分子生物学实验
1.TOMY全自动灭菌锅的使用
（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。
（2）SET键设置温度和时间（121℃，20min）
（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降至80℃以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。
（5）腔体内经常清洁。
2.LB液体培养基（1000mL）
将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000mL，121℃湿热灭菌20min。冷却后4℃保存备用。固体还要再加琼脂。
3.碱裂解法
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们的。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此缠绕，仍会紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。
溶液Ⅱ：氢氧化钠，SDS 氢氧化钠加入后碱性环境12-12.5促使染色体DNA与质粒的变性解离成单链。SDS是一种阴离子去垢剂，它的主要作用有：①溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；②解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与DNA分开；③SDS能与蛋白质结合成为SDS-蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止对DNA的降解。
溶液Ⅲ：乙酸钾。用pH4.2的KAc溶液是为了调整溶液pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L醋酸钾(KAc)有利于变性的大分子染色体DNA、RNA 以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。
4.loading buffer
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。
5.限制性内切酶
（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA 分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。6.引物设计和选择目的DNA序列区域时遵循下列原则：
引物长度约为16～30bp；引物中G+C含量通常为40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估计引物的解链温度；四种碱基应随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，因这样易导致错误；引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构；两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量；引物5’端对扩增特异性影响不大，可引入酶切位点或突变位点；引物不与模板结合位点以外的序列互补；简并引物应选用简并程度低的密码子；引物的浓度一般为0.1～0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，引物浓度偏低则降低产量。
7.dNTP
常用的浓度为20～200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等，以减少合成中由于某种dNTP 的不足而出现的错误掺入；dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，同时会抑制Taq DNA聚合酶的反应活性；适当的低浓度会提高反应的精确度；注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。
8.感受态
处于对数生长期的细菌经低温CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态,以摄取外源DNA。
9.转化
转化是将外源DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
10.DNA连接酶
有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶；DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过牛小肠碱性磷酸酶CIP处理克服；连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中的温度，即12～16℃，连接12～16h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定；
pMD18-T Vector 是一种高效克隆PCR 产物（TA Cloning）的专用载体，该载体由pUC18 载体改建并在其3’端添加“T”而成
大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率；
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程
11.α互补
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法；α互补：质粒载体上lacZ’基因编码的α肽段与失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突变受体菌之间实现互补的现象，由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal显色测定出来；任何携带着lacZ’基因的质粒载体在转化β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，在含有Xgal的培养基平板上形成蓝色菌落，而含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实习总结 三天的分子生物学实习，我能认真听老师的讲解和很好的按照老师的安排完成实验。期间，接触和学习到了很多有关分子生物学实验的方法、仪器的使用、技术，而且对分子生物学实验有一个大致的了解，学习到很多以前没有接触过的知识。 这几天来做的不足的地方有： 1.预习不够充分。只是浏览了实验报告上的原理、操作等内容，并没有深入了解每一个步骤的操作会对实验有什么的作用和影响。实验失败了，不能自主找到原因。 2.实验操作过程不够细心。实验要求十分细心，严谨和专注。实验中很多细小的地方还是没有很好的注意到。 3.遇到不懂的没有及时发问。实验就是一个让我们实操的过程，一边操作一边巩固书本上的知识。过程中，遇到不明白的地方应该及时问别人活着自己翻阅资料，力求把实验弄透彻。 但是我还是有很多收获的： 1.对分子生物学实验有了了解。例如实验的基本的流程和操作，常用的方法等基础知识已经有了一定了解，对以后的实验会有一定的帮助。 2.最基本的移液枪、离心机、涡旋器等的使用还有实验中的PCR仪、电泳等有一定的认。 3.学会了严谨和细心。实验所用的材料都是比较昂贵的，而且实验只要一步错了，就得重做。所以需要非常严谨。不仅仅是分子生物学实验，其他实验也要求，所以培养这个有点对以后的实验非常有好处。 4.学会了坚持。很多次因为实验做的时间很长，大家都会很累，但是，还是要坚持，一点点累都受不了是不能把实验做好的。开始慢慢了解到做科研的人员的辛酸，长时间整天呆在实验室做实验，这需要很大的毅力。 5.把握实验机会，让自己学得更多。实验过程中，只要有实操的机会，我都会去操作。因为说和做是不一样的。而且在操作中能加深巩固知识和学得更加深入。 三天的分子生物学实习虽然很累，因为要天天去院楼，而却实验时间都比较长。但是 还是很有意义的，因为学习到很到东西，收获了很多。 老师也为我们准备了很多的材料和准备，实验才做得那么快和顺利，其实，实验室简 化了很多了，而且我们所做的实验都是已经设计好的，按照操作做就行了。如果时间和资 金允许，应该设立一些自主完成的实验，这样可以培养我们更加多的能力，开阔知识面和 拓宽思维。
结合着下载的资料复习吧~~~~ 绪论 分子生物学的发展简史 Schleiden和Schwann提出“细胞学说” 孟德尔提出了“遗传因子”的概念、分离定律、独立分配规律 Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离出DNA Morgan基因存在于染色体上、连锁遗传规律 Avery证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体 McClintock首次提出转座子或跳跃基因概念 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 Crick提出了“中心法则” Meselson与Stah用N重同位素证明了DNA复制是一种半保留复制 Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型 Arber首次发现DNA限制性内切酶的存在 Temin和Baltimore发现在病毒中存在以RNA为模板，逆转录成DNA的逆转录酶 哪几种经典实验证明了DNA是遗传物质? (Avery等进行的肺炎双球菌转化实验、Hershey 利用放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质外壳和DNA) 第二章染色体与DNA 第一节染色体 一、真核细胞染色体的组成 DNA：组蛋白：非组蛋白：RNA = 1：1：(1-1.5)：0.05 （一）蛋白质（组蛋白、非组蛋白） （1）组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 功能：①核小体组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）作用是将DNA分子盘绕成核小体
②不参加核小体组建的组蛋白H1，在构成核小体时起连接作用 （2）非组蛋白：包括以DNA为底物的酶、作用于组蛋白的酶、RNA聚合酶等。常见的有（HMG蛋白、DNA结合蛋白） 二、染色质 染色体：分裂期由染色质聚缩形成。 染色质：线性复合结构，间期遗传物质存在形式。 常染色质（着色浅） 具间期染色质形态特征和着色特征染色质 异染色质（着色深） 结构性异染色质兼性异染色质 （在整个细胞周期内都处于凝集状态）（特定时期处于凝集状态）三、核小体 由H2A、H2B、H3、H4各2 分子组成的八聚体和绕在八聚体外的DNA、一分 子H1组成。八聚体在中央，DNA分子盘绕在外，由此形成核心颗粒。,H1结合在核心颗粒外侧DNA双链的进出口端，如搭扣将绕在八聚体外DNA链固定，核心颗粒之间的连接部分为连接DNA。 核小体的定位对转录有促进作用
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。 一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感分子生物学实验的"试炼"。 分子生物学实验心得体会 东强（生科01级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA的制备、PCR技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值。
Section A 细胞与大分子 简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。 Section C 核酸的性质 1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些？ A 发生在闭环双链DNA分子上 B DNA双链轴线高卷曲，与简单的环状相比，连接数发生变化 C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时，DNA变得紧绷，为正超螺旋，反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的，因为能量最低。 2.简述核酸的性质。 A 核酸的稳定性：由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定 B 酸效应：在强酸和高温条件下，核酸完全水解，而在稀酸条件下，DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸 C 碱效应：当PH超出生理范围时（7-8），碱基的互变异构态发生变化 D 化学变性：一些化学物质如尿素，甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的 而使核酸变性。 E 粘性：DNA的粘性是由其形态决定的，DNA分子细长，称为高轴比，可被机械力和超声波剪切而粘性下降。 F 浮力密度：1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析 G 紫外线吸收：核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收 H 减色性，热变性，复性。 思考题：提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质？ 质粒是抗性基因，，在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。 Sectio C 课前提问 1.在1.5mL的离心管中有500μL，取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测，测得A260=0.15。 问（1）：试管中的DNA浓度是多少？ 问（2）：如果测得A280=0.078, .A260/A280=？说明什么问题？ (1)稀释前的浓度：0.15/20=0.0075 稀释后的浓度：0.0075/100=0.75ug/ml （2）0.15/0.078=1.92〉1.8，说明DNA中混有RNA样品。 2.解释以下两幅图
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
《实验报告总结》 实验报告总结（一）： 一个长学期的电路原理，让我学到了很多东西，从最开始的什么都不懂，到此刻的略懂一二。 在学习知识上面，开始的时候完全是老师讲什么就做什么，感觉速度还是比较快的，跟理论也没什么差距。但是之后就觉得越来越麻烦了。从最开始的误差分析，实验报告写了很多，但是真正掌握的确不多，到最后的回转器，负阻，感觉都是理论没有很好的跟上实践，很多状况下是在实验出现象以后在去想理论。在实验这门课中给我最大的感受就是，必须要先弄清楚原理，在做实验，这样又快又好。 在养成习惯方面，最开始的时候我做实验都是没有什么条理，想到哪里就做到哪里。比如说测量三相电，有很多种状况，有中线，无中线，三角形接线法还是Y形接线法，在这个实验中，如果选取恰当的顺序就能够减少很多接线，做实验就应要有良好的习惯，就应在做实验之前想好这个实验要求什么，有几个步骤，就应怎样安排才最合理，其实这也映射到做事情，不管做什么事情，就应都要想想目的和过程，这样才能高效的完成。电原实验开始的几周上课时间不是很固定，实验报告也累计了很多，第一次感觉有那么多实验报告要写，在交实验报告的前一天很多同学都通宵了的，这说明我们都没有合理的安排好自己的时间，我就应从这件事情中吸取教训，合理安排自己的时间，完成就应完成的学习任务。这学期做的一些实验都需要严谨的态度。在负阻的实验中，我和同组的同学连了两三次才把负阻链接好，又浪费时间，又没有效果，在这个实验中，有很多线，很容易插错，所以要个性仔细。 在最后的综合实验中，我更是受益匪浅。完整的做出了一个红外测量角度的仪器，虽然不是个性准确。我和我组员分工合作，各自完成自己的模块。我负责的是单片机，和数码显示电路。这两块都是比较简单的，但是数码显示个性需要细致，由于我自己是一个粗心的人，所以数码管我检查了很多遍，做了很多无用功。 总结：电路原理实验最后给我留下的是：严谨的学习态度。做什么事情都要认真，争取一次性做好，人生没有太多时间去浪费。 实验报告总结（二）： 在分子生物学实验室为期两个月的实习使我受益匪浅，我不仅仅学习到了专业知识，更重要的是收获了经验与体会，这些使我一生受用不尽，记下来与大家共勉： 1.手脚勤快，热心帮忙他人。初来匝道，不管是不是自己的份内之事，都就应用心去完成，也许自己累点，但你会收获很多，无论是知识与经验还是别人的称赞与认可。 2.多学多问，学会他人技能。学问学问，无问不成学。知识和经验的收获能够说与勤学好问是成正比的，要记住知识总是垂青那些善于提问的人。 3.善于思考，真正消化知识。有知到识，永远不是那么简单的事，当你真正学会去思考时，他人的知识才能变成你自己的东西。 4.前人铺路，后人修路。墨守陈规永远不会有新的建树，前人的道路固然重要，但是学会另辟蹊径更为重要。
现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)
一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠，发现有大量活的S型细菌。实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。
二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性：1、进化上极端保守，特别是H3、H4；2、无组织特异性；3、肽链上氨基酸分布的不对称性；4、存在较普遍的修饰作用；5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白：HMG蛋白；DNA结合蛋白；A24非组蛋白
真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值，在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的，高等生物的C 值一般大于低等动物，但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大，这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类：不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点：1、真核生物基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组；2、真核基因组存在大量的的重复序列；3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90%以上，这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别；4、真核基因组的转录产物为单顺反之；5、真核基因组是断裂基因，有内含子结构；6、真核基因组存在大量的顺式元件，包括启动子、增强子、沉默子等；7、真核基因组中存在大量的DNA多态性；8、真核基因组具有端粒结构。
分子生物学 第一章绪论 分子生物学研究内容有哪些方面？ 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、Tm(熔链温度)：DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分 9、DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为3.4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0.34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。 特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列 11、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成：由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 复制型转座：整个转座子被复制，所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座：原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。 第三章DNA Replication and repair 1、半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱
实验教学心得体会10篇 实验心得（一） 实验室是培养高层次人才和开展科学研究的重要基地。在西方发达国家，学校对培养学生的动手潜力是分重视的，这一问题近年来也越来越受到我国教育界人士的广泛重视。为了提高学生的动手潜力，让学生做相关实训并完成单片机实验报告，在实验的形式上注重培养学生的实验技能和动手潜力。从单片机实验心得中学生就能够总结出超多的经验以适应当代社会的发展。 学习单片机这门课程(教学中选用inter公司的mcs-51)，要掌握单片机指令系统中汇编语言各种基本语句的好处及汇编语言程序设计的基本知识和方法，以及单片机与其他设备相连接的输入输出中断等接口-技术。使学生从硬件软件的结合上理论联系实际，提高动手潜力，从而全面掌握单片机的应用。 实验教学的全过程包括认识、基储综合3个阶段。以往的单片机实验是进行软件的编制和调试，与实际应用中的硬件电路相脱节。使学生缺乏硬件设计及调试分析潜力，对单片机如何构成一个单片机最小应用系统，缺乏认识。发布的单片机实验板，透过计算机连接仿真器在实验板上把硬件和软件结合起来一齐调试， 软件的修改也分方便，软件和硬件调试都透过后，把程序固化在eprom当中，插上8051单片机构成一个完整的单片机应用系统。 实验心得（二） 我觉得化工原理实验是一门验证性课程，它把我们在化工原
理学到的各种单元操作化为实实在在的东西，而让我们把学到的知识认识到它的实在性。流体输送——离心泵、过滤——板框压滤机、对流传热——套管式换热器、吸收蒸馏——填料塔板式塔、干燥——厢式干燥装置。一个个实验和装置让我们对每种单元操作都有了除理性认识之外的感性认识。 此刻回过头来看，在做实验前对实验的原理和操作步骤没有认真研究，导致有些实验做的效果并不好，这是预习不够充分的表现。认真的预习报告应要3小时左右，而我犯懒预习方面很敷衍，一小时就完事，于是就在做实验的过程中产生了许多问题，这是我应当深刻检讨的。正如《礼记中庸》所说“凡事豫（预）则立，不豫（预）则废，言前定则不跲，事前定则不困，行前定则不疚，道前定则不穷。”所以以后做实验不应急于开始实验，应搞清楚目的和设计流程的来龙去脉。另外感激俞教师实验前的仔细讲解让我做实验时不至于对整个流程不知所措。 做化工原理实验我感觉很有意思，因为实验数据并不是先定的，自我得出实验结论有一种成就感，这对培养我们不盲从、实证的思维方式有益，并且由于我们是分组实验，每4-5人一组，锻炼了我们的协作的本事。化学实验研究中中分工协作尤为重要，能够发挥整体效能提高进行实验的效率，取长补短，最重要的是团队精神和氛围会产生强大的动力，所以这方面的锻炼是化原实验中我的重要收获之一。 在进行实验和处理数据时，我们用到了非传统的方法用Excel、
分子生物学总结完整版 1、结构分子生物学； 2、基因表达的调节与控制； 3、DNA重组技术及其应用； 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 2、 DNA复性：变性DNA在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、 Tm(熔链温度)： DNA加热变性时，紫外吸收达到最大值的一半时的温度，即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度） 4、退火：热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，称为退火 5、假基因：基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、 C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致，称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座：可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子：染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分
9、 DNA二级结构的特点：1）DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成；2）DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在外侧；3）DNA分子表面有大沟和小沟；4）两条链间存在碱基互补，通过氢键连系，且A=T、G ≡ C（碱基互补原则）；5）螺旋的螺距为 3、4nm，直径为2nm，相邻两个碱基对之间的垂直距离为0、34nm，每圈螺旋包含10个碱基对；6）碱基平面与螺旋纵轴接近垂直，糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构：编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列，包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。特点：1）真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp；2）单顺反子（单顺反子：一个基因单独转录，一个基因一条mRNA，翻译成一条多肽链；）3）基因不连续性断裂基因（interrupted gene）、内含子(intron)、外显子(exon)；4）非编码区较多，多于编码序列(9:1) 5）含有大量重复序列1 1、Histon(组蛋白)特点：极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成： 由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制：转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复
分子生物学学习心得 生物学以及分子生物学本身就是一门实验性的学科，如果只有 单纯的理论课上的讲解而没有与之相配套的实验操作，根本无法使我们深刻体会到我们所学的那些如转导转化之类究竟是怎样操纵的。对此给大家收集了有关分子生物学学习心得，应该能给各位带来帮助。 生命科学发展日新月异，特别是微观生物学的发展速度可谓惊人。作为一名本科生，最重要的就是掌握好基础知识，为今后的科研工作或是研发工作打下基础，这样才能跟得上知识和信息发展的脚步。分子生物学作为微观生物学的根基，学好它无疑将为将来的发展打下最坚实的基础。 最近我读了一篇文献，是有关不同类型的弥散性大B细胞淋巴 瘤的基因表达分析的。弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL),最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,是在临床上异构的:40%的患者目前的治疗反应良好,长期生存,而其余屈服于疾病。我们认为这种可变性在自然历史反映 了识别分子在肿瘤异质性。两个不同的分子形式的DLBCL有着不同的gene表达模式，表明了B细胞有不同的分化阶段。一种是表达中心B 细胞的基因表达特征(中心B细胞类似DLBCL)，另一种是表达体外激活诱导外周血B细胞(激活B细胞类似DLBCL)。其中中心B细胞的存活率大于激活B细胞。我们发现肿瘤的分子分类的基础上的基因表达可以识别以前未被发现和临床癌症的重要亚型。构建了一个特异性的DNA微阵列，分析淋巴恶性肿瘤的基因表达，判断基因表达模型和肿瘤表型，最后利用分层系统树图得出结论。
从文献中我了解了DNA微阵列技术，掌握了DNA微阵列技术的 方法，学会了分析分层系统树图，更认识到了弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)研究的重要性。分子生物学是一门前沿的学科，我们只有努 力学习英语，经常阅读中外文献，亲自参与到实验中去，才能了解分子生物学最新的研究成果，掌握分子生物学中的研究分析方法。 通过一个学期的分子生物的学习，第一，我掌握了以中心法则 为核心的最基本的分子生物学知识 了解了基因表达调控的基本原理 锻炼了专业英语阅读和写作能力，也接触了微观生物学前沿， 培养了一定的科研思维能力。学习分子生物学提高了我们的微观生物学素养，为今后的进一步学习打下了坚实基础，同时了解了最新的微观生物学进展，让我们对生物学科研有了一定的感性认识。 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以 初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
分子生物学学习心得 生命科学发展日新月异，特别是微观生物学的发展速度可谓惊人。作为一名本科生，最重要的就是掌握好基础知识，为今后的科研工作或是研发工作打下基础，这样才能跟得上知识和信息发展的脚步。分子生物学作为微观生物学的根基，学好它无疑将为将来的发展打下最坚实的基础。 最近我读了一篇文献，是有关不同类型的弥散性大B细胞淋巴瘤的基因表达分析的。弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL),最常见的非霍奇金淋巴瘤亚型,是在临床上异构的:40% 的患者目前的治疗反应良好,长期生存,而其余屈服于疾病。我们认为这种可变性在自然历史反映了识别分子在肿瘤异质性。两个不同的分子形式的DLBCL有着不同的gene表达模式，表明了B细胞有不同的分化阶段。一种是表达中心B细胞的基因表达特征（中心B细胞类似DLBCL），另一种是表达体外激活诱导外周血B细胞（激活B细胞类似DLBCL）。其中中心B细胞的存活率大于激活B细胞。我们发现肿瘤的分子分类的基础上的基因表达可以识别以前未被发现和临床癌症的重要亚型。构建了一个特异性的DNA微阵列，分析淋巴恶性肿瘤的基因表达，判断基因表达模型和肿瘤表型，最后利用分层系统树图得出结论。 从文献中我了解了DNA微阵列技术，掌握了DNA微阵列技术的方法，学会了分析分层系统树图，更认识到了弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)研究的重要性。分子生物学是一门前沿的学科，我们只有努力学习英语，经常阅读中外文献，亲自参与到实验中去，才能了解分子生物学最新的研究成果，掌握分子生物学中的研究分析方法。
通过一个学期的分子生物的学习，第一，我掌握了以中心法则为核心的最基本的分子生物学知识 了解了基因表达调控的基本原理 锻炼了专业英语阅读和写作能力，也接触了微观生物学前沿，培养了一定的科研思维能力。学习分子生物学提高了我们的微观生物学素养，为今后的进一步学习打下了坚实基础，同时了解了最新的微观生物学进展，让我们对生物学科研有了一定的感性认识。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
第一章、基因的结构与功能实体及基因组 1、基因定义 基因(遗传因子)就是遗传的物质基础,就是DNA(脱氧核糖核酸)分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称,携带有遗传信息的DNA序列,就是具有遗传效应的DNA分子片段,就是控制性状的基本遗传单位,通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息,从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复(DNA repairing)就是细胞对DNA受损伤后的一种反应,这种反应可能使DNA结构恢复原样,重新能执行它原来的功能;但有时并非能完全消除DNA的损伤,只就是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来(如细胞的癌变等),但如果细胞不具备这修复功能,就无法对付经常在发生的DNA 损伤事件,就不能生存。对不同的DNA损伤,细胞可以有不同的修复反应。 3、DNA损伤 DNA损伤就是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。情况分为:substitutation (替换)deletion (删除)insertion (插入)exon skipping (外显子跳跃)。DNA损伤的改变类型:a、点突变:指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition);嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。b、缺失:指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入:指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不就是3的整倍数,则发生读框移动(reading frame shift),使其后所译读的氨基酸序列全部混乱,称为移码突变(frame-shift mutaion)。d、倒位或转位:(transposition) 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。e、双链断裂:对单倍体细胞一个双链断裂就就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组,(Homologus Recombination)就是指发生在姐妹染色单体(sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化,如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等;以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday Juncture Structure) 的形成与拆分分为三个阶段,即前联会体阶段、联会体形成与Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除(geneknockout),就是指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其它顺序相近基因取代,然后从整体观察实验动物,推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外,还包括引入新基因及引入定点突变。既可以就是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因,也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)就是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法,因为在该座位有与导人基因同源的序列,通过单一或双交换,新基因片段可替换有缺陷的基因片段,达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组就是发生在两条DNA链特异位点上的重组,重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点;attachmentsite,att)与位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,因而重组具有特异性与高度保守性。 5、碱基错配对修复
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。