碱性磷酸酶测定试剂盒（化学发光免疫分析法）
适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中碱性磷酸酶的含量。
1.1 规格
48人份/盒，96人份/盒。
1.2 主要组成成分
2.1 外观
液体组分澄清，无沉淀或絮状物，其它组分无包装破损。
2.2 装量
装量不少于标示值。
2.3 准确性：
用等体积的S2（C）与S4（E）混合测试并计算本试剂盒的回收率，应在90％～110％范围内。
2.4线性
在[10，800]U /mL范围内，线性(r)≥0.9900。
2.5 精密度
测试批内精密度（C.V%）应不高于15.0%；测试批间精密度（C.V%）应不高于20.0%。
2.6 最低检出量
应不高于10.00 U /mL。
2.7特异性
碱性磷酸酶的交叉反应如下：
2.8 稳定性
2.8.1 37℃放置7天，测定结果应符合上述2.1～2.7项要求。
2.8.2 成品试剂盒2～8℃存放12个月后，测定结果应符合上述2.1～2.7项要求。
2.9 校准品溯源性
按照GB/T 21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》要求，该校准品溯源至本公司内部工作校准品，通过与双流正龙生化制品研究室的ALP原料稀释成碱性磷酸酶测定试剂盒比对赋值。
组织及血液碱性磷酸酶（AKP/ALP）活性检测试剂盒说明书微量法 货号：BC1595 规格：100T/48S 产品说明： AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。 自备仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。 标准品：液体×1支（EP管中），2μmol/mL酚标准液，4℃保存。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂 一）进行冰浴匀浆，4℃、10000rpm离心10min，取上清液待测。 2.血液可直接测定，或者适当稀释后测定。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。 2.试剂三置于37℃水浴中预热30min以上。 3.空白管：取EP管，加入4μL蒸馏水，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；
加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A空白管。 4.标准管：取EP管，加入4μL标准品，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min； 加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。 5.对照管：取EP管，加入40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂 四120μL，混匀；最后加入4μL上清液，混匀后于510nm测定吸光度，记为A对照管。 6.测定管：取EP管，加入4μL上清液，40μL试剂二，40μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min； 加入试剂四120μL，混匀后于510nm测定吸光度，记为A测定管。 其中标准管和空白管只需做一管，测定管和对照管每个样均需做。 三、AKP/ALP活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.血液中AKP/ALP活力计算 活性单位定义：37℃中每毫升血液每分钟催化产生1μmol酚定义为一个活性单位。 AKP/ALP活力(U/mL)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷V样×V样总÷T=6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管) C标准品：2μmol/mL；V反总：反应体系总体积（mL），1020μL=1.02mL；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），0.020mL；V样总：1mL；T：反应时间（min），15min。 2.组织中AKP/ALP活性计算 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol酚。 AKP/ALP(U/mg prot)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(Cpr×V样)÷T = 6.8×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr （2）按样本质量计算 活性单位定义：37℃中每克样品每分钟催化产生1μmol酚。 AKP/ALP(U/g)=[C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总]÷(V样÷V样总×W)÷T
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 微板法) 产品简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。 Leagene 碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用PNP 比色法，其检测原理是Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成p -nitrophenol 。在碱性条件下p -nitrophenol 转变成醌式结构，呈较深的黄色，产物黄色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法测定处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 产品组成： 自备材料： 1、 水浴锅或恒温箱 2、 96孔板 3、 酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 配制显色工作液： 取出1支pNPP ，恢复至室温后溶解于ALP Assay buffer ，混匀， 冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在6h 内用完。 2、 配制标准品工作液：取出p -nitrophenol(10mM)恢复至室温后，取10μl 溶解于190μ 编号 名称 TE0002 100T Storage 试剂(A): ALP Assay buffer 15ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支 -20℃ 避光 试剂(C): p -nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃ 避光 使用说明书 1份
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
附件1 碱性磷酸酶测定试剂盒注册 技术审查指导原则 （2016年修订版） 本指导原则旨在指导注册申请人对碱性磷酸酶测定试剂盒注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对碱性磷酸酶测定试剂盒的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 碱性磷酸酶测定试剂盒是指基于分光光度法原理对人血
清、血浆或其他体液中的碱性磷酸酶活性进行体外定量测定的试剂。本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。 碱性磷酸酶活性的测定方法目前主要有连续监测法和比色法两类： 1.连续监测法（磷酸对硝基苯酚底物法） 碱性磷酸酶催化水解磷酸对硝基苯酚（4-NPP），生成对硝基苯酚（4-NP），在特定波长处监测吸光度变化速率，可计算碱性磷酸酶活性。 2.比色法（磷酸苯二钠底物法） 碱性磷酸酶催化水解磷酸苯二钠，生成游离酚，酚与4-氨基安替比林结合，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，在特定波长处监测吸光度值，可计算碱性磷酸酶活性。 从方法学考虑，本文主要指以碱性磷酸酶水解底物引起特定产物的吸光度的改变对碱性磷酸酶活性进行定量测定的体外诊断试剂，不包括干化学和酶联免疫检测试剂。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），碱性磷酸酶检测试剂属于酶类检测试剂，管理类别为Ⅱ类，分类代号为6840。 二、注册申报资料要求
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的,但全自动机械制造却由日本的日立公司承担,所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了,其中我们一直无法解决的诸多问题(尤其是重现性均已得到解答,看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术,与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定,是目前最先进的标记免疫测定技术,是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术,具有敏感、快速和稳定的特点,在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光(ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应,循环及多次发光,后者是通过化合物混合启动发光反应,是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制,重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光(ECL和免疫测定相结合的产物,直接以[Ru(bpy3]2+标记抗体,反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行,产生许多光子,使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物,特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合,增大了抗体结合量,达到放大效果。在ECL的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体,另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法) 货号：G5610 有效期：6个月有效。 产品内容： 产品规格 试剂(A):ALP Assay buffer 2.5ml 试剂(B):ALP显色液 2.5ml 试剂(C):显色基液7.5ml 试剂(D):Phenol标准(1mg/ml)1ml 试剂(E):ddH2O1ml 产品说明： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。 碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠微板法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定510nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。该试
剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 自备材料： 96孔板、水浴锅或恒温箱、酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、配制标准品工作液：取出Phenol标准(1mg/ml)恢复至室温后，取0.1ml溶解于1.9ml ddH2O，使浓度达到0.05mg/ml，即为标准品工作液-Phenol(0.05mg/ml)。按照下表稀释系列标准品溶液。 012345 010******** Phenol(0.05mg/ml)(μ l) ddH2O(μl)55453525155 相当于金氏单位(U/L)010******** 2、准备样品： （1）细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清，-80℃冻存，用于碱性磷酸酯酶的检测。 （2）血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-80℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。 （3）高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或PBS 等进行稀释，如鸡血清、血浆可稀释5～10倍后检测。
常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA
本科毕业论文 题目：化学发光免疫分析技术 及在临床检验中的应用 学院：化学与环境工程学院 班级：2011级应用化学2班 姓名：王俊烽 指导教师：李小花职称：讲师 完成日期：2015年05 月 22 日
化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用 摘要：化学发光免疫分析技术（CLIA）是把免疫反应和化学发光检测方法结合的一种分析技术。其中免疫反应的特异性和灵敏度都很高。CLIA是在酶联免疫分析、放免疫分析和荧光免疫分析后面发展起来的一种检测技术。由于其具有操作简单，标记方便，稳定度和检测灵敏度高，速度快，对环境没有污染等优点因此CLIA在临床上受到医学检验者和医生的一致好评。 关键词：化学发光免疫分析技术；基本原理；临床；医学检验 CLIA Technology And Its Application in The Clinical Laboratory Abstract：Chemiluminescence immunoassay (CLIA) is an analytical technique the immune response and chemiluminescent detection methods combined. Which the immune response is very high specificity and sensitivity. CLIA is the enzyme-linked immunoassay, put immunoassay and fluorescence immunoassay later developed a detection technology. Because of its simple, easy to mark, high stability and sensitivity, speed, no environmental pollution, etc. Therefore CLIA praise medical tests and doctors at the clinic. Key words :chemiluminescent immunoassay; fundamental; clinical; medical laboratory
仅供科研使用版本号：180718 BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 【产品组成】 【保存条件】 4℃,避光,12个月。 【产品概述】 BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit)是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit可用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测\细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。 【使用方法】 1、对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗 涤液洗涤3～5次，每次3～5min。 2、对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3～5次，每 次3～5min。 3、按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液： 4、洗涤完毕后，去除洗涤液。 5、加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。 5、室温避光孵育5～30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。 6、去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应。 7、对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red staining solution)染色，以便于观察。对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。
IMMULITE ? 2000 全自动化学发光免疫分析仪 标准操作程序 本文件仅供参考，各实验室需根据各自情况建立自己的操作规程 IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统标准操作规程
SOP编码：页数： 制定人签名：日期： 审核人签名：日期： 批准人签名：日期： 生效日期：颁发日期：周期性审查：年一次 修订登记： 审查登记：
[目的]描述IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的使用和维护。 [范围] 适用IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的操作。 [仪器工作原理和检测过程] 1 IMMULITE 2000使用包被特定抗体的聚苯乙烯珠子作为固相，包被珠放在一个特定的反应杯中，从而进行温育，清洗以及信号发生。
2. 样本与结合了碱性磷酸酶的试剂温育反应结合之后，通过高速离心将剩余试剂甩到与反应杯同轴的废液管路中。系统在几秒钟内完成四次离心清洗，以便与系统的其他同步。去除未包被试剂的包被珠仍然保留在反应杯中。 3. 包被珠上的结合标记随后同发光底物进行定量发光。当包被珠上结合的碱性磷酸酶标记同化学发光底物反应时，就产生发光。发光强度同样本中待测物的含量有关。仪器通过光电倍增管检测发光强度，随后计算出每个样本的结果。 4. 操作者在IMMULITE 2000上运行测试时，需要做下列操作：： 4.1进行每日探针清洗工作。 4.2 选择RUN IMMULITE 2000按钮。 4.3 查系统状态指示，加满或者清空耗材或者废物。 4.4 初始化样本和试剂加样器、蒸馏水喷嘴和底物喷嘴。 4.5 使用图像扫描器扫描试剂转盘上的过敏原试剂楔。 4.6在样本转盘上装载病人血清、质控、校正液和稀释液。 注意: 运行仪器需要用到的试剂都在 IMMULITE 2000试剂盒中。只有需要预稀释的测试项目才会有稀释液。 4.7 在工作列表列表界面为样本指定测试项目以及编号。 4.8 检查试剂以及与之匹配的包被珠是否足够完成所需测试。 4.9选择RUN开始实验。 5. 仪器自动检测过程: 在操作者按下 RUN 按钮之后，Immulite 2000 自动开始检测并输出检测结 果。 5.1 在反应杯中加入一个包被珠。 5.2 样本，特定的试剂和水加入到包被珠上。 5.3 反应杯运到温育圈，在37°C (98.6°F)的环境中震荡温育。 5.4 清洗测试杯。 5.5 加入底物，发光。 5.6 光电倍增管(PMT)检测光子强度，计算结果并打印。 [免疫分析原理] 1.双抗体夹心法：双抗体夹心法使用ALP标记的抗体在检测单位中进行反应。 1.1 标记的抗体的液相试剂加到检测单位中，标记有ALP的特异性抗体(Ab※ALP)与样品中的相应抗
货号: QS2902 规格：50管/48样 土壤碱性磷酸酶活性测定试剂盒 分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。通常按照其最适pH范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。 测定原理： 碱性环境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-AKP/ALP活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、冰、蒸馏水、无水乙醇和甲苯。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。用前加50mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加1152μL无水乙醇（自备），48 μL蒸馏水充分溶解。（变褐色后不能再使用） 标准品：液体1.5mL×1瓶，0.5μmol/mL苯酚标准液，4℃保存。 催化反应： 称取风干混匀土壤约0.1g，加入50μL甲苯（自备），轻摇15min；加400μL试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1mL试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。8000g，25℃离心10min，取上清液置于冰上待测。 显色反应： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到660 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μL蒸馏水，100 μL试剂三，20 μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830 μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 空白管。 3. 标准管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μL标准液，100 μL试剂三，20 μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830 μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 标准管。 4. 测定管：取1mL玻璃比色皿，加入50 μL上清液，100 μL试剂三，20 μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830 μL，混匀后25℃静置30 min，于660 nm测定吸光度，记为A 测定管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 第1页，共2页
全自动化学发光免疫分析仪 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 该产品基于间接化学发光法，与配套的检测试剂共同使用，在临床上用于对来源于人体血清、血浆或者其他体液样本中的被分析物进行体外定性或定量检测。 1.1产品型号划分说明 1.2结构组成 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 1.3软件信息 1.3.1 软件名称：利德曼化学发光免疫分析仪器软件平台 1.3.2 发布版本：V1.0 1.3.3 版本命名规则 发布版本号：VX.Y 其中：VX.Y由version缩写V，主版本号及次版本号构成：表示正式发布的第一版程序。 X为主版本号，表示全功能集成第一个版本； Y为次版本号，表示此版本程序发布后暂时未发生变更。 1.3.4 运行环境 硬件配置：
CPU：主频1.7GHz以上。 内存：1G以上内存。 硬盘空间：40G以上均可。 软件配置：操作系统：WINDOWS 7 或WINDOWS 10。 2.1加样正确度与重复性 对仪器标称的样品最小加样量和最大加样量、试剂最小加样量和最大加样量进行检测，应符合表1的规定。 表1 加样正确度与重复性要求 2.2 反应区温度控制的正确度和波动度 反应区温度的偏倚应在：37.0℃±0.5℃，波动度不超过0.5℃。 2.3 光检测装置部分 2.3.1仪器噪声 检测空反应管的发光值应不大于200RLU。 2.3.2发光值的线性 在不小于3个发光值数量级范围内，线性相关系数（r）应≥0.99。 2.3.3发光值的重复性 采用发光剂法，变异系数（CV）不超过5％。 2.3.4发光值的稳定性 采用发光剂法，发光值的变化不超过±10％。 2.4 携带污染率 携带污染率应≤10-5。 2.5临床项目的批内精密度
碱性磷酸酶测定试剂盒（NPP底物-AMP缓冲液法）适用范围：用于体外定量测定人血清中的碱性磷酸酶的含量。1.1 包装规格 包装规格见表1。 表1 包装规格 1.2 主要组成成分 主要组成成分见表2。
表2 主要组成成分 2.1 外观 试剂1为无色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂2为淡黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 试剂盒标签标识清晰，外包装完整无损。 2.2 净含量 试剂的净含量应不少于标称量。 2.3 试剂空白 2.3.1 试剂空白吸光度 试剂空白：A405nm（主）/A600nm（副）下测定空白吸光度应≤0.5000。 2.3.2 试剂空白吸光度变化率 用生理盐水作为样品加入试剂测试时，试剂空白吸光度变化率（ΔA/min）应不大于0.005。 2.4 准确度
与已上市产品进行比对试验：在[3，1702] U/L区间内，相关系数r≥0.975，在[3，80]U/L区间内测定的绝对偏差应不超过±8U/L，在(80，1702]U/L区间内测定的相对偏差应不超过±10%。 2.5 分析灵敏度 测试120U/L碱性磷酸酶时，其吸光度变化率在0.0240～0.0480之间。 2.6 线性区间 测试血清样本，试剂线性在[3,1702]U/L区间内： a) 线性相关系数︱r︱应不小于0.990； b) [3,80]U/L区间内，线性绝对偏差应不超过±8U/L；(80,1702]U/L区间内，线性相对偏差应不超过±10%。 2.7 测量精密度 2.7.1 重复性 用血清样品或质控样品重复测试所得结果的重复性（变异系数，CV）应不大于5%。 2.7.2 批间差 随机抽取三批试剂盒的批间相对极差（R）应不大于10%。 2.8 稳定性 试剂盒在2℃～8℃密封避光保存，有效期为18个月。取到效期后的样品检测外观、试剂空白、准确度、线性区间应符合2.1、2.3、2.4、2.6的要求。
本文由：华夏学术传媒网提供https://www.doczj.com/doc/938241729.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒(PNP微板法) 简介： 酸酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)分布极广泛，遍布各种组织，主要存在于细胞的溶酶体内，所以常作为溶酶体标志酶。溶酶体外的酸性磷酸酶存在于内质网和胞质内，各种动物中的酸性磷酸酶各有不同，酸性磷酸酶的适宜pH为4.5～5.5。存在于正常人肺泡巨噬细胞和白血病人脾脏的抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistnt acid phosphatase，TRAP)均在细胞滤泡中，并不是释放入血液，血液中的TRAP绝大多数来源于破骨细胞，因此可以通过测量血液中的TRAP了解破骨细胞的功能状态，几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。TRAP一种糖基化的含金属蛋白酶，在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达，在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。 Leagene抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、96孔板 2、水浴锅或恒温箱 3、酶标仪编号 名称TE0043 120T Storage 试剂(A): ACP Assay buffer15ml 4℃ 试剂(B): pNPP 2支-20℃避光试剂(C): T artrate Solution 1ml 4℃ 试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 0.1ml -20℃避光使用说明书1份
化学发光免疫分析法(CLIA) A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法: (竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比) 一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B 值越小。例:A为一种抗原 小分子,有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A 抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。 二、仪器: 1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)
5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL) 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0、05mol/L PBS, 含0、05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0、05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7、4, 含2、0%BSA、0、5 %的水解明胶、0、1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢与对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品; 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存、 FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。(具体分析) 五、数据处理 通过测量标准品与样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理、线性方程采用的就是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln(y/1-y),y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度、根据标准品的浓度与发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品
化学发光免疫分析技术题库1-1-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不会影响标记的因素是（） A.被标记蛋白质的性质 B.原料比 C.温度 D.湿度 E.标记率 影响标记的因素包括：①发光剂的选择。②被标记蛋白质的性质。抗原作为被标志物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。③标记方法的选择应正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的耦联方式。④原料比。在制备发光剂-IgG抗体结合物时，IgG：发光剂：交联剂的克分子比mol：mol：mol会影响结合物的发光效率。⑤标记率。是指结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应于被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会出现不易保存等现象。⑥温度。控制标记时的反应温度极为重要，对于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。⑦纯化与保存。多数经耦联反应制备的结合物，使用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]不需酶催化反应即可发光的发光底物是（） A.吖啶酯 B.三联吡啶钌 C.鲁米诺或其衍生物 D.4-MUP E.AMPPD 吖啶酯化学发光特点：①推动发光的氧化反应简单快速，不需要催化剂，只要在碱性环境中即可进行；②反应体系中加入H2O2和NaOH溶液后，发光迅速，背景噪声低，保证了测定的敏感性；③吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标志物的生物学活性和理化特性；④吖啶酯发光为瞬间发光，持续时间短，因此对信号检测仪的灵敏度要求比较高。