的应用 Thomas Kappes, Peter C. Hauser 摘要： 本文论述了毛细管电泳的三种电化学检测即电导检测法、安培检测法和电位检测法，并与较常见的光学检测方法进行了比较。详细介绍了三种检测方法的原理及其实现方法，同时介绍了它们在无机元素分析物中的应用情况。 关键字：电化学检测、毛细管电泳；无机阴离子、金属阳离子。 目录： 1.简介--------------------------------------------------------------1 2.电导检测法--------------------------------------------------------2 2.1原理----------------------------------------------------------2 2.2实现方法------------------------------------------------------3 3安培检测法--------------------------------------------------------6 3.1原理----------------------------------------------------------6 3.2实现方法------------------------------------------------------6 4电位检测法--------------------------------------------------------5 4.1原理----------------------------------------------------------9 4.2实现方法------------------------------------------------------9 5在无机元素中的应用------------------------------------------------9 6总结-------------------------------------------------------------10 7参考文献---------------------------------------------------------10
收稿日期:2002-12-05 通讯联系人:曹玉华 第20卷第2期Vol .20 N o .2分析科学学报 JOU RNA L OF ANA LY T ICA L SCIENCE 2004年4月A pr . 2004 文章编号:1006-6144(2004)02-0187-03 毛细管电泳电化学检测测定阿司匹林 水解反应速率常数 曹玉华,汪 云 (江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036) 摘 要:本文利用毛细管电泳-电化学检测方法研究了阿司匹林水解产物水杨酸的浓度 随反应时间变化的规律。在pH 7.4的中性条件下,在不同温度下对阿司匹林水解反应 速率进行了测定,并分别求得反应活化能E a 为786.8kJ /mol 。 关键词:毛细管电泳;电化学检测;阿司匹林;反应速率常数;水解 中图分类号:O657.8;R917 文献标识码:A 阿司匹林为最常用的解热镇痛抗炎药,解热、镇痛作用温和,抗炎和抗风湿作用较强,并有促进尿酸排泄作用。但是,阿司匹林容易水解,其水解产物水杨酸对胃肠道有刺激作用,可出现恶心、呕吐等现象,严重时导致胃肠道出血[1]。所以研究阿司匹林的水解反应速率及相关动力学常数有重要的意义。 阿司匹林水解反应为二级反应[2],如果保持溶液的pH 值恒定,可以认为阿司匹林水解反应是准一级 反应。目前已有一些研究阿司匹林水解反应的报道[3-5],但尚未见毛细管电泳法用于测定该药物的水解 反应速率常数的研究。目前,毛细管电泳-电化学检测(CE -ED )的应用主要用于定量分析领域,而将它运 用于物理化学常数的测定还不多[6,7]。将毛细管电泳引入到蔗糖、乳糖、麦芽糖水解的反应速率常数的测 定中,取得了较为满意的结果[8,9]。 本文以碳圆盘电极为工作电极,用CE -ED 技术对阿司匹林水解反应速率常数及相关的反应活化能进行了测定,该法能直观地监测反应产物———水杨酸的电泳峰高随着水解反应的进程而发生的变化,方法直观、可靠,结果令人满意。 1 实验部分 1.1 仪器装置与试剂 自组装毛细管电泳-柱端射壁安培法电化学检测系统[10],三电极工作系统(300μm 碳圆盘工作电极,铂对电极,饱和甘汞参比电极);超级恒温水浴(重庆实验仪器厂)。 阿司匹林(Sigma ,USA ),水杨酸(分析纯,上海试剂公司),0.2mol /L 的NaH 2PO 4-Na 2HPO 4缓冲溶液(pH 7.4)。 1.2 实验方法 实验前先用金相砂纸对碳圆盘工作电极抛光,在超声波下清洗2min ,用三维定位调节器使工作电极与毛细管成一直线,并靠近毛细管端口。在长45cm 的毛细管两端加高压电源,微电流经LC -3D 型安培检测器放大后由记录仪记录毛细管电泳图。在22kV 下电迁移进样8s 。 1.3 水解反应步骤 在10mL 容量瓶中加入9.5mL 0.2mol /L 磷酸盐缓冲液(pH 7.4),在超级恒温槽中加热至所需水解温度(分别为55、60、65和70℃);将0.5m L 已恒温的0.1000mol /L 阿司匹林乙醇溶液迅速加入到容量瓶中,在注入一半时记下反应起始时间,然后每隔15min 移取100μL 水解溶液,迅速加入到0.9m L pH 187
等电聚焦电泳方法的建立和牛凝血酶等电点的初步 测定1 常灏，黄耀江，沈光涛 中央民族大学生命与环境科学学院，北京（100081） E-mail：haobio@https://www.doczj.com/doc/9e4922880.html, 摘要：作为一种新型的速效局部止血药和工具酶，凝血酶在临床和生物学研究中的应用十分广泛，牛血浆是其重要的来源之一。等电点沉淀是提取牛凝血酶首要和关键的步骤，测定其等电点后，再用此法时将得到更纯的凝血酶粗制品。本实验的目的是通过测定胰蛋白酶的等电点建立载体两性电解质等电聚焦电泳的方法，并以该方法结合SDS-PAGE测定牛凝血酶的等电点。经双向电泳后，SDS聚丙烯酰胺凝胶中出现了4个清晰的斑点，分别测定它们的分子量和等电点，其中一个斑点与牛凝血酶B链的分子量一致为32kDa，其等电点为5.19。 关键词：牛凝血酶，等电点，等电聚焦，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 引言 凝血酶（Thrombin，EC3.4.21.5）是一种丝氨酸蛋白水解酶，在血液凝固系统中起重要作用。它能催化溶胶态的纤维蛋白原转变为凝胶态的纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。[1][2]凝血酶在参与凝血作用的同时，对底物还具有高度的特异性，可以专一性地切割X-Arg-Gly或Gly-Arg-X序列中由精氨酸羧基参与形成的肽键。 [3] 由于凝血酶具有以上的特性，近年来使其成为一种新型的速效局部止血药，在临床上被广泛应用于消化道出血和外科手术止血。[1]此外，利用其作用的特异性，还可作为工具酶用来加工目的产物，在医学和生物学研究上的用途也很广泛。 现在，制备凝血酶的原料多为牛、猪和人的血浆。我国猪血的来源相当广泛，随着开发利用猪血的意识逐渐提高，有关猪凝血酶提取方法的文献报道也越来越多。目前，凝血酶的制备方法主要有柠檬酸钡吸附法、氢氧化镁吸附法和等电点沉淀法3种。[1]其中等电点沉淀法是最简单易行的分离方法，也是后续纯化工作的基础。凝血酶的等电点在5.0～5.5之间[1]，但物种之间是有差异的。已有报道显示，将猪血浆采用适宜的稀释度稀释后，用1%或2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可将猪凝血酶原粗制品沉淀出来。[2][4][5][6] 在我国，牛血的来源也是比较丰富的，因此从牛血中提取凝血酶也具有一定的社会意义。欲利用等电点沉淀法得到牛凝血酶的粗制品，需预先得知其等电点。虽然已有文献报道，将牛血浆稀释10倍后，用2%冰醋酸调pH至5.0~5.3，可沉淀出牛凝血酶原[7]，但其等电点的准确值在文献中尚未见报道。 随着系统生物学和蛋白质组学的迅速发展，作为其主要的研究手段之一的电泳，应用范围越来越广泛和普遍。等电聚焦（Isoelectric Focusing, IEF）电泳技术，凭借其高分辨率等优点，现已成为一种被广泛采用的蛋白质分析和制备技术。它不仅可以测定蛋白质的等电点，分离混合的蛋白质，而且与SDS-PAGE组成双向电泳后可大大提高分离蛋白质的能力。因此，可以采用双向电泳的方法（第一向：IEF，第二向：SDS-PAGE），测定牛凝血酶的等电点。根据凝胶过滤法的测定，牛凝血酶的相对分子质量为37 kDa，由两条多肽链通过一个二硫键相连，A链为5kD，B链为32kD。[2]这样就可以在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中确定牛凝血酶的条带，从IEF中得知其等电点。等电点测定后，使得采用等电点沉淀法获取牛凝血酶粗制品时纯度更高，有利于纯化操作和研究其功能，以及其它相关研究工作的进行。 2.等电聚焦基本原理 1本课题得到学校“211工程”基金资助。
SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？ ①溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。为了保证蛋白质
与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS 单体才具有较高的平衡浓度。所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。Sample buffer 中的β-巯基乙醇的浓度常为4-5%，二硫苏糖醇的浓度常为2-3%。前者有挥发性，最好使用前加入。 SDS-PAGE缓冲液系统的选择，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸盐或者其他？ 一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。 积层胶（或称浓缩胶）的作用原理？
下面是对毛细管电泳的摘录总结，并非自己创作，非占有版权 产品可广泛应用于遗传分析，疾病检测，以及食品鉴定等。可对多重PCR产物进行病原微生物检测，动植物SSR标记检测，转基因食品及动植物检测，SNP, Microsatellites, RFLP, STR 等。新型生物药物的质量保证/质量控制、环境分析、食品安全和生命科学等领域。 白质、DNA、细胞、免疫等前沿领域的科学研究提供了一个新的多功能分析平台，也为一些重大疾病的早期诊断和医治提供了有力的支撑，是我国电分析化学领域。汇聚电分析化学、分离科学、电子工程、物理、自动化控制和机械加工等方面的专家及技术人员，历时三年多研制而成，广泛应用于生命科学、医药科学、分子生物学、环境科学及单细胞、单分子分析等领域。 可广泛用于无机离子、药物、生物、环境分析以及氨基酸、蛋白质、DNA分离分析。对映异构体的手性分子分离；中药成分鉴定及杂质测定等；糖及其缀和物的分析（单糖组成的测定等）；核酸及碎片分析（片段分离，DNA测定，基因分析）；蛋白质或核酸的分子的相互作用。 与传统的电泳技术一样，CE的主要应用领域是生命科学，分离对象主要涉及氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等生物分子。CE技术一开始就紧紧地结合这一重点应用领域，开展了消除管壁吸附、提高分离度等一系列的研究。至今，CE分离蛋白质有了很大的进展，分离效率达到了105～106理论塔板数。样品已从模型蛋白质转到生物工程等实际样品。对蛋白质结构分析具有重要意义的“肽图”(Peptide mapping)，对人体基因工程有决定性作用的DNA测序等许多当代生命科学中的分离分析问题，CE都已涉足，而且将日益向深度和广度扩展。 由于HPCE具有高效、快速和样品用量少等特点，在应用于生命科学的同时，近年来迅速扩展到其它领域，包括食品化学、药物化学、环境化学、毒物学、医学和法医学等。用CE分离无机离子，可在1.8min内分离18种阳离子，3min内分离30种阴离子，它在无机离子分离方面无以伦比的能力，使已盛行十几年的离子色谱黯然失色。CE分离有机分子、药物分子，特别是手性分子和生物大分子方面的能力，也对HPLC地位提出了严峻的挑战。 核酸的分析 核酸是基本遗传物质。HPCE对DNA、RNA及其水解产物核苷酸等的分离研究是热门课题之一。用MECC在40min以内分离出14种核酸成分。采用动态pH梯度将CZE扩展到具有不同pK值混合物，分离出11种嘌呤和嘧啶混合物。从水解的RNA中用CZE在5min以内分离
0541电泳法 第六法等电聚焦电泳法 等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。 本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。方法 1：垂直板电泳法 除各论中另有规定外，按以下方法测定。 1.仪器装置 恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。 2.试剂 (1)水(电阻率不低于 18.2MΩ?cm)。 (2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。 (3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。 (4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3?10)溶
液 4ml，加水至 20ml。加 0.1%甲基红溶液 20μl。 (5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。 (6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。 (7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。 (8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60?70℃水浴中加热，使溶解。 (9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。 (10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。 (11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。 3.测定法 (1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3?10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。 (2)供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后，与供试品缓冲液按 3:1 体积比混匀。供试品溶液最终浓度应不低于
毛细管电泳电化学检测分离测定毛发中的色氨酸酪氨酸和半胱氨酸 1.试验部分 1.1仪器与试剂 毛细管电泳-电化学检测系统(CE - ED) 为自组装, 包括±30 kV 高压电源(上海原子核研究所) ；三电极工作系统（直径为300μm的碳圆盘电极为检测电极、铂丝为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极）；三维定位调节器（上海联谊光纤激光 器械厂）；BAS LC- 3D 安培检测器(Bioanalytical Systems , USA) ；HW色谱工作 站（上海千谱软件有限公司）；熔融石英毛细管(长70cm，内径25μm，河北永年光导纤维厂)；超声波清洗器；毛细管清洗器（上海医科大学仪器厂）；分析天平色氨酸，酪氨酸，半胱氨酸；头发样品：志愿者提供；其它试剂为分析纯。 1.2标准溶液及样品溶液的制备 标准溶液：色氨酸，半胱氨酸储备液：1.0×10- 3 g/m L，酪氨酸储备液：0.5×10- 3 g/m L，用50mmol/L硼砂－20mmol/L氢氧化钠溶液配置，再用运行缓冲液稀 释至所需浓度。 样品溶液：将头发用石油醚脱脂，干燥后称取50mg置于水解管中，加入3mL6mol/L氢氧化钠（含0.5％可溶性淀粉）；水解管用真空泵抽真空3min，在酒精 喷灯上封管；然后，将封好的水解管置于110o C烘箱中水解20小时。将水解液置于已 加有2.9mL6mol/L盐酸溶液的25mL容量瓶中，用蒸馏水洗涤水解管3～4次，最后用 蒸馏水定容。 1.3 试验方法 毛细管使用前依次用0.1mol/L的NaOH、二次水、缓冲液各冲洗5min、2min、10min。自制碳圆盘电极使用前要用细砂纸打磨，并用超声波清洗2min，使用自组装的CE-ED检测系统，通过三维定位调节器使工作电极与毛细管的出口在同一直线上，并尽可能靠近毛细管的末端，以50mmol/L的硼砂（pH ＝8.98）缓冲液为运行液，采用电动进样，检测池内为0.1mol/L的NaO H溶液，阴极电泳槽为检测端。所有溶液使用前均用0.25μm聚丙烯滤膜过滤。 2 结果与讨论 2.1 3种氨基酸的分子量及等电点的比较 3种氨基酸的分子量：色氨酸（M r=204.11）>酪氨酸（M r=181.09）》半胱氨酸（M r=121.12）；等电点：色氨酸（pI=5.89）> 酪氨酸（pI=5.66）> 半胱氨酸（pI=5.07）；毛细管电泳的分
收稿日期:2002-12-12;修回日期:2003-09-13 作者简介:曹玉华(1964-),女,江苏通州人,副教授,博士. 毛细管电泳电化学检测法测定胡黄连中 香草酸和阿魏酸的含量 曹玉华,汪云 (江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214036) 摘要:采用毛细管电泳电化学检测法测定了胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量;研究了电极电位、运行缓冲液的浓度和酸度、电泳电压及进样时间等对电泳的影响,得到了最优化的测定条件;以直径为300μm 的碳圆盘电极为检测电极,工作电极电位为0.8V (v s .SCE ),在50mm ol/L 硼砂(p H 8.4)运行缓冲液中,上述两组分 在8m in 内完全分离;香草酸和阿魏酸线性范围分别为5×10-4～1×10-6m ol/L 和1×10-3～1×10-6m ol/L ,检出限分别为4.2×10-7和3.0×10-7m ol/L ;7次平行进样的相对标准偏差(RS D )为2.2%和2.8%,回收率 (n =3)分别为99%和103%,该法灵敏可靠,结果令人满意。 关键词:毛细管电泳;电化学检测;胡黄连;香草酸;阿魏酸中图分类号:O657.8;Q949.777.8 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2003)06-0095-03 胡黄连为玄参科植物胡黄连的根茎[1],具有清热凉血、燥湿消疳的作用[2],用于治疗肝脏、肺部疾病,也可治疗慢性痢疾[3]。主要含胡黄连素、胡黄连醇、D -甘露醇、香草酸、三棕榈酸甘油脂、类倍半萜挥发油及少量的阿魏酸等芳香酸。1995年版的《中国药典》是以香草酸为胡黄连的质量检测依据。已有薄层扫描[4]、高效液相色谱[5,6]、毛细管电泳-紫外检测[7]用于胡黄连中的酚酸、胡黄连甙的分析。毛细管电泳(CE )具有分离效率高,消耗样品少,无需昂贵的色谱柱与复杂的前处理等诸多优点,且电化学检测(ED )对于电活性物质不仅具有较高的灵敏度,且具有选择性,对于复杂的中药测定体系,CE -ED 法极具潜力。本文建立了用CE -ED 测定胡黄连中香草酸、阿魏酸含量的方法,为制订其质量标准提供依据。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 毛细管电泳-电化学检测系统(CE -ED )为自组装[8],包括±30kV 高压电源(上海原子核研究所),BAS LC-3D 安培检测器(Bioanal y tical S y stems ,USA ),XW DT -164型记录仪(上海大华仪表厂),50cm 长熔融石英毛细管(内径25μm ,外径360μm ,P ol y m icro T echnolo g ies ,USA )。香草酸、阿魏酸(生物试剂,上海试剂二厂),胡黄连购于上海、苏州药店,其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。 1.2溶液配制 香草酸和阿魏酸标准储备液:1×10-2 m ol/L ,用无水乙醇配制,再用运行缓冲液稀释至所需浓度。 1.3 实验方法 使用自组装的CE -ED 装置,电化学检测池为三电极体系:碳圆盘电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE )为参比电极,铂丝为辅助电极。通过三维定位调节器使工作电极与毛细管出口在同一直线上,并尽可能靠近毛细管末端。采用电动进样,在14kV 下从毛细管阳极端进样6s ,检测池为阴极电泳槽。 2 结果与讨论 2.1 电泳条件的选择 2.1.1 香草酸和阿魏酸的流体伏安图图1为香草酸和阿魏酸 在碳圆盘电极上的H DV 图,从图中可以看出,电位大于0.40V 第22卷第6期分析测试学报 V ol.22N o.62003年11月 FENXI CESHI XUE BAO (Journal of Instrum ental Anal y sis )N ov.2003 图1香草酸和阿魏酸的流体伏安图 F i g .1H y drod y nam ic v oltamm o g ram (H DV )of vanillic acid and ferulic acid at 300μm diam eter carbon disk electrode in a 50mm ol/L borax buffer (p H 8.4) c (vanillic aci d )=c (ferulic acid )=2×10 -4 m ol/L