南通大学学报（医学版）
Journal of Nantong University (Medical Sciences)2012∶32（1）
干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。
根据个体发育过程中出现的先后次序不同，分为胚胎干细胞(embryonic stem cells ，ESCs)和成体干
细胞(adult stem cells ，ASCs)。ESCs [1]是从囊胚的内细胞团中分离出来的细胞，能够无限自我更新，可分化为内、中、外3个胚层的各种细胞、组织。但由于干细胞研究的胚胎来源困难、本身具有致瘤性、免疫排斥及伦理等问题而限制了其在临床的应用。随着干细胞技术的发展，现在己证实可以将成体的终末分化细胞通过导入几个关键的因子使其再编程为胚胎干细胞样的细胞，这种细胞被称为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells ，iPs cells)[2]，它可以绕过伦理道德问题，但因为需要借助病毒载体导入基因，有编程效率低、成瘤性等问题，亦限制了它们在临床上的应用[1]。
ASCs 是存在于胎儿、
儿童和成人组织中的多能干细胞的统称，现在已经在多种组织器官被发现[3]，如造血干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、心脏干细胞及MSCs 等。一般认为，ASCs 只能分化为其组织器官的细胞类型，然而近几年的研究[4-5]表明，这些干细胞的分化能力远超过传统观点局限的范围，如神经干细胞可以分化为血液细胞，脐带血干细胞可以分化为神经细胞等。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells ，MSCs)是来源于中胚层的ASCs ，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。早在19世纪中叶，就有人发现骨髓具有成骨能力[6]，随着研究的深入，发现在不同诱导条件下，MSCs 不但可分化为软骨、
骨、骨骼肌、肌腱、脂肪等中胚层细胞，同时还可向外胚层的神经细胞和内胚层的肝卵圆性细胞[7]及多种组织和细胞分化，在
体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，而且易于分离、
培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，分泌的多种细胞因子具有调节免疫、支持造血的特性，免疫原性弱，遗传背景相当稳定并且不受胚胎干细胞研究中遇到的伦理问题限制。因此，MSCs 在细胞治疗、基因治疗及组织工程中得到广泛的应用。随着MSCs 在骨髓[6]、脂肪组织[8]、皮肤[4]等组织中被发现，越来越多的研究开始关注脐带[9]及胎盘[10]等妇产科来源的MSCs ，
并通过实验证明了其来源更丰富，免疫原性更低等优势。当然妇产科对于MSCs 来说不仅仅单纯是一个“贡献者”，更是其应用的“受益者”
。现参照文献结合我们的工作，就其两者之间的关系进行初步的综述。1
妇产科来源的MSCs 的种类
目前与妇产科相关的MSCs 大部分来源于胎儿附属物，如脐带、胎盘、羊水等，在其他组织器官中也有发现，但其研究应用尚较少，现就其来源概述如下：1.1胎儿附属物
1.1.1
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesencymal
stem cells ，UC -MSCs)人脐带(human umbilical
cords ，hUC)连接于母体和胎儿之间，妊娠期间为胎儿提供营养，由3部分构成：羊膜被覆上皮、脐血管和位于两者之间被称为华通氏胶(Wharton ’s Jelly)的黏液结缔组织。严格意义上来说UC-MSCs 来源分4种，即华通氏胶[10]、脐血、脐血管及脐带的血管周围细胞[11]，其中主要的来源基于前两种。
(1)人脐带华通氏胶的间充质干细胞(Wharton ’s
Jelly mesenchymal stem cells ，WJ -MSCs)：1991年有学者[12]首次报道从人脐带的WJ 中分离并培养到了
间充质干细胞与妇产科*
张玉泉**，杨晓清
(南通大学附属医院妇产科，南通226001)
[摘要]间充质干细胞(MSCs)起源于中胚层，是成体干细胞的一种。因来源广泛、获取容易、扩增能力强、免疫原
性低、非致瘤、能归巢、无医学伦理学争议等优点而成为再生医学、细胞疗法中的主要选择细胞。MSCs 从其来源到临床应用等方面都与妇产科关系紧密。本文主要简要阐述妇产科来源的MSCs 的种类以及其在妇产科疾病中的作用。
[关键词]间充质干细胞；妇产科；胎盘；脐带；卵巢早衰；卵巢肿瘤；子宫内膜
[中图分类号]Q8B R71[文献标志码]A [文章编号]1674-7887（2012）01-0001-06
*[基金项目]南通大学研究生创新基金资助(YKC10051)，南通市社会事业科技创新与示范指导性计划(S11914)
**[作者简介]
张玉泉，男，汉族，生于1964年11月，江苏省南通市人，医学博士，教授，主任医师，妇产科主任，妇产科教研室主任，硕士生导师，研究方向：妇科肿瘤、生殖内分泌、干细胞。
·专家述评·
1··
南通大学学报(医学版)2012∶32（1）
WJ-MSCs，剔除了脐血、脐血管、脐带外被羊膜的黏液结缔组织，是一种成纤维样细胞，具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。随后越来越多的研究[9，13]表明WJ-MSCs不仅易于分离培养，含量丰富，且具有来源广泛、取材方便、相对纯净及免疫原性低等优点，正成为临床细胞治疗的热点。表面可特异性的表达CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD106、CD73(SH3)、CD166及HLA-ABC，而造血干细胞表面标志物CD14、CD34、CD38，上皮细胞标志物CD31及HLA-DR则成阴性表达，但是CD106及HLA-ABC的表达与骨髓MSCs相比明显降低。WJ-MSC 细胞因子分泌谱除了表达骨髓MSC相关细胞因子外，还表达GM-CSF和G-CSF，并特异性表达人白细胞分化抗原HLA-G和神经胶质来源的神经营养因子G-DNF。但现仍有大多的文献未严格区分UC-MSCs与WJ-MSCs的关系，通常直接用未去除羊膜的脐带切碎植块培养，或者将WJ-MSCs即定义为统称的UC-MSCs[14]，导致其WJ细胞纯度的降低。
(2)人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUMSCs)：研究[5，15]表明脐血不仅含有大量造血干细胞而且含有丰富的MSCs。2000年，Rrices[15]首次报道了脐带血中可以分离培养出MSCs，高表达CD44和CD29，不表达CD34，且具有向多种细胞分化的潜能。孙国军等[16]采用密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs，细胞呈梭形，传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象。第3代MSCs体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。脐血MSCs的分离率较低，个体差异较大且会损失脐血中造血干细胞，因此限制了其临床的大量采集需要。
(3)人脐血管周围间充质干细胞[human umbilical cord perivascular(HUCPV)-MSCs]：Sarogaser等[11]2005年通过剔除脐带的华通氏胶及被覆羊膜后，将脐带血管(两条脐动脉及一条脐静脉)环状种植于培养瓶，18~24h后去除血管，通过离心等方法成功分离出大量成纤维细胞集落(colony-forming unit-fibroblast，CFU-F)，可迅速扩增，表面阳性表达CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD90(Thy-1)及CD44，阴性表达CD45、CD34、CD235a(glycophorin A)、CD106(VCAM1)、CD123 (IL3)、SSEA-4、HLA-DR、DP、DQ(MHCII)、HLA-G及Oct4，冻存不影响其生物学特性，被认为是一种具备MSCs特性的细胞来源。但是由于其来源及实验获取等方面均不如华通氏胶来源的MSCs丰富、简便易行，所以目前这方面的研究报道较少。
(4)人脐血管来源的间充质干细胞：脐动脉(hu－man umbilical cords arteries，UCA)，脐静脉(human umbilical cords veins，UCV)-MSCs：Mitchell等[17]2003年描述了脐带不同来源细胞的潜在分化能力，Ikuo Ishige等[18]在2009年亦进一步对人脐带的华通氏胶及脐动脉、脐静脉进行体外培养扩增，通过其CFU-F 的形成、免疫表型、免疫组化分析及体外分化潜能等进行分析比较证实了3种来源的MSCs类似细胞在细胞形态，集落形成及免疫表型方面均无明显差别，均可表现为阳性表达CD13、CD29、CD63、CD73、CD90、CD105及HLA-ABC，阴性表达CD31、CD34、CD45、CD133、CD271及HLA-DR，所不同的是U－CA-MSCs与UCV-MSCs相比在成骨潜能方面具有更高的碱性磷酸酶活性，而在软骨及成脂潜能等方面无差别，幼稚的高增殖潜能细胞较靠近羊膜下层，而靠近静脉的细胞则保持保持高分化的潜能。
1.1.2胎盘来源的MSCs
(1)胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchy－mal stem cells，PMSCs):胎盘不仅在胚胎的发育、营养、耐受力方面发挥作用，而且具备一种潜在的干细胞能力。在母体内，胚外中胚层来源的MSCs不断分化为结缔组织的血管，胚胎借此完成与母体的物质交换。胎盘在胎儿娩出后就完成使命成为“废弃物”，但又因其具有多向分化的能力以及自身取材方便、免疫抑制等诸多优点，将成为细胞治疗、组织工程以及基因工程领域新的研究热点。目前研究的PMSCs，多是指胎儿面即羊膜和绒毛膜部位的细胞，但也有人报道了对母体来源的胎盘细胞即蜕膜部位的细胞的研究，认为其具有多能性、肌纤维母细胞性、来源广、保存容易等特点[10，19]。Parolini等[20]提出了鉴定PMSCs的最基本标准即贴壁生长，成纤维样细胞形成菌落的能力，表达基本的特异性表面标志，如CD90、CD73及CD105，不表达CD45、CD34、CD14及HLA-DR，具有向1~2个谱系的细胞分化的能力，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、胚胎起源的细胞等。但是目前对于PMSCs还需要进一步优化细胞采集的技术，提高分离效率和纯度，通过大量动物的实验深入研究PMSCs在体内发挥效应的机制，才能为今后临床应用打下基础。
(2)人羊膜间充质干细胞(human amniotic mes－enchymal stem cells，hAMC)：人羊膜是隔离胎儿和母体的一种隔膜，具有无血管、无神经、无淋巴等特点。由于取材方便、保障充足的细胞来源及具有低免疫
2··
原性而为越来越多的研究者关注。人羊膜主要由人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelialcells，hAEC)和hAMC两部分细胞组成。hAEC的研究也在逐渐的深入，OCT-4、SOX-2等被认为是其表达的干细胞的标志，也可向神经及肝细胞分化[21]。hAEC可能拥有诸多干细胞特征，在体外可以向3个谱系的细胞转化，但是全部的hAEC还是hAEC的某个部位具有这种特征目前还不清楚。
1.1.3羊水间充质干细胞(amniotic fluid-derived mesenchymal stem cells，AF-MSCs)Tsai等[22]从孕4~ 6月人的羊水中分离培养获得的多能MSCs在诱导因子作用下能够向脂肪细胞、成骨细胞、神经系细胞分化，之后并证实了分化后的神经系细胞能够分泌释放多巴胺，证明孕中期羊水来源的胎儿MSCs同样具有向中胚层和神经外胚层细胞分化的能力。因此AF-MSCs作为胎儿来源的MSCs具有更广泛的研究前景。
1.2其他来源的MSCs
1.2.1子宫内膜来源间充质干细胞(endometrial mesenchymal stem cells，EMSCs)子宫内膜是一种具有高度增殖活性、周期性更新的组织。早在30多年前，有学者就推测子宫内膜可能存在干细胞[23]。近年来，随着干细胞研究的发展，EMSCs的研究也有了新的突破。Schwab等[24]通过体外培养的方法对子宫内膜成体干细胞进行了研究，发现了内膜中存在有MSCs样细胞，免疫表型表达CD90、血小板衍生的生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)-Rβ和CD146，但是不表达CD45或CD31，且向成骨、成脂、肌细胞及软骨细胞等分化。
子宫内膜息肉亦存在间充质干细胞(endometrial polyp mesenchymal stem cells，EPMSCs)，在女性的子宫内膜息肉中亦可分离出EPMSCs。Ding等[25]从6例子宫内膜息肉中分离并鉴定其细胞特征，细胞表达CD90和CD146，且能向成脂、成骨及神经样细胞分化。
1.2.2月经血间充质干细胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，MB-MSCs)近年，美国Musi－na[26]的研究小组从健康女性的月经血中分离出子宫内膜的MSCs。2008年，日本Hida[27]的研究小组也利用女性月经血成功分离培养出具有多重分化功能MSCs，这些MSCs具备内膜MSCs的表面标志，且体外可以分化为9个细胞系：脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞、肌细胞、上皮细胞、神经细胞、肝细胞、胰腺细胞、肺上皮细胞，可用于修复受损的心肌组织。但是由于不同供体个体差异较大的问题，其MSCs的增殖速率与供体年龄和原材料的质量密切相关。1.2.3输卵管来源的间充质干细胞(human fallopian tubes mesenchymal stem cells，htMSCs)Tatiana Jazedje等[28]通过全子宫加双附件切除或输卵管切除结扎女性的6例标本中，分离出具有MSCs特征的成纤维细胞。该细胞具有黏附性及集落性生长，造血因子表面标记物CD34、CD38、CD45、CD117和CD133表达阴性，内皮标记物CD31及单核细胞标志CD14阴性，黏附分子CD29、CD44和CD90及MSCs标记CD13、CD73、SH2、SH3和SH4均高表达。具有成脂、成骨、成肌等多种分化潜能。但是有关htMSCs报道目前较少，具体的鉴定及临床应用将有待进一步研究。
2MSCs在妇产科疾病中的作用
MSCs易于获取、分离及扩增，免疫原性弱，不受伦理问题限制并且具有高度的自我更新和多向分化的潜能，不仅在基因治疗及组织工程中得到广泛的应用，而且在临床各种疾病治疗中占据越来越重要的地位。目前MSCs的临床治疗涉及各个器官、系统的疾病，如神经系统[29]、心血管系统[30]、免疫系统[31]，而与妇产科相关的生殖系统的研究亦越来越成为热点，目前主要应用在以下几个方面。
2.1卵巢早衰MSCs治疗临床上对化、放疗所致的卵巢功能的损伤及卵巢早衰已引起广泛的关注。化疗药物损伤卵泡的机制尚未完全明确。但多数研究[32]已经认识到化疗药物对卵巢的损伤与卵母细胞及颗粒细胞的凋亡密切相关。目前对化疗所致卵巢损害的保护方法有多种，如体外补充雌、孕激素，卵母细胞冷冻保存，卵巢皮质的冻存与移植，GnRH-a 的使用等等各有褒贬也均存不足。随着年轻患者肿瘤发生率逐年上升，化疗后生育能力的保护和生活质量的提高日益引起医患双方的关注，当前通过大量的实验寻找各种减少卵巢损害以保护卵巢功能是每个妇科肿瘤学专家的努力方向。Fu X等[33]研究发现，当BM-MSCs在体外与添加了磷酰胺氮芥损伤的卵巢颗粒细胞进行共培养，通过检测其细胞凋亡及DNA的断裂损伤，体内通过腹腔注射环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)，建立兔的化疗损伤模型，然后将标记的MSC直接注入双侧卵巢，在移植后2、4、6和8周处死，通过动情周期及性激素的测定，卵泡计数，颗粒细胞的凋亡及相关凋亡因子Bcl-2和Bax的分析来评价卵巢功能的恢复情况，
张玉泉，等.间充质干细胞与妇产科3
··
南通大学学报(医学版)2012∶32（1）
结果发现MSCs移植能够提高卵巢的功能，修复化疗造成的卵巢结构的损伤。李彩霞等[34]也通过US-MSCs尾静脉的移植对化疗损伤的小鼠卵巢早衰动物模型进行了研究，发现UC-MSCs具有定向向卵巢部位归巢的能力。
2.2卵巢肿瘤目前，肿瘤生物防治已成为继手术治疗、化学治疗和放射治疗之后肿瘤治疗的第4种模式，其中以肿瘤免疫和基因治疗发展最为迅速。转基因肿瘤细胞株的建立和生物学活性研究是肿瘤基因治疗的重要基础。作为病毒载体，MSCs易于外源基因的导入和表达，且具有弱免疫原性、强大的迁移力和趋瘤性等独特的生物学特性，正逐渐显示出作为抗肿瘤基因负载细胞的良好应用前景及科研价值[34]。赵雯红等[35]以UC-MSCs作为基因治疗的载体，通过腺病毒介导将白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)基因转入UC-MSCs中，研究外源性IL-12对卵巢癌SKOV3细胞体内外作用的影响，结果显示转染IL-12基因的UC-MSCs能够在蛋白及mRNA水平表达IL-12基因，显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖并诱导其凋亡，抑制卵巢癌SKOV3移植瘤在裸鼠体内的生长。
2.3子宫内膜的更新及内膜的异位因子宫内膜因素所致不孕的妇女占不孕症发病率的5%~10%，不良子宫内膜的修复，生产替代细胞或组织，以替换因癌症或其他严重疾病而切除的组织或器官，是众多妇产科及干细胞研究者的关注焦点。目前除了EMSCs本身可能对于月经过后的内膜修复做出贡献[24]，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)更是其来源，不仅可迁移至子宫内膜，分化表达为EMSCs样细胞表达为内膜表面标记物，更能够分化为子宫内膜上皮样，成纤维样及蜕膜成纤维样间质细胞[36]。
但是对于子宫内膜损伤后或发育不良的女性，外源性的MSCs除去定向分化潜能外，是否能对其本身的细胞结构、组织结构及其功能的恢复有着修复作用则是更加值得思考的问题。MSCs与受损部位的细胞之间相互作用的一种重要机制就是旁观者效应机制(bystander effects)。当MSCs迁移到受损部位时，它们会优先选择刺激和修复受损的原有细胞，而非直接横向分化成受损细胞而填补其功能上的缺损[37]。这种作用机制提示我们，在发生损伤的急性期给予外源性的MSCs有可能会产生更理想的治疗效果。这也正是目前我们课题组所研究的方向，通过体外的部分实验已经得到初步的研究结果[38]。2.4MSCs在妇产科领域其他的应用
2.4.1免疫耐受性与子宫内膜容受性除了MSCs 的可塑性外，MSCs的免疫调节、免疫抑制功能尤其值得关注，MSCs的免疫耐受作用已得到广泛研究[31]。研究[39]已经证明了MSCs的免疫抑制作用，但作用机制尚未完全明确。目前认为可能由细胞与细胞的直接接触和可溶性免疫抑制因子两种方式介导MSCs 参与的免疫调节作用。MSCs的这种低免疫原性及其免疫耐受、免疫调节等功能在未来的妇产科的研究中可以得到更加深入的研究：首先针对着床窗口期的子宫内膜，其胚胎的着床类似于同种异体移植的一个过程，胚胎着床成功与否与其子宫内膜的容受性密切相关，MSCs的免疫豁免功能是否有助于提升子宫内膜的容受性增加不孕妇女的自然受孕率及辅助生殖技术的成功率等；其次针对临床习惯性流产尤其是免疫性流产患者的治疗，MSCs的治疗是否具有积极的保护作用，还有待于我们进一步的去探讨，也希望更多的更好的发掘其在妇产科领域的应用，给广大的患者带去福音。
2.4.2器官移植与移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease，GVHD)目前，已有关于子宫、卵巢移植的相关研究，因供体器官缺乏、免疫排斥反应等问题而进展甚微。胚胎干细胞的全能性，决定了其具有形成各种人体组织和/或器官的能力，现已在体外成功地培育出了生物膀胱及胃肠器官。但对于MSCs 的多种分化潜能已经得到证实，相对于ESCs的来源、伦理、免疫原性、致瘤性等，MSCs显示出更优越的前景，但目前，尚未有关MSCs在器官再造方面的研究报道。
尽管MSCs的器官再造未深入的研究，但MSCs 被用于临床上抗皮质激素性的GVHD已经得到广泛研究[40]。欧洲骨髓及血移植发展委员会对于骨髓MSCs在其GVHD患者的治疗效果研究已经进行到多中心的二期临床试验[41]。鉴于以上研究成果及MSCs的低免疫原性及其具备的免疫耐受、免疫调节功能，相信不远的将来若MSCs的再造器官培育成功，则会更好适应人体的免疫系统而不出现排斥反应，提高移植的成功率。
2.4.3宫内治疗利用造血干细胞(hemopoietic stem cell，HSC)作为靶细胞，进行宫内基因治疗是较早开展的一种治疗方法[42]，通常是利用一定的载体将外源性基因整合到HSC中，在干细胞分化、增殖过程中进行外源性基因的修复治疗。目前进行宫内基因治疗的方法主要有两种:一是间接法，将作为靶细胞
4··
的干细胞，在体外进行转染后再输入受体胎儿体内;另一种是直接法，将带有目的基因的载体注入到受体胎儿体内，在体内转染干细胞、表达外源基因而达到治疗目的。通过对MSCs的研究发现，MSCs的易于外源基因的导入和表达特性，弱免疫原性、强大的迁移能力及其对于修复组织缺陷或损伤有独特的优势，正逐渐显示出作为宫内治疗基因载体的良好应用前景及科研价值。若用于宫内治疗，将会给患有一系列先天性疾病、宫内发育不良的胎儿带来福音。
3MSCs应用的管理
MSCs的生物学特性及临床应用已经在各种各样的疾病中得到应用，对于损伤组织的修复可以通过各种机制发挥作用，比如分化、迁移、归巢、免疫调节及营养等。有关MSCs的管理亦受到越来越多的重视，首先：我们需注意规范间充质干细胞英文的使用规则，主要鉴别MSCs与“多潜能间质细胞”(mul－tipotent mesenchymal stromal cells，MSC)之间的区别。针对这一问题，国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT)在2005、2006年连续发表声明，建议规范“间充质干细胞”和“MSC”的使用，并为实验室和临床前期研究提出了定义人来源MSCs的参考标准[43-44]。其次是有关MSCs商品化的生产问题，已经在再生医学领域引起关注，MSCs 作为一种药物其生产化亦受到严格的规定。欧洲委员会(European Commission，EC)认为MSCs是一种高端先进的治疗药物产品，而在美国MSCs则被认为是一种属于人类的细胞、组织(human cell，tissue，and cellular and tissue-based product，HCT/P)，其细胞、组织的生产接受生物制品评估及研究中心(the Center for Biologics Evaluation and Research，CBER)的调节，且应当符合药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice，GMP)。最后，MSCs的临床应用仍存在着一些挑战，比如:MSCs免疫表型与其生物学功能之间的不确定性。迄今为止，MSCs的识别仍然没有明确，对于鉴定MSCs主要是根据它的形态、功能等，而不同来源的MSCs的表面标志物也不尽相同。没有特异性标记物或复合标记物可供识别。对于MSCs的长期应用的安全性尚缺乏临床的数据支持。对于体内移植的MSCs发挥作用的复合性作用机制仍需进一步证明澄清，MSCs移植的效率缺乏对照可比性[45]。所有这些都有待于进一步探讨。
[参考文献]
[1]Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryon-
ic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Sci-
ence,1998,282(5391):1145-1147.
[2]Colman A.Induced pluripotent stem cells and human dis-
ease[J].Cell Stem Cell,2008,3(3):236-237.
[3]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast pre-
cursors in normal and irradiated mouse hematopoietic or-gans[J].Exp Hematol,1976,4(5):267-274.
[4]Toma JG,Akhavan M,Fernandes KJ,et al.Isolation of
multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin[J].Nat Cell Biol,2001,3(9):778-784.
[5]Jeong JA,Ganfg EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differen-
tiation of human cord blood derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport,2004,15(11):1731-1734.
[6]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al.Pluripotency
of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].
Nature,2002,418(6893):41-49.
[7]Schwartz RE,Reyes M,Koodie L,et al.Multipotent adult
progenitor cells from bone marrow differentiate into func-tional hepatocyte-like cells[J].J Clin Invest,2002,109(10): 1291-1302.
[8]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from
human adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].
Tissue Eng,2001,7(2):211-228.
[9]Wang HS,Hung SC,Peng ST,et al.Mesenchymal stem
cells in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord[J].
Stem Cells,2004,22(7):1330-1337.
[10]In’t Anker PS,Scherjon SA,Kleijburg-van der Keur C,
et al.Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or ma-
ternal origin from human placenta[J].Stem Cells,2004,
22(7):1338-1345.
[11]Sarogaser R,Lickorish D,Baksh D,et al.Human umbili-
cal cord perivascular(HUCPV)cells:a source of mesenchy-
mal progenitors[J].Stem Cells,2005,23(2):220-229. [12]McElreavey KD,Irvine AI,Ennis KT,et al.Isolation,cul-
ture and characterisation of fibroblast-like cells derived
from the Wharton’s jelly portion of human umbilical cord[J].
Biochem Soc Trans,1991,19(1):29S-29S.
[13]杨晓清,张沐,杨兵,等.人脐带华通氏胶间充质干细胞
的分离、培养、鉴定及冻存、复苏[J].南通大学学报:医学
版,2010,30(6):413-415,419,F002.
[14]Friedman R,Betancur M,Boissel L,et al.Umbilical cord
mesenchymal stem cells:adjuvants for human cell trans-plantation[J].Bio Blood Marrow Transplant,2007,13(12): 1477-1486.
[15]Erices A,Conget P,Minguell JJ.Mesenchymal progenitor
cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol,
2000,109(1):235-242.
[16]孙国军,赵文静,陈曦,等.脐血间充质干细胞的分离培
养及生物学特性[J].中国组织工程研究与临床康复,
2011,15(14):2504-2507.
[17]Mitchell KE,Weiss ML,Mitchell BM,et al.Matrix cells
from Wharton’s jelly form neurons and glia[J].Stem Cells, 2003,21(1):50-60.
张玉泉，等.间充质干细胞与妇产科5
··
南通大学学报(医学版)2012∶32（1）
[18]Ishige I,Nagamura-Inoue T,Honda MJ,et https://www.doczj.com/doc/8f5474760.html,parison
of mesenchymal stem cells derived from arterial,venous,
and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord[J].
Int J Hematol,2009,90(2):261-269.
[19]Huang YC,Yang ZM,Chen XH,et al.Isolation of mes-
enchymal stem cells from human placental decidua basalis
and resistance to hypoxia and serum deprivation[J].Stem
Cell Rev,2009,5(3):247-255.
[20]Parolini O,Alviano F,Bagnara GP,et al.Concise review:
isolation and characterization of cells from human term
placenta:outcome of the first international Workshop on
Placenta Derived Stem Cells[J].Stem Cells,2008,26(2):
300-311.
[21]Takashima S,Ise H,Zhao P,et al.Human amniotic ep-
ithelial cells possess hepatocyte-like characteristics and
functions[J].Cell Struct Funct,2004,29(3):73-84. [22]Tsai MS,Lee JL,Chang YJ,et al,Isolation of human
multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester
amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol[J].
Hum Reprod,2004,19(6):1450-1456.
[23]Prianishnikov VA.On the concept of stem cell and a
model of functional-morphological structure of the en-dometrium[J].Contraception,1978,18(3):213-223. [24]Schwab KE,Gargett CE.Co-expression of two perivascu-
lar cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from
human endometrium[J].Hum Reprod,2007,22(11):2903-2911.
[25]Ding DC,Chu TY,Chiou SH,et al.Enhanced differentia-
tion and clonogenicity of human endometrial polyp stem
cells[J].Differentiation,2011,81(3):172-180.
[26]Musina RA,Belyavski AV,Tarusova OV,et al.Endome-
trial mesenchymal stem cells isolated from the menstrual
blood[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(4):539-543. [27]Hida N,Nishiyama N,Miyoshi S,et al.Novel cardiac pre-
cursor-like cells from human menstrual blood-derived
mesenchymal cells[J].Stem Cells,2008,26(7):1695-1704.
[28]Jazedje T,Perin PM,Czeresnia CE,et al.Human fallopi-
an tube:a new source of multipotent adult mesenchymal stem cells discarded in surgical procedures[J].J Transl
Med,2009,7:46-46.
[29]Fu YS,Cheng YC,Lin MY,et al.Conversion of human
umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton’s jelly to dopaminergic neurons in vitro:potential therapeutic ap-plication for parkinsonism[J].Stem Cells,2006,24
(1):115-124.
[30]Breymann C,Schmidt D,Hoerstrup SP.Umbilical cord
cells as a source of cardiovascular tissue engineering[J].
Stem Cell Rev,2006,2(2):87-92.
[31]Aggarwal S,Pittenger MF.Human mesenchymal stem
cells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood,
2005,105(4):1815-1822.
[32]Meirow D,Nugent D.The effects of radiotherapy and
chemotherapy on female reproduction[J].Hum Reprod
Update,2001,7(6):535-543.
[33]Fu X,He Y,Xie C,et al.Bone marrow mesenchymal
stem cell transplantation improves ovarian function and structure in rats with chemotherapy-induced ovarian dam-age[J].Cytotherapy,2008,10(4):353-363.
[34]李彩霞,王凤英,冷少华,等.脐带基质干细胞移植在卵
巢早衰模型小鼠体内的分布[J].第三军医大学学报,
2010,32(1):57-59.
[35]赵雯红,程建新,史鹏飞等.转染IL-12基因的人脐带
间充质干细胞对卵巢癌细胞的体外增殖和对裸鼠体内
移植瘤的抑制作用[J].南方医科大学学报,2011,31(5): 903-907.
[36]Aghajanova L,Horcajadas JA,Esteban FJ,et al.The bone
marrow-derived human mesenchymal stem cell:potential progenitor of the endometrial stromal fibroblast[J].Biol
Reprod,2010,82(6):1076-1087.
[37]Ji JF,He BP,Dheen ST,et al.Interactions of chemokines
and chemokine receptors mediate the migration of mes-
enchymal stem cells to the impaired site in the brain after
hypoglossal nerve injury[J].Stem Cells,2004,22(3):415-427.
[38]Yang X,Zhang M,Zhang Y,et al.Mesenchymal stem
cells derived from Wharton jelly of the human umbilical cord ameliorate damage to human endometrial stromal cells[J].Fertil Steril,2011,96(4):1029-1036.
[39]Casiraghi F,Azzollini N,Cassis P,et al.Pretransplant in-
fusion of mesenchymal stem cells prolongs the survival of
a semiallogeneic heart transplant through the generation of
regulatory T cells[J].J Immunol,2008,181(6):3933-3946. [40]Ringden O,Uzunel M,Rasmusson I,et al.Mesenchymal
stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease[J].Transplantation,2006,81(10):1390-1397.
[41]Le Blanc K,Frassoni F,Ball L,et al.Mesenchymal stem
cells for treatment of steroid-resistant,severe,acute graft-
versus-host disease:a phase II study[J].Lancet,2008,
371(9624):1579-1586.
[42]刘英,庄广伦,游泽山,等.经胎鼠腹腔途径进行人脐血
造血干细胞宫内移植的实验[J].中山医科大学学报,
2001,22(1):22-24.
[43]Horwitz EM,Le Blanc K,Dominici M,et al.Clarification
of the nomenclature for MSC:The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2005, 7(5):393-395.
[44]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal crite-
ria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.
The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.
[45]Si YL,Zhao YL,Hao HJ,et al.MSCs:biological charac-
teristics,clinical applications and their outstanding con-cerns[J].Ageing Research Reviews,2011,10(1):93-103.
[收稿日期]2011-11-15
6··
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院：生命科学学院 年级：2011 姓名：张胜男
前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！ 正文： 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/8f5474760.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/8f5474760.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ
1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1内源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞内调控因子的制约。 （1）胞内蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。 （2）转录因子的调控 在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化的调节非常重要。比如在胚胎干细胞的发生中，转录因子Oct4 是必需的。Oct4 是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达的转录因子，它诱导表达的靶基因产物是FGF-4 等生长因子，能够通过生长因子的旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层的进一步分化。Oct4 缺失突变的胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LIF）对培养的小鼠ES 细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体干细胞无作用，说明不同种属间的转录调控是不完全一致的。又如Tcf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信号通路的中间介质，当与 β-Catenin 形成转录复合物后，促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控 除内源性调控外，干细胞的分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素的影响。 （1）分泌因子 间质细胞能够分泌许多因子，维持干细胞的增殖，分化和存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们是TGFβ家族和Wnt 信号通路。比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞的分化。最近研究发现，胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多种神经元的存活和分化，还对精原细胞的再生和分化有决定作用。GDNF 缺失的小鼠表现为干细胞数量的减少，而GDNF的过度表达导致未分化的精原细胞的累积。Wnts 的作用机制是通过阻止β-Catenin 分解从而激活Tcf/Lef 介导的转录，促进干细胞的分化。比如在线虫卵裂球的分裂中，邻近细胞诱导的Wnt 信号通路能够控制纺锤体的起始点和内胚层的分化。 （2）膜蛋白介导的细胞间的相互作用 有些信号是通过细胞-细胞的直接接触起作用的。β-Catenin 就是一种介导细胞粘附连接的结构成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配体Delta 或Jagged 也对干细胞分化有重要影响。在果蝇的感觉器官前
间充质干细胞药物开发策略 干细胞药物开发的目的是，从“一对一”的个体化干细胞临床应用转向“一对多”的临床治疗方案，为临床提供标准化的干细胞制品。药物的开发需要遵循常规药物开发的流程，包括：药学研究、非临床研究、临床试验申请、早期临床试验、确证性临床试验、新药申请和批准上市等过程。 1干细胞制剂开发要点概述 干细胞制剂药学研究，主要包括工艺开发与质量评价： ①干细胞库与工作细胞库建立： 供者筛查、组织采集，细胞分离、纯化、培养、保藏、鉴别、效力检测，以及生物学特性、遗传学稳定性研究，干细胞库技术标准及工作标准建立； ②干细胞制剂工艺开发与药学研究： 大规模细胞扩增、细胞制备工艺、剂型选择、包装选择、处方筛选、制剂冻存/复苏工艺，体外操作对干细胞生物学特性的影响，过程质量控制，干细胞药物放行标准建立； ③干细胞制剂冷链运输和稳定性研究： 产品冻存与复苏、冷链运输技术、临床快速检验、稳定性研究等，稳定性研究包括冻存条件下制剂影响因素试验、长期试验，模拟临床应用条件的试验等，通过这些实验获得的药品稳定性信息来确定药物的储存运输条件、包装以及有效期。 干细胞制剂开发原则 干细胞制剂开发过程服从GMP原则，但应充分考虑活的药物与传统药物区别： ①供者细胞的合理性及筛查； ②生产材料应考虑，供者细胞、生产过程细胞分类分级管理，生产用原材料的风险评估， 外源因子去除，限制动物及人来源材料，基因修饰/改造按高风险管控，辅料使用考虑必要性、安全性和合理性； ③制备工艺与过程控制应证明可行性与稳健性，生产工艺的设计（QbD）应避免细胞发生 非预期的或异常的变化，全过程监控、持续改进，用连续自动化、全封闭手段减少污染； ④强调过程控制与制品放行互补，高风险操作评估，细胞制剂与回输制剂转换验证； ⑤质量研究取代表批次及生产阶段细胞的特性、功能性、纯度和安全性等分析； ⑥质量控制基于过程理解，兼顾认知，逐步完善，确证性与商业化保持一致； ⑦临床质量核准，方法验证与药典适用性验证，快速微量方法相互验证； ⑧稳定性研究应采取连续工艺，适用包装密封性研究、冷冻储存适应性研究等，运输条件，
间充质干细胞培养方法 １、间充质干细胞MSC基本形态?2。干细胞应用与干细胞调控、?３、间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞ＭＳC培养得合适气体环境 ５、细胞培养板得选择 6. 如何选用细胞培养基? 7. 如何维持培养液p H?８。血清与干细胞得培养?9、胎牛血清(F B S ) 10.细胞得细菌、真菌污染及排除 就是否需要灭活? １１、细胞培养污染得预防 1４。胶原酶V １２、使用胰蛋白酶时加入 E ＤTA得目得就是什么?１3、胶原酶得种类与选型? S胰酶 １5、干细胞得种类与表面标记 18. 干细胞老化得表现与处16.间质干细胞培养原理概述?１7、间质干细胞成脂与成骨诱导分化? 理 20。冷冻保护剂作用与选择 1９、细胞传代消化过程指导? 21。细胞冻存指导 2２。干细胞冷冻与复苏 2３、移植细胞得基因修饰?１、间充质干细胞ＭＳC基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征,可分为贴附型生长细胞,常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。?间充质干细胞ＭSＣ基本形态:形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核,胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同得突起、可瞧到细胞成螺旋状生长。? 2、干细胞应用与干细胞调控?干细胞得调控就是指给出适当得因子条件,对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发展。? 2.1内源性调控?干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化,包括调节细胞不对称分裂得蛋白,控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 (1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得。细胞得结构蛋白,特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要、如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器,包含有许多调节蛋白,如膜收缩蛋白与细胞周期素Ａ。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位,从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?(2)转录因子得调控 在脊椎动物中,转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct4 就是必需得。Oct4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FGF－4 等生长因子,能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oc ｔ4 缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子(LI Ｆ)对培养得小鼠ES细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用,说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得、又如Tｃf/Lef 转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要、Tcf／Leｆ就是Wnｔ信号通路得中间介质,当与β－Ｃateｎin形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊。 2.2外源性调控?除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(１)分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖,分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用,它们就是TＧＦβ家族与Ｗｎt 信号通路、比如TＧF 家族中至少
544 中国医药生物技术2018年12月第13卷第6期Chin Med Biotechnol, December 2018, V ol. 13, No. 6 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.011· 综述·间充质干细胞临床前安全性研究概况 张澄，霍艳，黄瑛，高阳，侯田田，肖亚妮，汪巨峰 间充质干细胞（MSC）于1974 年被第一次定义，而后在20 世纪90 年代得到推广[1]。2006 年，细胞疗法国际协会针对细胞表面阳性标志物为MSC 建立了一个最低标准，即CD90+、CD105+、CD73+、CD45–、CD34–、CD14–、CD79–、HLA–、DR–[2]。最初的临床试验中，MSC 主要是用于成骨不全[3]或黏多糖症的研究。近年来研究表明，MSC 也具备促血管生成、免疫调节、抗炎、营养支持等生物活性，这为其用于缺血性、炎性疾病等方面的治疗提供了可能性[4]。另外MSC 在实验中易于获得、可在体外大量扩增及有多系分化潜能的性质也表明其可成为组织工程的一个强有力工具[5]。 1 治疗机制及研究进展 临床前研究表明，MSC 一般通过自身分化、营养支持、免疫调节等机制发挥治疗作用[6]。间充质干细胞可由一系列组织分离得到，同时在一定条件下可分化成不同的祖细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及造血支持基质细胞，这些细胞进一步可分化为心肌细胞、神经细胞等。同时，MSC 可通过自分泌或旁分泌途径释放细胞因子，这些活性物质可定向聚集于特定部位起到抑制细胞凋亡、纤维化，促进血管生成或缓解炎性反应等作用[7]。另外，MSC 在体内可通过免疫调节来调节机体的免疫系统，借此治疗一些炎性疾病。最新研究表明，干细胞可能并没有免疫豁免的机制，其可能是通过免疫逃逸机制来实现相关治疗作用的[8]。 MSC 虽然在很多领域展现出极大潜力，但现今的研究仍面临很多挑战。临床试验虽然正在大力进行，但数据仍较为缺乏。临床前研究中，动物模型、干细胞来源、体外培养条件的优化选择目前都没有一个明确的规定。不同来源的人源干细胞分泌的细胞因子、分化方向也有很大差异。 2 安全风险因素 由于细胞自身生物学或实验操作等各种因素，干细胞在应用于临床或基础实验的过程中存在一定安全风险，主要可分为内源性风险、外源性风险及其他生物风险。 内源性风险主要包括：①干细胞肿瘤形成相关风险。干细胞具有不断增殖、对凋亡诱导不敏感等与肿瘤细胞相似的生长调控机制。有研究表明，胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）可引发良性或恶性的畸胎瘤，同时有研究表明高代次的鼠源MSC 可自发恶性转化。干细胞也可能影响体内已存在的肿瘤细胞的生长和扩增，即干细胞的“促瘤性”[9]。②干细胞免疫学相关风险。实验中需要考虑细胞的免疫原性和免疫调节性质带来的生物学风险。ESC 未分化前的免疫原性很低，但在分化后由于MHC 分子的表达可表现出较高的免疫原性。同时体外实验表明，ESC 和MSC 可通过调控T 细胞、单核细胞及NK 细胞等的增殖分化来调节生物免疫能力。③干细胞由于自身携带的传染性疾病、未知或罕见的病原体、遗传性疾病等而产生的风险。外源性风险主要包括：细菌、真菌、支原体及病毒污染[10]，一般来自于实验操作、细胞库污染和动物基质细胞污染等方面[11]。与内源性风险相比，外源性风险污染途径多，防控更为复杂。 另外由于干细胞的体内归巢和分化机制仍不明确[12]，干细胞进入机体内可能存在非靶向部位转移、目标以外的分化或去分化等风险。同时当大剂量的细胞被注射进入体内，可能阻塞在注射区域，严重的可导致注射区域组织坏死等情况。 3 临床前安全性研究概况 MSC 临床前安全评价一般分为两部分：一般毒性评价和干细胞特定安全评价。一般毒性评价包括行为观察、临床症状、血液生化测定、死亡率、组织病理检查等。干细胞特定安全评价包括致瘤性、生物分布等。其中一般毒性评价和一般生物制品的评价方式相似。另外目前针对干细胞特定的安全评价也已有一定的研究，但仍缺乏专门针对干细胞评价的相关文件规范进行指导。 干细胞安全评价实验设计中需考虑动物模型、给药途径、实验周期等相关因素。①动物模型：考虑到异种排斥，建议选择免疫缺陷或免疫抑制类动物，如NOD/SCID 小鼠、nu/nu 小鼠等，但也需考虑到该类动物寿命较短（12 ~ 18 个月），且可能产生自发肿瘤影响实验结果[13]。同时也有研究选择食蟹猴、狒狒等非人灵长类动物，这类动物模型存在数据采集困难、需进行免疫抑制操作等缺点。②给药途径：尽量和临床保持一致，实验中采用的给药途径主要有静脉注射、皮下注射和肌肉注射等方式。③实验周期：依据实验目的和动物种类的不同，需制定不同的实验周期。免疫缺陷的啮齿类动物的实验周期自8 d ~ 8 个月不等，但需考虑到超过 6 个月时动物可能产生自发性肿瘤，影响实 基金项目：国家重点研发计划课题（2016YFA0101503）；中国食品药品检定研究院学科带头人培养基金（2015X1）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09501007-004） 作者单位：100176 北京，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心/药物非临床安全评价研究北京市重点实验室 通信作者：霍艳，Email：yanhuo@https://www.doczj.com/doc/8f5474760.html, 收稿日期：2018-05-24