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骨髓间充质干细胞移植治疗冠心病的研究进展
关海旺△（综述），周建庆※（审校）
（宁波大学医学院附属李惠利医院心血管内科，浙江宁波315041）
中图分类号：R541．5文献标识码：A文章编号：1006-2084（2012）02-0168-04
摘要：目前在全世界范围内，冠心病已成为第一位的死亡原因。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有自我复制能力，可以向多种细胞分化，已有大量实验研究了它的分离、培养和体外诱导为心肌样细胞的生物学特性。近年来，BMSCs移植治疗冠心病的动物实验和临床研究均显示出较好的效果。BMSCs移植正成为治疗缺血性心脏病的一种崭新技术，具有广阔的发展前景。
关键词：骨髓间充质干细胞；冠状动脉粥样硬化性心脏病；移植
Research Progress on Treatment of Coronary Heart Disease by Bone Mesenchymal Stem Cells Trans-plantation GUAN Hai-wang，ZHOU Jian-qing．（Department of Cardiology，Ningbo University Affiliated Lihuili Hospital，Ningbo315041，China）
Abstract：Currently，coronary heart disease has become the first cause of death worldwide．Bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）with self-replication capability can differentiate into multiple cells．A large number of experimental studies of its biological characterizations involving isolation，culture and inducing to dif-ferentiate into cardiomyocyte-like cells in vitro have been done．In recent years，BMSCs transplantation for the treatment of coronary heart disease in animal experiments and clinical studies has illustrated good effectiveness．BMSCs transplantation is becoming a new technology for the treatment of ischemic heart disease，where broad development prospects is expected．
Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells；Coronary atherosclerotic heart disease；Transplantation
冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）正日益成为严重危害人类健康的疾病。目前的治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗和手术。尽管介入治疗和冠状动脉旁路移植术的开展使冠心病患者的生存率有了较大提高，但是其远期预后并不十分理想。它们主要是通过血运重建，改善心肌缺氧来治
疗冠心病。但是即使这样，仍有部分患者不能得到
完全的血运重建，
甚至根本不能应用上述治疗方法。干细胞移植治疗冠心病是一个新兴的治疗思路，虽
然目前还处于基础和临床研究阶段，
但为冠心病患者带来了新的希望。现就国内外骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs ）移植治疗冠心病的有关进展进行综述。1干细胞的研究背景
以往的观念认为心肌细胞属于不能进行再生的高分化永久性细胞。近来有学者发现，心肌梗死区
域可有少量心肌细胞发生再生和增殖［1］
，经过进一步研究，人们认识到成熟的心肌在特定情况下可以进行自我更新。但是，这种心肌细胞的分化是很微弱的。目前认为，心肌组织本身的再生能力非常有限。因此，冠心病尤其是心肌梗死发生后，大面积心
肌损伤可导致永久性心功能损害。自从Orlic 等［2］
于2001年首次提出干细胞移植能使心肌梗死中受损的心肌得到修复以来，干细胞移植就为冠心病的
治疗开辟了新的途径。随后，
Strauer 等［3］第一次进行了人体自体骨髓单个核细胞移植治疗心肌梗死的尝试。
2干细胞及MSCs
干细胞是一类具有自我复制功能和多向分化潜
能的早期未分化细胞，
在特定条件下可向多种细胞系分化。一般情况下，干细胞依据来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。MSCs 属于成体干细胞中的
非造血干细胞，
来源于胚胎时期的中胚层，主要存在于全身疏松结缔组织和器官间质中。MSCs 易于在体外扩增，并且具有多种分化能力，它最初是由Friednstein 和Petrakova 在骨髓中发现的［4］。3MSCs 的特性
3．1MSCs 的生物学特性BMSCs 主要存在于骨髓中，形态学上通常表现为细胞体积较大，呈长梭形或纺锤形，与成纤维细胞相似，可聚集成集落，没有特异性的形态。在体外诱导的情况下，可以向成骨细
胞、脂肪细胞、肌细胞、神经细胞等方向分化［5］
。一般情况下，细胞表面并无通用性的标志物。有学者
研究发现，
细胞基本上不表达造血干细胞特异性的表面抗原CD 34［6］
。目前研究认为，
CD 105、CD 73、CD 44和CD 90等可以作为其相对特异的表面标志物［7］
。3．2MSCs 的分离和培养BMSCs 的分离主要有全骨髓培养法、密度梯度离心法和流式细胞仪分离法等。目前国内大多采用密度梯度离心法分离后进行贴壁筛选培养。
3．3MSCs 的体外诱导分化BMSCs 在特定的条件下具有向中胚层组织细胞分化的潜能。研究表明，常
用的诱导剂5-氮胞苷（5-aza ）可以在体外诱导BMSCs 向心肌样细胞分化。Xu 等［8］
文献报道BMSCs 经5-aza 作用1周后出现肌管样的结构，14d 后开始自
主收缩，
约21d 后出现同步收缩，同时可以检测到特异性心房利钠肽和脑利钠肽的表达，并且在电镜下发现了肌小节等心肌样超微结构。也有学者通过电
生理研究发现，
该类细胞可产生心室肌样动作电位。5-aza 有一定细胞毒性，可导致部分细胞发生凋亡。在诱导时加用碱性成纤维细胞生长因子可以减少诱
导后的凋亡。目前有关5-aza 的诱导机制仍在进一步探讨当中。
Labovsky 等［9］将大鼠的BMSCs 经乳鼠心肌细胞提取液处理后培养，模拟心肌样微环境。结果发现，处理后的细胞能更显著持久表达心肌特异性蛋白α-辅肌动蛋白/间隙连接蛋白43和转录因子Gata4，此外，还可以表达成熟心肌细胞的肌浆网钙泵2、肌钙蛋白I 、β肌球蛋白重链、结蛋白、肌球蛋白轻链2A 和肌球蛋白轻链2V ，并且发现心肌特异性基因肾上腺素能受体β1、肌球蛋白轻链2A 和肌钙蛋白T 的表
达与经5-aza 处理后表达相似，从而证实乳鼠心肌提
取液可以促使BMSCs 向心肌样细胞分化。有关其发
生机制，
Chang 等［10］认为可能是心肌细胞分泌的某些因子（如转化生长因子β、骨形态发生蛋白2等）诱导BMSCs 分化为心肌样细胞所致。4MSCs 移植治疗冠心病的动物实验
Tomita 等［11］将分离得到的大鼠BMSCs 培养到
第3天时，
经5-aza 处理24h 后继续培养到第7天，移植到冷冻损伤造成的大鼠心肌梗死区的瘢痕组织
中，5周后观察到梗死区移植的细胞分化出肌管样结构，并且表达肌球蛋白重链和肌钙蛋白，心脏左心室收缩压明显高于对照组，证明心功能得到改善。Orlic 等［2］也发现将大鼠的BMSCs 注射入心肌梗死区后，细胞形成的肌肉组织，可以覆盖部分梗死区，并可分化为心肌样细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等，心
脏收缩功能得到改善。Rota 等［12-13］
研究发现，将BMSCs 移植到发生梗死的大鼠心脏，移植的干细胞和心肌细胞间可形成间隙连接蛋白43和N 钙黏蛋
白，
并通过它们融合成连接复合体而增殖和生长，且可以转化为心肌样细胞和新生血管。
Zhu 等［14］结扎兔的左前降支冠状动脉制作成心肌梗死模型，心肌梗死24h 后，治疗组经梗死区冠状动脉注射BMSCs ，对照组注射不含任何细胞的培养基。4周后发现，与对照组和移植前相比，治疗组左心室射血分数明显升高，左心室舒张末期内径显著降低，新生血管数量明显增加，从而证实干细胞移植可以减少心室重构，增强心功能。也有学者结扎大
鼠冠状动脉造成心肌梗死模型，将从异体大鼠分离培养得到的BMSCs在梗死后1 3h移植到心肌组织中，10周后发现细胞存活，并且胞质中心肌特异性蛋白表达阳性，梗死区毛细血管数量增加，梗死面积缩小，同时左心室收缩压明显升高，舒张末压降低。
近来有研究者将犬BMSCs用4，6-二脒基-2-苯吲哚染色标记后，经冠状动脉输注到心肌梗死区，6周后梗死区内可发现4，6-二脒基-2-苯吲哚标记阳性的细胞，其α肌动蛋白表达阳性，并与周围的细胞形成缝隙连接，可检测到间隙连接蛋白43。同时观察到梗死区毛细血管密度增加，有新血管生成。与注射无血清培养基的对照组相比，发现左心室射血分数显著提高，心功能得到改善［15］。
Barallobre-Barreiro［16］和Martínez de llárduya等［17］利用猪心肌梗死的模型，经冠状动脉、胸腔和心肌途径注射移植异体BMSCs，结果发现治疗组心肌细胞增强因子2c、转录因子Nkx2．5、Gata4和肌浆网钙泵2表达明显增加，但同时也观察到Ⅰ型胶原α
1
链表达增加，提示移植治疗后可能存在增加心肌纤维化的风险。
5MSCs移植治疗冠心病的临床应用
干细胞的移植途径主要有经心肌移植、经冠状动脉移植和经静脉系统移植。其中经心肌移植需要在心脏手术直视下局部注射，可以准确选择注射部位，针对性强，但是技术难度较大，费用昂贵；经冠状动脉移植可以在介入指导下进行，操作较方便，移植的干细胞可以分布在心肌各层，优于心肌内直接注射，是目前临床试验常用的方法；经静脉系统移植，需要动员经静脉注射的干细胞归巢于心肌靶部位，不易获得大量的干细胞。
Strauer等［3，18］将自体获得的骨髓干细胞，在心肌梗死14h后，经冠状动脉移植到患者心肌中。10周后超声心动图发现，左心室射血分数较术前提高20%，左心室舒张末期内径下降30%。并且梗死面积从24．6%减少至15．7%。这是世界上首例骨髓干细胞移植治疗冠心病的手术，取得了较好的效果。
Buziashvili等［19］对10例心肌梗死患者在发生心肌梗死5 7d后进行冠状动脉途径移植BMSCs。1个月后观察到左心室射血分数从42．9%上升到51．4%，移植区心肌灌注明显增加，梗死面积减小。Chen等［20］对接受经皮冠状动脉介入治疗的心肌梗死患者在术后分成两组：一组进行自体BMSCs移植治疗；另一组进行常规治疗，实施随机对照研究。3个月后发现，移植组患者左心室射血分数明显高于常规治疗组（对照组），左心室收缩末容积和舒张末容积明显降低。6个月后移植组的心室收缩速率快于常规治疗组，心功能显著改善。6问题与展望
虽然应用干细胞移植治疗冠心病是一种完全不同于以往三大治疗方法的全新疗法［21-22］，且已获得令人鼓舞的成就，但是目前的临床应用只是一个初步的探索和尝试，尚没有大样本、随机的临床试验，其中存在的诸多问题亟待解决。例如，何时进行移植才可以使患者获益最大？哪种移植途径是最优方式？如前所述，干细胞移植也存在潜在的风险，Vulliet等［23］报道经冠状动脉内移植MSCs会引起冠状动脉微梗死，也有学者发现MSCs在体外长期培养可自发形成肿瘤样细胞。MSCs和其他干细胞相比，具有取材方便、不涉及伦理道德问题等优势，而且还可以从患者自身获得干细胞，自体移植较少发生免疫排斥反应。目前的动物实验和临床研究都表明，MSCs移植治疗冠心病是有效的，尽管存在诸多问题，但其作为一种治疗冠心病的全新方式仍有很大的发展空间。
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收稿日期：2011-09-07修回日期：2011-10-29编辑：伊姗
Toll样受体4与移植器官缺血/再灌注损伤
张松林（综述），胡旭※（审校）
（三峡大学心血管病研究所，宜昌市中心人民医院心胸外科，湖北宜昌443003）
中图分类号：R392．4文献标识码：A文章编号：1006-2084（2012）02-0171-03
摘要：Toll样受体4（TLR4）是抵御病原体入侵和有害刺激的重要天然免疫受体之一。TLR4除了参与病原微生物触发的炎性反应外，还能识别缺血/再灌注损伤后释放的内源性配体，如热休克蛋白、高迁移率族蛋白B1等，经TLR4/髓样分化因子88等信号途径诱导多种炎性细胞因子的产生，参与移植器官缺血/再灌注损伤的炎性反应。实验表明，负性调节TLR4信号对移植器官缺血/再灌注损伤具有明显的保护作用。因此，针对TLR4信号的调节在移植器官保护方面具有一定的临床应用前景。
关键词：Toll样受体4；缺血/再灌注损伤；器官移植
Toll-like Receptor4and Ischemia/Reperfusion Injury in Organ Transplantation ZHANG Song-lin，HU Xu．（Department of Cardiothoracic Surgery，Institute of Cardiovascular Disease，Three Gorges University，Yichang Central People Hospital，Yichang443003，China）
Abstract：Toll-like receptor4（TLR4）is one of the most important receptors of innate immunity which is responsible for the initial response of the organism to pathogens and harmful stimulus．TLR4participates in inflammatory response triggered by infectious stimuli，and recognizes endogenic ligands（heat shock protein，high mobility group protein B1，etc．）released from impaired cells via ischemia/reperfusion injury，which in-duces proinflammatory cytokines by TLR4/MyD88signal pathway．And negtive regulation of TLR4signaling inhibits transplant-induced ischemia/reperfusion injury in various animal experiment．So，it is promising to protect transplanted organ against ischemia/reperfusion injury via regulation of TLR4signaling in clinical practice．
Key words：Toll-like receptor4；Ischemia/reperfusion injury；Organ transplantation
移植器官缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，
I/R）损伤机制极其复杂，其中过度的炎症免疫反应
导致术后早期移植物功能不全，促进远期移植物血
管病的形成已经成为共识［1］。然而，单纯的抗炎治
疗在临床实践中并未达到预想的效果，这可能与长
期以来人们对炎症机制缺乏清晰的认识有关。Toll
样受体（Toll-like receptors，TLRs）的发现促进了人们
对炎症机制的理解。TLR4是TLRs家族中的亚型之
一，TLR4除了参与病原微生物触发的炎性反应外，
还能识别I/R损伤后释放的内源性配体，诱导多种炎性细胞因子的产生，参与移植器官I/R损伤的炎性反应［2］。现就TLR4及其在移植器官I/R损伤中的作用进行综述。
1TLR4的结构、分布与配体
TLR4是人类发现的第1个TLRs相关蛋白，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、穿膜区及胞内区3部分组成。TLR4主要分布于树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞等抗
原递呈细胞［3］。
TLRs是模式识别受体，能识别不同微生物的病原体相关分子模式，如脂多糖、磷壁酸、肽聚糖、甘露糖和葡聚糖等［3］。TLR4主要识别脂多糖以及一些具有保守类脂A结构的衍生物，还可识别活结核杆菌的某些成分。此外，TLRs还能识别I/R损伤等非病原微生物性炎症中的内源性配体，即损伤相关的分子模式。自Ohashi等［4］报道了第1个内源性TLR4配体热休克蛋白（heat shock protein，HSP）60以来，目前已鉴定的TLR4内源性配体还包括HSP70、
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
?２２８?生国篮旦匡煎！Ｑ塑生！！旦笠！鲞筮丝塑￡！ｉ塑旦墼丛鲤：堕！！！Ｑ嫂：Ｙ丛：堡：些！：１２ 病情持久不愈，气血郁滞，经脉失畅，化湿生痰，痰血瘀结而致。根据其病机，选用小金丸治疗，取得较好疗效，值得推广。５治疗乳腺囊性增生病悼３ 将５００例乳腺囊性增生病患者随机分为治疗组和对照组各２５０例，对照组单用三苯氧胺治疗，治疗组在对照组相同治疗的基础上加用小金丸治疗。结果：治疗组总有效率为９２．０％，对照组总有效率为６７．６％，两组有非常显著性差异（Ｐ＜０．０１）。乳腺囊性增生病系内分泌障碍性增生病，一是体内女性激素代谢障碍，尤其是雌孕激素比例失调，使乳腺实质增生过度和复旧不全；二是部分乳腺实质成分中女性激素受体的质和量的异常，使乳房各部分增生程度参差不齐。三苯氧胺与此激素竞争受体，阻断过高的雌激素作用于乳腺组织，但部分患者临床效果甚微，或服药期间疗效较好，停药后复发。小金丸的药理实验证实对乳腺泡和导管增生有明显抑制作用，同时能抑制纤维母细胞摄取１４．甘氨酸减少胶原纤维合成，又能促进细胞吞噬胶原纤维及其断片，增强细胞溶酶体释放组织蛋白水解胶原纤维，从而消降纤维细胞的增生、粘连，疗效肯定，不良反应小，但疗程较长。中医学认为乳腺增生病主要是气机郁滞，痰瘀互结，冲任失调所致，治当理气化瘀散结，活血祛瘀为原则。小金丸方中麝香走窜通络，散结开壅，枫香脂调气血，土鳖消肿定痛，地龙通络，制草乌祛风湿，温经散寒，当归活血，香墨消肿化瘀，五灵脂、乳香、没药活血化瘀、消肿定痛。诸药合用有温通、活血、消壅、散结之效。可使气旺络通，痰散结消。配合三苯氧胺治疗乳腺增生病，标本兼治，故能取得较好疗效。 ６治疗慢性盆腔炎包块怕１ 将６０例患者（疾湿疥阻兼脾肾两虚型）分为２组各３０例，治疗组口服小金丸和血宝胶囊配合宫颈湿敷血竭粉治疗。对照组用西医抗炎治疗。治疗前后Ｂ超测量盆腔包块的大小、检测雌激素水平、观察临床症状消失的情况。结果：总有效率治疗组８６．６７％，对照组为６３．３３％，２组比较，差异有显著性意义（Ｐ＜０．０５）；随访半年复发率，治疗组为２３．０８％，对照组为６３．１５％，２组比较，差异有非常显著性意义（Ｐ＜０．０１）；雌激素水平治疗前后比较及治疗后组问比较，差异均无显著性意义（Ｐ＞０．０５）。慢性盆腔炎包快属中医学瘢瘕范畴，多起于经行产后，胞脉胞络空虚，血室正开，痰湿之邪乘虚而入，蕴结胞宫；失治误治，余邪未净，迁延１３久，病及血分，致瘀积胞中，积聚成瘾。小金丸功能散结消肿，化瘀止痛，原用于痰气凝滞所致的瘰疬、瘿瘤、乳岩、乳癖，用于此药治疗盆腔炎包块属异病同治，有异曲同工之妙。现代药理研究表明小金丸具有抗炎、消肿、抗肿瘤和镇痛作用。血宝胶囊具有益肾健脾、补阴培阳之效。血宝既可助小金丸化痰散结、活血消ｊ｝毂之力，又可防止小金丸攻邪太过损伤正气。廊竭粉是伤科活血疗伤之圣药，取其破散瘾积宿血之功。内服外用双管齐下，共奏化痰散结、化瘀消瘕之功，使邪去而不伤正。本研究表明，用中成药扶正消瘾法治疗慢性盆腔炎包块具有无创性、服用简便、疗效好，复发率低的优点。 ７治疗结节性筋膜炎ｏ¨ ５例结节性筋膜炎患者，内服小金丸０．６ｇ，２次／ｄ。局部服用黄金膏（金黄散＋凡士林）＋四虎散（由生草乌、生半夏、生南星、狼毒组成）外敷，方法：根据肿块大小，先用金黄膏涂布于纱布上，再掺加四虎散，外面用单层纱布包裹，最后在药物表面撒少量蒸馏水，敷贴患处，每２ｄ换１次。结果５例均治愈。最短治愈时间２６ｄ，最长治愈时间３５ｄ，平均治愈时间３０．８ｄ。结节性筋膜炎又称为假肉瘤性筋膜炎，是一种发生于浅筋膜的良性增生性病变。小金丸具有消痰化坚、活血止痛、消结散毒的作用；金黄散清热、解毒、消肿、定痛；四虎散化痰散结止痛。内外治结合，共奏解毒化肿、化痰散结、活血止痛之效，故用于治疗本病能取得较满意的疗效。 参考文献 ［１］秦树光，等．小金丸联合甲状腺素片治疗甲状腺肿的ｌ｜缶床分析．现代中西医结合杂志，２００５，１４（８）：１０１８． ［２］屈江宁．小金丸治疗良性前列腺增生８０例．世界中医药，２００８，３（５）：２７７． ［３］马宝华，等．小金丸治疗带状疱疹后遗神经痛４４例．中国中医急诊，２００３，１２（５）：４７３． ［４］余勇．小金丸治疗聚合性痤疮２４例．医药导报，２０００，１９（３）：２６３． ［５］杨玉国，等．小金丸与三苯氧胺合用治疗乳腺囊性增生病２５０例分析．实用中医药杂志，２００５，２１（５）：２６１． ［６］邱明英，等．小金丸为主治疗慢性盆腔炎包块的临床研究．新中医，２００８，４０（４）：５５ ［７］吴亚旭．中药治疗结节性筋膜炎５例．江苏中医药，２００５，２６（１１）：２７． 间充质干细胞研究进展及其临床应用前景李玲玲李晶 【关键词】骨髓间充质干细胞；多向分化；组织工程 间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）通常是指从骨髓或其他组织中分离到的在体外具有多向分化潜能的一类细胞。自Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ等首次报道骨髓中有少量细胞在培养过程中能贴壁分化形成类似骨、软骨的集落后，人们对这些细胞产生了浓厚兴趣。随后从鼠、兔、犬、人等多种动物的骨髓中均分离到了这种贴壁细胞。它们具有多向分化潜能， 作者单位：１３００２１吉林省前卫医院（李玲玲）；吉林省人民医院中西医结合科（李晶）在体外不同诱导条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及神经细胞…。 与软骨细胞、骨髓基质细胞、胚胎干细胞等相比，ＭＳＣｓ具有强大的增殖力、较强的多向分化潜能，而且具有取材方便、便于自体移植、便于外源基因转染及表达调控等诸多优点。最近。还发现ＭＳＣｓ具有免疫调节功能嵋ｏ。因此，ＭＳＣｓ是组织工程的一种新的理想种子细胞。目前，已知ＭＳＣｓ是源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中¨１。本文就ＭＳＣｓ 万方数据
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ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
造血干细胞移植的护理常规 1、移植前的护理 1.1、供者准备选用HLA相合的同细胞作为最适合供者，移植前两周对供者进行循环采血。 1.2、无菌层流室的准备：室内一切物品需经清洁、消毒、灭菌处理，室内不同空间采样，行空气细菌检测合格后病人方可进入。 1.3、病人准备： 1.3.1、心理护理：对病人及家属详细讲解骨髓移植的方法，过程和相关知识，使其有充分的思想准备和经济准备，鼓励病人建立战胜疾病的信心。 1.3.2、进行全面的身体检查。 1.3.3、无菌护理：进行口、眼、耳、肠道的无菌准备，行药浴，更换无菌衣裤后进入无菌室。 1.3.4移植前一天行中心静脉插管。 1.3.5预处理：是指全身射线照射和使用免疫抑制剂。其目的是杀灭受者的免疫活性细胞，使之失去排斥外来细胞的能力，从而允许供者的骨髓植入而使造血功能重建，同时还可消灭体内的异常细胞起到一定的治疗作用。执行预处理方案时需密切观察病情变化，鼓励病人多饮水，每天入水量4000ml以上，防止尿酸性肾病的发生。 2、术中护理 2.1、正确采集骨髓或外周造血干细胞，并保证足够的细胞数。 2.2、骨髓液回输：在无菌层流室6小时输完，每袋骨髓液至最后5ml时应留在袋中弃去，以防脂肪颗粒进入血液循环引起肺栓塞，外周血干细胞不需要过滤。 2.3、病情观察：监测生命体征的变化，并注意观察病人有无胸闷，气促等情况，配合医生做好相应处理。 3、移植后护理 3.1、心理护理：护士应多与病人交谈，调节病人情绪，传递家属信息，以解除病人的恐惧心理和孤独感，充分调节病人的积极性。 3.2、并发症护理： 3.2.1、感染；是最常见的并发症，对骨髓移植病人必须实行全环境保护：a严格执行无菌环境的清洁及消毒隔离制度b严格落实病人的各项无菌护理c 加强扩胸运动，防止肺部感染ｄ严密观察生命体征及病情变化。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 间充质干细胞临床研究进展 间充质干细胞临床研究进展自 1867 年德国病理学家Cohnheim 在研究伤口愈合过程时，首次提出成纤维细胞可能来源于骨髓，即骨髓可能含有非造血干细胞的观点。 1869年，Goujon 发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了骨髓具有成骨能力。 但直到 1976 年，Friedenstein 和 Petrakova 首先报道，通过帖壁培养的方法分离得到间充质干细胞（MSCs）。 1987 年，Friedenstein 等将骨髓放置在塑料培养皿中培养，发现骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，由于能分化为多种中胚层来源的间充质细胞，因此被称之为间充质干细胞。 1991 年 Caplan 把骨髓中具有黏附于塑料培养皿表面、在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞。 1999 年，Pittenger 等在《Science》（科学）杂志上发表文章，对从骨髓标本中分离得到 MSC，应用流式细胞分析术分析 MSC，结果表明分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化条件诱导下，可以形成成骨细胞、成软骨细胞或脂肪细胞，而且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。 一系列的研究已经证明 MSC 可以分化为神经、心脏、肝脏、 1 / 4
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3～6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml
造血干细胞移植患者的饮食护理 发表时间：2016-01-27T15:02:30.397Z 来源：《解放军预防医学杂志》2015年第7期供稿作者：张小花[导读] 徐州医学院附属淮安医院有效的饮食护理干预可有效预防患者营养不良，使移植顺利完成，提高疗效改善生存质量。 徐州医学院附属淮安医院江苏淮安 223002 【摘要】目的探讨饮食护理对造血干细胞移植病人营养状况的影响。方法将2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人31例随机分为观察组16例和对照组15例。观察组在常规护理干预下进行饮食护理干预，对照组进行常规护理干预，观察两组患者造血功能恢复时间、体重增加情况，以评价患者的营养状况。结果有效的饮食护理干预，可以提高造血干细胞移植患者的营养状况，减少患者的住院天数，使患者造血功能尽快恢复，减轻患者的经济负担。结论有效的饮食护理干预可有效预防患者营养不良，使移植顺利完成，提高疗效改善生存质量。 【关键词】造血干细胞移植; 饮食护理 中图分类号 R473.5 文献标识码 B 目前随着社会的发展血液系统肿瘤发生率逐年增加，随着人们意识水平、经济水平及医学水平的提高，造血干细胞移植在我国广泛开展，造血干细胞移植患者越来越多，造血干细胞移植患者的营养状况对患者的造血重建，免疫功能恢复及移植后生存质量有重要意义。多数造血干细胞移植患者及家属只注重临床药物治疗而轻视饮食护理。据有关报道[1]患者在良好的饮食方式和营养状况下，较能承受肿瘤及其治疗对身体所产生的种种压力，同时接受化疗效果也会更好，相对来说移植成功率会提高，移植效果就会更好，因此做好造血干细胞移植患者的饮食护理，对移植的成功及移植后患者控制体重，术后恢复造血功能至关重要。我科对2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人进行饮食护理干预，并通过移植后患者体重及术后恢复造血功能期间血红蛋白计数评价其营养状况，现报道如下1资料与方法 1.1一般资料。2009年1月-2012年1月造血干细胞移植病人31例，年龄6-59岁，其中自体造血干细胞移植5例，异基因造血干细胞移植26例，随机分给观察组16例和对照组15例。 1.2方法。观察组每天与患者主动沟通了解患者饮食习惯，食欲情况，医嘱饮食要求，对患者整体评价后制定饮食计划，与家属沟通食物品种，烹饪方法。对照组实施常规护理干预及健康宣教，观察两组患者体重及术后恢复造血功能期间血红蛋白计数评价其营养状况。2结果 对31例造血干细胞移植患者进行有效的饮食护理干预可以提高造血干细胞移植患者的营养状况，保证移植的成功率。3讨论 3.1影响进食的因素：（1）特殊的病室环境，移植期间患者独居无菌层流净化仓，没有亲人的陪伴，以及对造血干细胞移植术的担心。（2）造血干细胞移植术前患者经过超剂量的放化疗预处理，对患者胃肠功能造成伤害，患者产生呕吐症状，食欲下降，进食明显减少。（3）因患者预处理期间体质虚弱，卧床休息，活动量减少，肠蠕动减慢，饥饿感下降。（4）急性移植物抗宿主病消化道反应影响消化功能，降低食欲。 3.2宣教饮食护理的重要性 移植前，加强与患者及家属的沟通，稳定患者的情绪，建立良好的护患关系，向患者及家属宣教充足的营养是造血干细胞移植成功的前提，破除饮食与食物致病的封建迷信的传统思想习惯，对这样的患者及家属要赖心的宣教，以保证患者能获取更全面的营养。 3.3饮食的消毒方法 为保证患者食物的无菌，患者的食物必须经过微波炉高火加热7分钟，告知患者家属选用微波炉专用的筷子、勺子、饭盒或器皿，所有食物必须装在饭盒中递给护理人员，如为馒头、包子、饺子等水分少的食物，放在蒸霸中隔水加热，水果应该洗干净去皮，剁成小块，煮成水果汤，进仓后护理人员再次高火加热，煮鸡蛋应该剥壳捣碎后递给护理人员，防止微波炉加热时发生爆炸，食物不要装的过满，防止经过微波炉长时间的高温加热而溢出，耽误病人的进食时间，也避免家属对护理人员的误解。患者预处理期间进食会减少，剩下的的食物禁止再次递给护理人员，必须重新再做食物。患者喝的水必须是二次烧开的水，避免进食或进水带给患者细菌。保证患者的食物及水的无菌。 3.4造血干细胞移植前饮食护理 正确指导家人配合做好饮食护理，注意饮食卫生，水果、蔬菜要洗干净，变质的食物勿食用，勿食生、冷、油炸、刺激性食物。食物必须新鲜，家人自己烹饪，勿食加工食物及零食，不可重复食用，避免消化道感染。饮食原则以清淡、易消化、高蛋白、高热量、为主，定时、定量，少量多餐，注意品种多样化及色彩的搭配，增加患者的食欲，经常食用瘦肉、蛋类、牛奶、鱼类（没有鱼刺），多食新鲜水果及蔬菜，不易消化的食物、产气食物勿吃如：糯米面加工的食物，红薯，洋葱、大蒜、大蒜黄、韭菜、韭菜黄、，没有发酵的面食。预处理期间由于超剂量放化疗，患者会有呕吐症状，告知患者呕吐后仍需坚持进食，呕吐后进食可中和胃酸，促进肠蠕动，减轻对胃黏膜的刺激，帮助患者建立合理的饮食结构。进食与化疗时间间隔大于2小时[2]可以减轻恶心呕吐。这时候应少量多餐，两餐之间可以吃些不易引起恶心的辅助食物，饮食宜清淡，勿油腻，调料品种不宜过多，少量多餐，做好患者及家属心里沟通，鼓励患者进食，指导患者保持情绪乐观，介绍造血干细胞移植成功的病例，使患者树立战胜疾病的信心，让患者听轻音乐，集中治疗和护理，为患者提供舒适的进餐环境。如果患者进食量仍然很少及时与患者的床位医生沟通，通过静脉输液补充维生素及氨基酸，防止加重患者的营养不良，以免影响治疗效果。化疗后4-8天易发生口腔溃疡，其发生率为83.7%[3]，口腔溃疡影响进食，因此要做好口腔护理，做口腔护理时要用手电筒及压舌板仔细检查口腔情况，动作轻缓，避免人为损伤引起出血，指导患者每日晨起、饭前、饭后、睡前，用预防细菌和真菌感染的漱口液交替漱口，每次漱口用舌头上下、左右、里外、前后，反复搅拌，每种漱口液每次含漱时间大于3分钟。发生口腔溃疡时宜进温流食、半流食。口腔溃疡疼痛影响进食时，可用2%利多卡因漱口。预处理期间患者的血小板会降低，指导家人烹饪食物勿过干、过硬、带骨、带刺、宜流质或半流质。预处理期间患者的血红蛋白也会下降，指导家人给予患者多食补血的食物及水果如：菠菜、芹菜、红豆、红枣、花生、黑米、紫米、枸杞、龙眼、黑芝麻、南瓜、石榴、橘子、猕猴桃等，患者食欲下降的时候可以将这些食物烹饪成粥或者汤类。指导患者多食粗纤维的食物及水果，多饮水，保持大便通畅，预防便秘。