中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞增殖及相关因素的作用
更新日期： 06-02 作者：薛景凤，宋成军，李健，陈志宏
【关键词】 天年饮；,,衰老；,,睾丸；,,增殖细胞核抗原；,,端粒酶
摘要：目的研究中药天年饮对衰老大鼠睾丸生精细胞增殖及相关因素的影响。方法40只 SD大鼠随机分为4组，正常组、衰老模型组、天年饮用药组及阴性对照组，每组均为10只。D-半乳糖连续腹腔注射制作亚急性衰老的大鼠模型。采用ELISA方法检测各组大鼠血清睾酮含量、SP免疫组化法检测睾丸生精细胞 PCNA、端粒酶的表达情况。结果衰老大鼠血清睾酮含量、睾丸PCNA阳性细胞率及生精细胞端粒酶的表达明显低于正常大鼠（P＜0.05，P＜0.01）。天年饮可明显提高衰老大鼠血清睾酮含量（用药组与模型组比较 P＜0.05）、提高睾丸 PCNA阳性细胞率（用药组与模型组比较 P＜0.01）及提高衰老大鼠端粒酶的表达。结论天年饮可明显改善衰老大鼠的生精功能，具有一定延缓衰老的作用。
关键词：天年饮； 衰老； 睾丸； 增殖细胞核抗原； 端粒酶
Effects of Traditional Chinese Medicine Tiannianyin on PCNA Expression and Related Factors of Spermatogenic Cells in Testis of Aging Rats
Abstract:ObjectiveTo observe the effects of traditional Chinese medicine Tiannianyin on PCNA expression and related factors of spermatogenic cells in testis of aging rats.Methods40 SD rats were applied in this study and divided into 4 groups at random: normal group, aging model group, Tiannianyin group, negative control group, and each group had 10 rats. The subacute aging model rats were made by injecting Dgal into abdominal cavity continuousl. ELISA was used to detect the testosterone content in serum, SP immunohistochemistry to observe the PCNA and telomerase expression of spermatogenic cells in testis.ResultsThe testosterone content in serum, the PCNA positive cell rate and the telomerase expression of aging rats were obviously lower than normal rat (P＜0.05, P＜0.01). Tiannianyin could increase the testosterone content in serum (P<0.05), the PCNA positive cell rate (P＜0.01) and the telomerase expression obviously. Conclusion:Traditional Chinese medicine Tiannianyin can improve the spermatogenic functions of aging rats obviously, and has fairly antiaging effects.
Key words:Tiannianyin; Aging; Testis; PCNA; Telomerase
中药延缓衰老作用的研究已逐渐深入，在细胞传代、寿命实验、免疫内分泌代谢等领域进行了多方面的研究，揭示了不少药物的抗衰老机理，但各自研究的方面不同。传统医学认为精气虚弱是导致机体衰老的主要原因，所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成，具有补肝肾、益
精血、延年益寿之功效。本研究采用D半乳糖致亚急性衰老的大鼠模型，观察天年饮对睾丸生精细胞增殖及相关因素的影响，探讨天年饮延缓衰老的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物的选择及分组实验选用4 月龄雄性 SD 大鼠40 只(由河北医科大学实验动物学部提供),体重180～250 g。将40 只大鼠随机分为4组：正常组、衰老模型组、天年饮用药组和阴性对照组, 每组均为10 只。其中模型组、用药组、阴性对照组均采用D-半乳糖连续腹腔注射(200 mg/kg，1次/d, 共40 d) 制作亚急性衰老的大鼠模型。模型组大鼠于造模成功后不再作任何处理；用药组大鼠于造模成功后每天用天年饮灌胃，共30 d；阴性对照组大鼠在造模成功后每天灌胃同等剂量的生理盐水，时间同用药组大鼠。
1.2 药品及试剂天年饮由何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓6味中药组成, 经熬制后每毫升含生药1.5 g按8.1 g/kg灌胃。D半乳糖，北京化学试剂公司生产（批号：020402）。检测血清睾酮含量的 ELISA试剂盒、PCNA免疫组化试剂盒、端粒酶免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
1.3 指标的检测
1.3.1 血清睾酮含量的检测大鼠经内眦取血, 离心取上清，采用ELISA方法检测大鼠血清睾酮含量。
1.3.2 睾丸生精细胞 PCNA表达的观察及定量数据处理2.5%戊巴比妥腹腔注射（0.3 ml/100g）麻醉大鼠， 4%多聚甲醛灌注固定，取双侧睾丸入4%多聚甲醛后固定。将固定好的组织块经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。Leica石蜡切片机连续切片，片厚5 μm，每隔20张取蜡带贴于涂有 APES的载玻片上。SP免疫组化染色（一抗为鼠抗 PCNA 1∶100）显示生精细胞 PCNA的表达，DAB显色，苏木精复染。阴性对照用 PBS代替一抗。以细胞内出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反应。 在显微镜(10×40倍)下进行细胞计数，每张切片上随机选取10个视野，每个视野计数总细胞数和阳性细胞数， 计算出阳性细胞的百分比。每组计数3 只动物的睾丸， 每个标本计数3 张切片。
1.3.3 睾丸生精细胞端粒酶表达的观察SP免疫组化染色（一抗为兔抗端粒酶1∶100）显示生精细胞内端粒酶的表达，DAB显色，苏木精复染。阴性对照用 PBS代替一抗。以细胞内出现棕黄色粗颗粒或细腻颗粒弥漫分布为阳性反应。
1.4 统计学处理 计数资料采用 t检验进行统计分析。
2 结果
2.1 血清睾酮含量 结果见表1。由表1中可见，与正常大鼠相比，衰老大鼠血清睾酮含量明显降低( P＜0.01),天年饮可明显抑制衰老大鼠血清睾酮含量的下降, 用药组与模型组比较差异显著( P＜0.01)。
表1
各组大鼠血清睾酮含量和 PCNA阳性细胞率(略)
与正常组比较，*P＜0.05，#P＜0.01，与模型组比较，**P＜0.05，##P＜0.01
2.2 生精细胞PCNA的表达情况 各组切片均可见 PCNA染色，免疫阳性产物位于细胞核，通常呈棕黄色颗粒状，小部分呈弥散状。免疫阳性细胞主要是精原细胞，另外还有少量初级精母细胞、支持细胞和肌样细胞核着色。各实验组 PCNA阳性细胞率见表1。由表1中可见，与正常大鼠相比，衰老大鼠睾丸 PCNA表达水平下降，PCNA阳性细胞率模型组与正常组比较差异显著(P＜0. 01)；用天年饮灌胃后，睾丸 PCNA阳性生精细胞明显增多，PCNA阳性细胞率与模型组、对照组比较均有显著差异(P＜0. 01)。见图1~3。
图1 正常大鼠睾丸PCNA的表达(×200)（略）
图2 衰老大鼠睾丸PCNA的表达(×200)（略）
2.3 生精细胞端粒酶的表达情况各组大鼠睾丸端粒酶免疫阳性细胞多为精子细胞，免疫阳性产物呈弥散状，主要位于细胞核，为强阳性表达，另外精子细胞的胞浆也可见端粒酶免疫阳性产物，但反应比较弱、量比较少。正常组大鼠睾丸端粒酶染色（见图4）可见生精小管近管腔侧有许多密集的精子细胞核着色；模型组大鼠（见图5）着色的精子细胞数明显少于正常组大鼠；天年饮用药组大鼠（见图6）阳性精子细胞数明显增多。
3 讨论
近年来已有大量文献报道性腺功能衰退与机体衰老密切相关［1，2］。随着年龄增长，睾丸的结构和功能会出现一个由盛到衰的演变过程，出现精子生成能力减弱、血游离睾酮含量下降等变化。早在1889年法国医学家 Brown Sequard 就认为睾丸提取液有“延缓衰老”的奇效，并且目前性激素替代疗法仍是治疗许多老年病的主要方法，有研究发现补充睾酮可改善心肌缺血、抑制动脉粥样硬化［3，4］。《素问?金匮真言论》有记载：“夫精者，身之本也”，并认为“天癸竭，精少，肾藏衰，形体皆极”是衰老的主要原因, 所以历代医家多用补肾为主的方药来延年益寿。天年饮由刘河间《宣明论方》何首乌丸加味而成。何首乌丸本由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年。于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化淤以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。现代研究也表明，何首乌、淫羊藿、丹参、肉苁蓉等具有改善脂肪代谢、改善心脑血管功能、抗氧化等多方面的作用。PCNA是存在于细胞核内的1个36 KD的酸性蛋白质，在调节细胞周期中有重要作用，另外 PCNA还作为 DNA聚合酶的一个辅助因子帮助其定位，参与 DNA的合成、修复，并且促进 DNA的复制
［5］。细胞中的 DNA复制大多提示细胞增殖，因此，PCNA阳性细胞的多少可以反应细胞的增殖状态，并且可作为生精过程中判断增殖的一个指标［6］。我们研究发现，模型大鼠睾丸生精细胞 PCNA阳性率明显下降，经天年饮灌胃后 PCNA表达水平显著提高，说明天年饮可提高衰老大鼠睾丸生精细胞的增殖能力。
图3 用药大鼠睾丸PCNA的表达(×200) （略）
图4 正常大鼠睾丸 端粒酶的表达(×200)（略）
图5 衰老大鼠睾丸端粒酶的表达(×200) （略）
图6 用药大鼠睾丸端粒酶的表达(×200)（略）
端粒的长短和稳定性决定了细胞寿命，并与衰老和癌变密切相关。端粒序列长度在细胞生长的过程中不断减少，当缩短到一定程度，细胞基因组的稳定性就会遭到破坏，细胞停止分裂并退出细胞周期，开始出现衰老。端粒酶是重要的延长端粒的因素，端粒酶活性与细胞的增殖与凋亡存在着密切关系。Ichiyoshi等［7］在研究时发现，细胞端粒严重缩短和端粒酶功能不足可以使细胞凋亡增加，并且他们认为端粒的缩短和端粒酶活性的下调是细胞凋亡的触发器；Zhang等［8］研究认为，端粒酶活性的提高可以使细胞增殖增加，反之可以使凋亡增多。睾丸组织细胞成分比较复杂，在正常睾丸组织中部分生精细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）即可以表达端粒酶活性［9］，并且各级生精细胞中端粒的长度是不同的，从精原细胞到精母细胞再到精子细胞，端粒是逐渐延长的。Kang等［10］的研究发现，24月龄大鼠与6月龄大鼠相比，血清睾酮含量和睾丸组织端粒酶活明显下降。本次研究发现，衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶的表达下降，天年饮可明显提高衰老大鼠睾丸端粒酶的表达。本研究表明，天年饮可以明显提高模型大鼠血清睾酮含量，明显提高衰老大鼠睾丸生精细胞的增殖能力、明显改善衰老大鼠睾丸生精细胞端粒酶的表达情况。说明天年饮可以通过提高血清睾酮含量、提高端粒酶的活性、提高生精细胞的增殖能力等来改善衰老大鼠的生精功能，起到延缓衰老的作用。
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