流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
北京大学生命科学学院考试专用纸姓名：学号：考试类别： 考试科目：普通生物学A 考试日期：2010－6－11阅卷教师：佟向军 以下为答题纸，共7 页
一、填空（每空0.5分，共35分） 1．我们的身体无法利用纤维素，是因为我们消化道内的________酶仅能水解________ 键，而无法水解_________键。构成淀粉和纤维素的单体都是________。 2．根据是否有细胞核膜来区分，细胞分为_______细胞和_______细胞。细胞骨架包括________、________以及________三种成分。其中：有丝分裂时，形成纺锤丝的是______，与胞质分裂相关的是________，与肌肉收缩有关的是______。 3．光合作用的光反应阶段在______进行，它又可分为光系统I和光系统II。前者的产物是______，后者的产物是________。光合作用的暗反应在___________进行，其主要作用是固定______，这一过程称为__________循环。4．细胞通讯与信号传递，对细胞的生命活动很重要。在这一过程中，能引起细胞反应的信号分子叫做________，包括______和______两大类。细胞本身与信号分子结合的蛋白质叫做________,它们在细胞中的位置各不相同，脂溶性信号分子的结合蛋白，主要位于__________，水溶性信号分子的结合蛋白，主要位于________。在细胞内，起第二信使作用的有________（举一例即可）。5．细胞周期包括_____、________、_______和______四个时期。DNA复制在____期。调节细胞周期的因子叫做____________，它由______和______两种蛋白组成。细胞周期有_____个检验点，它们分别位于____________期。 6．人的α－珠蛋白基因位于16p13.33, 其中16代表________________，p代表_________，13代表_______________。 7．DNA的复制是__________方式，即两条DNA链解开，分别以各自为____________，按照____________________原则，合成其互补链。复制所需要的酶主要是________________；复制无法从头开始，需要________________，它的成分是________________。新链的延伸方向是____________________，因此一条链连续复制，称为______________，另一条链复制不连续，称为____________，不连续的DNA片段叫做______________。 8．原核生物基因表达调控的主要方式是________________，它由____________、
分子生物学 1.ORF 答:ORF是open reading frame的缩写，即开放阅读框架。在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码列，叫做一个开放阅读框架。 2.结构基因 答：结构基因（structural genes）可被转录形成mRNA,并翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质或催化各种生化反应的酶和激素等。 3.断裂基因 答：基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或 RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区 5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。 4.选择性剪接 答：选择性剪接（也叫可变剪接）是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同或者是相互拮抗的功能和结构特性，或者，在相同的细胞中由于表达水平的不同而导致不同的表型。 5.C值 答：基因组的大小通常以其DNA的含量来表示，我们把一种生物体单倍体基因组DNA的总量成为C值（C value）。 6.生物大分子 答：生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。 7.酚抽提法 答：酚抽提法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。 8.凝胶过滤层析 答：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。 9.多重PCR 答：多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。 10.荧光域值 答：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。 11.退火 答：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢
流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤 分享 首次分享者：☆秋秋☆已被分享29次评论(0)复制链接分享转载举报一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA 和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，?多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
育明教育汉教专业资深专家徐老师以及13年6名育明考到北大汉教350分以上的学员综合分析：整体看来，2013年的北京大学汉语国际教育专业研究生入学考试的专业课的难度并不大，基本上还是延续着往年的难度，所以，2014年的北大考研的复习还是要以基础为关键点，打好基础。育明教育根据内部信息和7年的辅导经验，为2014年准备考取北大研究生的学生提供最权威的参考书目以及内部信息，希望能给14年准备考研的学生带来最大的帮助。 2014年北京大学汉语国际教育考研状元笔记及历年真题解析 北京大学汉语国际教育视频课程+内部资料+最后押题三套卷+公共课 阅卷人一对一点评=2500元 7月1日前购买8折优惠 第三章秦汉叙事散文 一、解释：1、司马迁2、《史记》3、《汉书》4、《吴越春秋》4《封禅仪记》。 二、填空 1、现存的秦代刻石文共有篇，大都出自之手。它们分别是、、、、、、。其中除刻石为两句一韵外，其余6篇皆为一韵。 2、西汉散文发展中出现了以剖白个人思想心迹为主的体散文，代表著作有邹阳的《》、枚乘的《》、司马迁的《》和杨恽的《》等。 3、刘向一生有著作多种，其中《》、《》等书的部分篇目具
有小说的意味，实开了六朝《世说新语》类小说之先河。 4、《史记》代表了古代散文的最高成就，鲁迅先生在《》中称它是“”。 5、司马迁，字，汉代成就最高的散文家。少年时曾随学习古文《》，向学习公羊派《》。后任，并参与制定了《》，因案被处以宫刑。征和二年（前91年）最终完成了《史记》的撰写，共历时年。 6、司马迁曾在》中提及其修史的宗旨是：“，，”。 7、《史记》是我国第一部以描写为中心的通史，全书由、、、、组成，记述了从至年间大约年的兴衰沿革史。 8、东汉的《汉书》是我国第一部史，它在方面取得了很大成就。 9、和《史记》的笔法不同，《汉书》重视，行文，从而形成和《史记》迥然有别的风格。 10、《吴越春秋》是成书于的一部散文，作者是。其书今存卷，主要叙述的故事。它在体例上兼有和史书的特点，是的雏形。 11、成书于的历史散文《》内容许多与《吴越春秋》相同。它们都以为主线索，又都出自文人之手，因而也都带有鲜明的的特点。
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
2010年北京大学、香港大学、北京航空航天大学 三校联合自主招生考试试题 （数学部分） 1．（仅文科做）02 απ<< ，求证：sin tan ααα<<．（25分） 【解析】 不妨设()sin f x x x =-，则(0)0f =，且当02 x π<< 时，()1cos 0f x x '=->．于是 ()f x 在02x π << 上单调增．∴()(0)0f x f >=．即有sin x x >． 同理可证()tan 0 g x x x =->． (0)0g =，当02 x π<< 时，2 1()10 cos g x x '= ->．于是()g x 在02 x π<< 上单调增． ∴在02 x π<< 上有()(0)0g x g >=．即tan x x >． 注记：也可用三角函数线的方法求解． 2．AB 为边长为1的正五边形边上的点．证明：AB 2 （25分） 【解析】 以正五边形一条边上的中点为原点，此边所在的直线为x 轴，建立如图所示的平面 直角坐标系． ⑴当,A B 中有一点位于P 点时，知另一点位于1R 或者2R 时有最大值为1PR ；当有一点位于O 点时，1 m ax AB O P PR =<； ⑵当,A B 均不在y 轴上时，知,A B 必在y 轴的异侧方可能取到最大值（否则取A 点关于y 轴的对称点A '，有AB A B '<）． 不妨设A 位于线段2OR 上（由正五边形的中心对称性，知这样的假设是合理的），则使A B 最大的B 点必位于线段PQ 上． 且当B 从P 向Q 移动时，A B 先减小后增大，于是max AB AP AQ =或； 对于线段PQ 上任意一点B ，都有2B R B A ≥．于是 22max AB R P R Q ==
样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
肿瘤分子生物学讲义 第一节概述 (1) 第二节肿瘤的发生机制 (4) 第三节癌基因及其致癌的分子机制 (5) 第四节抑癌基因及其抑癌的分子机制 (9) 第五节肿瘤转移相关基因 (11) 第六节肿瘤的预防和治疗 (13) 第一节概述 一、肿瘤及肿瘤分子生物学的概念 肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。 良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。不过有极少数良性肿瘤因其靠近生命中枢或能合成大量生物活性物质也可能杀伤宿主。例如，脑膜上生长缓慢的良性肿瘤通过压迫使得生命中枢萎缩破坏，最终导致宿主死亡；胰岛细胞良性肿瘤可以分泌大量胰岛素而引起体内胰岛素过量，导致低血糖和死亡。 恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。由于技术水平的限制，目前临床诊断的癌症患者多处于中晚期。加上不良生活方式如吸烟、过度饮酒、不合理饮食习惯，以及环境污染增加等因素，在刚过去的20世纪，世界各国许多常见癌症的发病率在总体上呈上升趋势，或维持在高水平，在我国的情况亦大致如此。目前除几种较少见的癌症如妇科的宫颈癌、绒癌等的死亡率有明显下降外，多数常见恶性肿瘤死亡率还处于令人忧心的高位态势下。有研究者预测，在21世纪癌症仍将是危害人类健康的主要疾病之一，故应引起预防、临床和基础研究者的高度关注。 恶性肿瘤几乎在所有类型的细胞中均可发生。根据组织学来源，癌症的起源可分为三种：癌（carcinoma）起源于上皮细胞，大部分成人癌症属此类；淋巴瘤起源于脾和淋巴结等的淋巴细胞；肉瘤（sarcoma）起源于间叶组织如结缔组织、骨和肌肉等。以上在各种实质性组织、脏器中发生的癌症属实体肿瘤（solid tumor）。白血病起源于骨髓造血细胞，恶性细胞存在于流动的血液中，属液体肿瘤（liquid tumor）。 肿瘤分子生物学，就是用分子生物学的理论和技术来研究肿瘤的一门科学，是医学和生物学的一门交叉学科 二、肿瘤的生物学特征 1、癌症是体细胞遗传病 就本质而论，癌症是一种遗传学疾病或体细胞遗传学疾病，可简称为遗传病。在癌细胞中发生的遗传学变异有：基因内的碱基替代、缺失、插入和基因扩增等，以及染色体的数量和结构的改变，如非整倍体、易位等；表遗传学改变有：DNA甲基化型式改变、组蛋白修饰和染色质改型等。这些改变引起了肿瘤抑制基因灭活和原癌基因的活化，它们所产生的恶性表型通过有丝分裂能在细胞世代间传递。上述过程均发生在体细胞，这是占全部癌症中绝大多数的、散发性癌症的发生模式。遗传性癌综合征不同于其他一些遗传病，它遗传的仅是癌易感性，还需要体细胞的多次击中才能产生恶性表型。 基因组内存在两类癌相关基因：一类基因直接调控细胞增殖与凋亡、运动与黏着，以及细胞基质的改型等，并参与细胞的信号转导，结果得以维持正常组织细胞的自稳性。当这些基因缺陷造成上述过程失衡，随着细胞各种恶性特征的积累，最终癌症发生。这些基因包括癌基因、肿瘤抑制基因中把关基因（gatekeeper gene）；另一类基因并不直接调控细胞的增殖和凋亡，而是影响第一类癌相关基因的突变速率的管护基因（caretaker gene），这包括各类DNA修复基因，还包括代谢酶多态性在内的一组修饰基因（modifier gene）。 2、癌细胞的恶性生物学特征
2010年北大自主招生试题（理科） 数学： 1.AB为正五边形边上的点，证明：AB最长为（根5+1）/2(25分) 2.AB为y=1-x^2上在y轴两侧的点，求过AB的切线与x轴围成面积的最小值。(25分) 3.向量OA与OB已知夹角，|OA|=1，|OB|=2，OP=tOA，OQ=（1-t）OB，|PQ|在t0是取得最小值，问当0 （2）剩余固体为Cu （3）剩余固体为Fe，Cu （4）可不可能剩余的固体只有Fe，为什么？ 6．已知C（s），氢气（g），乙醇（l）的燃烧热为394kJ/mol，286kJ/mol，1367kJ/mol，由这些可以知道哪些数据？ 7．在发烟硝酸H2SO4?SO3中，2molI2和3molI2O5生成I2（SO4）3，I2（SO4）3溶于水生成I2和I2O4，写出以上两个方程式。 8.测定溶液中Iˉ的方法，当Iˉ太少时可用增大倍数的方法，第一种：用氯气将Iˉ氧化为HIO3，后除去多余氯气，用KI还原HIO3后测定Iˉ的量；第二种：用IO4ˉ将Iˉ氧化为IO3ˉ，加入一种物质阻止IO4ˉ和Iˉ反应，用KI还原IO3ˉ后测定Iˉ的量。问以上两种方法分别将Iˉ扩大了多少倍？ 物理： 1．光滑平面，两个相隔一定距离的小球分别以Vo（左）和0.8Vo（右）反向匀速运动，它们中间有两个小球1在左侧m，2在右侧 2m，中间有一压缩的弹簧，弹性势能为Ep，当弹性势能全部释放后（1）求小球1，2的速度（2）若小球1能追上左边的以Vo运动的球，而小球2不能追上右边以0.8Vo运动的球，求m的取值范围。 2．物体做斜抛运动（1），抛出速度V与水平面夹角为θ，求落回抛出平面时与抛出点的距离。（2）若人以Vo抛出一个球，落回抛出平面时与抛出点的距离为L，求抛出速度的最小值，以及此时的θ。 3． 4．理想气体，从A状态到B状态到C状态后回到A状态，AB为等温变 一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1. （2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通 北大自主招生试题及答案 2008北京大学自主招生语文试题及答案 一共五大题。 一、写出一个四字短语，要求：偏旁相同。 二、用十个字写一句语义明确的话，要求：声母都是卷舌音，即zh,ch,sh,ri. 三、用文言写一段话，字数50以内。要求：至少出现三个“之”，每个之的意思用法都不相同。 四、默写一首五言律诗。再在每句适当的地方添加两个字，使之成为一首七言绝句。意境不必相同。 五、某官员贪污腐败被人检举，在单位的职工大会上作了检讨。请你模拟想象该官员的心理与口气，写一份检讨书。要求：检讨看似深刻，实际上毫无悔改之心，堆砌词藻，敷衍了事。字数600-700。 参考答案： 1、江河湖海波涛汹涌汹涌澎湃魑魅魍魉琴瑟琵琶 2、这是成人日，仍属正常处。（怎么说怎么别扭） 3、（1）本日，百数人齐聚京师之考场，为大学之自主招生，全国瞩目之。有人捧卷，久之，叹息搁笔。（就地取材。第一个“之”是“的”。第二个是“的”。第三个是代词。第四个是音节助词。）（2）翌日，各路英雄好汉齐聚长春大学之综合楼，摩拳擦掌，跃跃欲试。忽闻一兄台曰：科举考试，听之任之，如是而已。呜呼，真英雄耳！ 4、春晓 春眠不觉晓，处处闻啼鸟。夜来风雨声，花落知多少。 悠悠春眠不觉晓，时时处处闻啼鸟。漫漫夜来风雨声，家家花落知多少。 5、这个题有点怪，好像不教人学好。为什么要让学生写这种假惺惺的文章？ 人活着是为了生活快乐幸福，我却把生活当成了战场。我的生活主旋律是不满足也不幸福，因为贪婪占有的心是永远满足不了的，永远体验不到真正的幸福，永远在苦苦地追求更大的权力、更高的地位、更多的金钱，在恶性循环中耗尽生命之能。 回想我没有出事前，常常感到疲惫不堪，暴躁易怒，匆忙急躁，活得很累。一年来我反复思考这个问题，寻找原因。如今我感到，最根本的一点，是因为把自己看得太重要了，把权力、地位、金钱看得太重要了。总以为自己比别人强，总想得到更多人的尊重羡慕，总想得到更大的名声；总怕自己的自尊和面子受到伤害；总想得到更大的权力、更高的地位、更多的财富。按常理，追求这些很正常，但我太过分了、扭曲了、变态了。一个目标刚实现，立刻又有了新的目标，马不停蹄，费尽心机，精疲力尽、暴躁易怒。 我现在感到，追求事业首先不应有贪婪占有思想，应当客观根据自身的条件、能力，以平和的心态做事，要把做事本身作为目的，把过程作为目的。 在这种拜金主义思想的支配和影响下，金钱左右了我的价值取向、思想行为，使我失去了宝贵的自由。现在我知道，与自由相比，金钱一文不值。这种动机与结果的关系，细想让人感到真是莫大的讽刺。每个人都希望拥有幸福，但拜金主义不会给人带来幸福，只能使人走向贪婪。贪婪的人永远不满足，因此，可能抢占、囤积了许多财物，但精神永远是空虚不幸福的。我曾以为可以通过追求权力、地位、财富使自己获得幸福，没想到成了没有自由的最不幸福的人。 考生乙答案（回忆版） 1 魑魅魍魉 2 忍失人生志，执之只是痴 3 东山之凰，唳之南阳；之时不至，谁与之翔？眷之顾之，莫言忘之；时则不至，孰能思之？之时不至，将欲何之？ 4 夜黑雁飞高,单于夜遁逃。欲将轻骑逐,大雪满弓刀。 夜黑霜重雁飞高,惊闻单于夜遁逃。剑气欲将轻骑逐,凝作大雪满弓刀。 流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。 2010北京大学 香港大学 北京航空航天大学 自主招生（三校联招） 试题 数学部分 1．（仅文科做）02 απ<<，求证：sin tan ααα<<． 2．AB 为边长为1的正五边形边上的点．证明：AB （25分） 3．AB 为21y x =-上在y 轴两侧的点，求过AB 的切线与x 轴围成面积的最小值．（25分） 4．向量OA 与OB 已知夹角，1OA =，2OB =，(1)OP t OA =-，OQ tOB =， 01t ≤≤．PQ 在0t 时取得最小值，问当01 05 t <<时，夹角的取值范围． （25分） 5．（仅理科做）存不存在02 x π <<，使得sin ,cos ,tan ,cot x x x x 为等差数列．（25分） 2010北京大学 香港大学 北京航空航天大学 自主招生（三校联招） 试题 数学部分解析 1．（仅文科做）02 απ <<，求证：sin tan ααα<<． 【解析】 不妨设()sin f x x x =-，则(0)0f =，且当02 x π << 时，()1cos 0f x x '=->．于是()f x 在02 x π << 上单调增．∴()(0)0f x f >=．即有sin x x >． 同理可证()tan 0g x x x =->． (0)0g =，当02x π<< 时，21()10cos g x x '=->．于是()g x 在02 x π <<上单调增。 ∴在02 x π << 上有()(0)0g x g >=。即tan x x >。 注记：也可用三角函数线的方法求解． 2．AB 为边长为1的正五边形边上的点．证明：AB （25分） 【解析】 以正五边形一条边上的中点为原点，此边所在 的直线为x 轴，建立如图所示的平面直角坐标系． ⑴当,A B 中有一点位于P 点时，知另一点位于1R 或者2R 时有最大值为1PR ；当有一点位于O 点时， 1max AB OP PR =<； ⑵当,A B 均不在y 轴上时，知,A B 必在y 轴的异侧方可能取到最大值（否则取A 点关于y 轴的对称点A '，有AB A B '<）． 不妨设A 位于线段2OR 上（由正五边形的中心对称性，知这样的假设是合理的），则使AB 最大的B 点必位于线段PQ 上． 且当B 从P 向Q 移动时，AB 先减小后增大，于是 max AB AP AQ =或； 对于线段PQ 上任意一点B ，都有2BR BA ≥．于是22max AB R P R Q == 由⑴，⑵知2max AB R P =．不妨设为x ． 下面研究正五边形对角线的长． 如右图．做EFG ∠的角平分线FH 交EG 于H ． 易知5 EFH HFG GFI IGF FGH π∠=∠=∠=∠=∠=． 于是四边形HGIF 为平行四边形．∴1HG =． I H G F E 11 1 1x x-1流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
2008至2010北大自主招生试题及答案
流式细胞术实验方法
2010年北大自主招生联考数学试题及解答
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