一、概述
二、显微注射法
转基因小鼠模型制备，一般由专业技术人员来进行技术操作。首先要设计好转基因的载体。构建转基因载体，有几个必要的因素。首先，要找到所需要表达蛋白的基因，或者是 CDNA 序列。其次选择特异性的启动子，该特异性的启动子，可以决定基因的表达效果或者表达的组织。如果要求超水平表达，还可以加增强子，提高启动子的活性，增加表达水平。另外，还需要在所设计的 CDNA 的序列后面，加上 PolyA 尾巴，来增加表达的稳定性。然后将这些 DNA 片段，共同构建入子粒载体。
上图是常规的转基因子粒载体，从图上可以看到，该载体包括增强子、启动子、CDNA 及 PolyA 。将其串联起来，共同形成转基因载体。
（一）、启动子类型
在设计单纯转基因动物的过程中，启动子的类型非常重要，因为根据实验的目的，如果超水平表达，可以选择构成性的表达启动子。这类启动子可以不受调控，在所转入的细胞进行高水平的表达。如 CMV 启动子，SV40 启动子，这两个启动子是常用于超水平表达特定的基因。
第二类是组织特异性表达启动子，这类启动子由于组织特异性活性，只在特定的组织细胞有活性，来启动特定基因的转录。比较典型的有只在内皮细胞有活性的 TIE2 启动子，还有只在星形细胞有活性的GFAP 启动子。如果需要制备一个只在某一个组织器官特异性表达的基因，可以首先去选择只在这个组织器官有特异性活性的启动子。
第三类，是诱导性表达的启动子。有时需要表达的靶基因只是在某个时项，如在成年或者在某一阶段开始表达。可以选择一些启动子，该启动子只是在外源性化合物，给入诱导的情况下，才能够具有表达活性。如四环素诱导的启动子，只有给小鼠注入四环素的情况下才能够使该启动子具有表达活性，从而来控制靶基因的表达。
（二）、转基因注射流程
上图是转基因小鼠制备的主要流程。当构建转基因载体后，需要把转基因载体通过分子生物学的手段
进行扩增、存放，然后将环状的质粒载体，进行线性化。随后准备超排卵的实性小鼠，将其受精卵分离，通过微注射的方式将转基因载体注入受精卵的核内，然后再将微注射的受精卵重新植入假孕的小鼠子宫内，发育成子代小鼠。
这样获得的子代小鼠中，会有一定比例的小鼠，其细胞核内含有所转入的目的基因。通过分子生物学手段，如 PCR ，或者 Western blot 技术，来鉴定哪些个体含有转入的目的基因。
（三）、模型 1：AQP4 超表达转基因小鼠
1 、水通道 AQP4 在脑星形胶质细胞膜表达
这种小鼠是由 GFAP 启动子调控水通道蛋白 AQP4 ，在小
鼠脑内星形胶质细胞超表达。利用这个模型，可以研究水通道
4 在脑水肿发病过程中的作用。
因为在前期工作中已经知道水通道 AQP4 ，在脑的星形胶
质细胞膜呈高水平表达。当水通道 AQP4 被敲除后，研究发
现，水通道 AQP4 经敲除的小鼠在脑水肿发病的过程中慢于正
常小鼠。据此推测，水通道 AQP4 在脑水肿形成过程中，起非
常重要的作用。当其被敲除时，脑水肿进程会延缓。如果水通
道 AQP4 高表达是否会加速脑水肿进程，据此又设计了如下的
转基因小鼠模型。
2 、AQP4 转基因载体构建
如上图所示，首先构建水通道 AQP4 转基因载体。这个载体包括水通道蛋白 4 的 CDNA 部分， 3'端非编码序列部分，包括 PolyA 序列。还有 GFAP 的启动子，该启动子在脑星形胶质细胞具有特异性表达活性。另外，由于需要将 AQP44 在脑内进行超水平表达，所以在启动子前面加了一个增强子。然后把这些部分亚克隆到 PGEM3Z 质粒中，这样就构建了转基因的载体。
通过转基因载体的微注射，将注射后的受精卵细胞植回到母鼠的子宫内，发育成小鼠，在实验中共获得了 42 个小鼠。通过基因组 DNA 的 PCR 检测， 用 GFAP 启动子和 AQP44 的 CDNA 中的序列，合成了一对引物。通过这个引物可以检测含有目的基因的小鼠。通过基因组 DNA 的 PCR 检测，在 42 个子代小鼠当中发现了 4 个含有阳性片断的小鼠。
3 、AQP
4 转基因小鼠基因型鉴定
上图是 PCR 结果，发现其中有的 PCR 产物的条带增强，有的减弱。发生这种情况是因为单纯的转基因小鼠，注入的转基因载体随机的整合入小鼠的基因组，在转入基因组的过程中，可能只有一个拷贝进入基因组，也可能有多个拷贝同时进进入基因组。所以通过基因组PCR 检测，可以推断该转基因载体整合入基因组中的数量。然后可以选择整合数量较多的个体进行扩增。对这几个阳性表达的小鼠进行了保留，然后将该小鼠与野生型小鼠进行交配，再次获得了它们的子代。对子代水通道AQP4 的表达水平，进行了检测。发现其父母代基因组 PCR 表达 DNA 最强的小鼠，子代水通道 AQP4 的表达水平也最高。
4 、AQP4 在转基因鼠脑超表达
上图是水通道 AQP4 的 MRNA 表达水平和蛋白质表达水平，左图是转基因小鼠，其水通道 AQP4 的表达水平可以是野生型小鼠的三倍以上。右图是用 Western blot 的方法表示的水通道 AQP4 的蛋白表达水平。可以看出，该转基因小鼠所表达的水通道AQP4 蛋白质，明显高于的野生型小鼠。同时，水通道 AQP4基因敲除的小鼠，也做了对照。基因敲除小鼠没有水通道 AQP4 的表达，所以从结果可以断定，转基因小鼠可以表达正常的水平水通道 AQP4 , 并且其表达水平远远高于野生型小鼠。
5 、AQP4 蛋白在脑内的表达定位
三、基因打靶
什么呢？
是什么？
小鼠。杂合子小鼠每一对的等位基因中，其中有一个是基因打靶的基因，一个是正常基因。然后，把这种杂合子小鼠进行交配，交配之后，会有 1/4 的小鼠是纯合子小鼠。即 1/4 的小鼠每一对等位基因呢都是经过基因打靶的。有一半的小鼠还是杂合子，即还有等位基因中的一个是被打靶的，一个是野生型的，另外还有 1/4 是野生型的。所以通过这些步骤，就可以获得基因打靶纯合子小鼠。纯合子小鼠的等位基因都是受打靶的，所以可能不表达靶基因所产生蛋白，或者是表达突变的蛋白。这就是基因打靶的整个过程。
上图是基因打靶总过程的总解，每一个步骤都需要耗费时间的，所以，即使整个实验都很顺利，从设计载体到基因打靶，然后从微注射，最后到小鼠，整个过程都很顺利的话，也需要一年的时间。如果在某一步遇到困难，可能时间还要延长。所以在计划研究工作时，需要把进行的时限预先设定。
四、基因敲除
基因敲除是通过基因打靶敲除部分或者整个基因，阻止其蛋白的表达。主要用于研究特定基因在体内的生理功能。下面举例实验室建立基因敲除小鼠模型。
上图是尿素通道蛋白 UT-B 基因敲除的打靶载体。首先要克隆尿素通道蛋白 UT-B 的基因，然后设计和构建水通道，尿素通道蛋白 UT-B 的打靶载体。把该基因的外显子，即内含子 -2 这一部分作为打靶的短臂，把内含子 -6 的部分序列作为长臂，中间加上青霉素的抗性基因，构建打靶载体。用 PGK 、 PK 作为自杀基因，然后构建载体。然后通过基因打靶，获得将 UT-B 基因一部分置换的打靶基因。
右图是基因打靶后，用 Western blot 来确定，打靶的位置是正确的。然后，分别用 Western blot 和这个免疫组化，对打靶的效果进行鉴定。从 Western blot 的结果来看，其 MRA 表达情况，野生型和
杂合子的小鼠比较，纯合子基因敲除小鼠的 MRA 的长度明显缩短，正常情况下 MRA 是两条带，可以看出基因打靶之后 MRA 还是两条带，但是都短于正常的 UT-B 的 MRA 。缩短的长度与实验中设计基因打靶载体所去除的那部分长度等同。所以，在 MRA 水平，基因打靶的产物是正确的。
然后用 Western blot 来看其蛋白表达情况，见上图。可以看出，野生型和杂合子小鼠都有正常的尿素通道蛋白 UT-B 的表达。基因敲除的纯合子小鼠，没有 UT-B 蛋白的表达。从免疫染色的实验结果来看，正常野生型小鼠 UT-B 是在肾脏的支小血管膜上表达。在基因敲除小鼠的纯合子没有 UT-B 蛋白的表达。所以，基因敲除模型是成功的。
正常的小鼠，尿浓缩能力非常强。其尿的渗透压可以达到两千左右。如果进行禁水处理，禁水 18 小时后，其尿的浓缩能力，可以提高。这时尿的渗透压可以达到 3500 毫渗。
但是当把尿素通道 UT-B 基因敲除后，见上图。在正常的条件下，尿的渗透压只是 150 毫渗。即使18 个小时禁水处理，尿的渗透压也仅仅可以达到 2000-2500 左右。明显地低于正常的野生型小鼠。所以，就证明 UT-B 在尿浓缩过程中起非常重要的作用。从这个角度来看，这个基因的蛋白敲除是成功的。
五、基因敲入
基因敲入是通过基因打靶用突变基因置换正常基因，来表达异常蛋白。主要用于模拟人类遗传病模型。如 AQP2 突变基因敲入小鼠模型。
水通道蛋白 2（AQP2），正常情况下是在肾脏、集合
管主细胞的顶膜表达。经过多年研究，发现该蛋白存在很
水通道蛋白2（AQP2）的作用是（）
如上图所示，通过 Western blot检测发现 AQP2 mRNA ，在基因打靶后，产生突变的 AQP2 T126M 突变型的 mRNA ，在长度上与正常的 AQP2的 mRNA 一样。但是，其表达水平，却显著性增高。因为AQP2 是降压素调控的蛋白。当机体需要进行水吸收的过程中，需要 AQP2 高水平的表达，增加肾集合管对水的通透性，然后进行水的吸收。但是，当突变的 AQP2 表达后，不能正常地行使 AQP2 的功能，所以，不能进行水的重吸收。会产生脱水的症状，机体会反馈增加加速的水平，来调控 AQP2 的表达。通过反馈增加了突变的 AQP2 的 mRNA 的水平。从右图的 Western blot 结果可以看出，突变的 AQP2 蛋白迁移的位置与正常的野生型小鼠不同。通过糖的裂解分析，发现是由于异常的糖化所造成的。
如上图所示，由于 AQP2 的功能缺失，在进行尿浓缩能力实验时发现，在 AQP2 基因突变后，尿的渗透压明显低于正常野生型小鼠，表明其尿浓缩功能出现了缺失。通过对血的渗透压检测发现血的渗透压，明显升高，表现了严重的脱水征象。
右图的照片，表现的是正常的野生型小鼠、杂
合子小鼠和突变基因敲入的小鼠，可以看出由于突
变的小鼠出现了明显的尿崩症的症状，所以发育迟
缓，并且一般死于一周内。由于出现了这一症状，
这类小鼠是很难作为模型来研究 AQP42 在尿崩症中
发病的机制，也很难用它来作为筛选新药的模型去
寻找治疗 AQP42 突变的药物。所以，又设计了建立
条件基因敲除小鼠。
六、条件基因敲除小鼠。
Cre 是重组酶，LoxP 是一段含有 34 个碱基的 DNA 序列。Cre 重组酶可以识别 LoxP 序列，通过DNA 重组的原理，可以将两个 LoxP 序列之间的片断，即 DNA 片断去除。如果是没有 Cre ， LoxP 只是
在特定的基因片段两侧，不影响基因片段的活性。
一旦 Cre 酶有活性，就可以把 LoxP 中间所夹的序
列去除，这就是条件基因敲除制备的方法。右图是
LoxP 位点。
上图是条件基因敲除的载体。在正常的基因敲除载体，长臂和短臂之间放上了 LoxP 序列。中间把原来正常的基因序列，还按照正常的顺序放到里面。当重组酶出现的情况下，就可以识别 Loxp 的位点，把LoxP 中间夹的片段给去除。
上图是所设计和构建的水平通道蛋白 AQP2 的基因条件敲除的载体。可以看出，该载体与前面的基因敲入载体很类似。只不过是在外显子 -2 中，没有突变位点。然后在外显子 -2 两侧，加入了两个 LoxP 序列，通过基因打靶可以把带有 Loxp 序列，置换到正常的 AQP2 的基因部位所产生的基因打靶结果。在诱导 Cre 活性出现的时候， LoxP 两侧的中间夹的外显子 -2 被去除掉。这样就可以产生条件的敲除。
经过条件敲除制备的小鼠。在 AQP2 在 mRNA 水平和蛋白质水平的表达情况，见上图。野生型小鼠在肾脏和睾丸等器官表达有AQP2的mRNA ，但是进行诱导敲除的小鼠，在组织器官没有明显的 AQP2 的 mRNA 表达。从逆转录 PCR 即 RT-PCR ，也可以断定，没有 AQP2 的 mRNA 的表达。然后 Western blot 技术，来鉴定蛋白质的表达水平，可以看出，条件敲除后 AQP2 不能在小鼠进行正常的表达。
上图是免疫染色的结果，可以看出，正常的野生型小鼠 AQP2 蛋白，在集合管的主细胞顶膜表达，当进行条件敲除后， 95%-98% 的集合管上皮细胞都没有 AQP2 的表达，只是个别的细胞存在 AQP2 的表达。敲除率可以达到 95% 或者到 98% ，基本上是成功的。
由上图可的功能性鉴定可以看出，当 AQP2 的基因，没有进行条件敲除时，尿的渗透压大概是 2000 mOsm 左右，这一条曲线，虚线是表示野生型的小鼠，实线是表现出 AQP2 条件敲除的小鼠，在前几天，是没有进行诱导敲除的情况下，其尿的渗透压和正常野生型小鼠非常接近的。当给诱导物注入后，由于Cre 活性的出现， AQP2 被敲除。可以看出，基因条件敲除之后，小鼠尿的渗透压明显地降低了，由2000 mOsm 降低到 200 mOsm 左右。尿量，在没有进行条件敲除时，小鼠的尿量和野生型小鼠是一样的，大概都是每 24 小时可以分泌 2ml 左右。但是当 AQP2 的基因被条件敲除后，尿量明显增加，可以达到25ml ，25ml/24h ，甚至尿量可以高于其体重。
七、条件敲入小鼠
有了 AQP2 突变敲入的小鼠，也有了 AQP2 的条件敲除小鼠，用这两个小鼠模型，就可以来建立AQP2 突变条件敲入小鼠。
上图是建立 AQP2 突变条件敲入小鼠的模式图。可以把 AQP2 的突变杂合子小鼠，不能使用纯合子，因为纯合子到一周就会死掉。杂合子小鼠和 AQP2 条件敲除小鼠进行交配，得到一条染色体带有 AQP2 的突变基因，一条染色体带有 AQP2 条件敲除的基因，这也是一个杂合子。在需要的时候呢，可以诱导小鼠体内的 Cre 重组酶的活性，将条件敲除 AQP2 的基因诱导敲除。只剩下 AQP2 的突变基因还在等位基因位点，所以表达出来的蛋白产物应该是 AQP2 的突变蛋白产物，而不表达正常的 AQP2 的蛋白产物。
上图是 AQP2 突变敲入的这个小鼠鉴定的示意图。可以推断 Western blot 结果，所获得的带型，哪一条带是条件敲除，哪一条带是条件敲入的鉴定。
基因组 PCR 的手段来鉴定 AQP2 的效率，因为杂合子有一条染色体含有 AQP2
条件敲除的基因，一条染色体带有 AQP2 突变的基因，需要 AQP2 进行敲除。诱导性
条件敲除能敲除多大 的效率呢？通过 PCR 来鉴定，结果表明，经过敲除后，基因组
中所含有正常的这个野生型的 AQP2 的基因，只有 5% 以下。所以，说明条件敲除是
成功的。通过小鼠模型，其肾脏的蛋白检测，发现通过 Western blot 所检测的蛋白
( 见右图 ) ，在条件敲入小鼠 AQP2 基因突变条件敲入小鼠， AQP2 的蛋白长度
呢，与正常比是不一样的。这个长度与一开始所做的那种基因敲入小鼠所产生的突变
AQP2 的蛋白，在长度和特异性上是一样的。所以 AQP2 条件敲入的这个模型，也是
成功的。
上图表现了正常的野生型的 AQP2 蛋白在肾集合管顶膜的表达。在突变条件敲入的小鼠，我突变的AQP2 ，都是在集合管主细胞的细胞内，后来确定在内质网中表达，只有个别的细胞 AQP2 才在集合管顶细胞的膜表达，这个表达的细胞，实际表达的是条件敲除，没有敲除的是个别的细胞。条件敲除可能可以敲除 95% - 98% ，剩下 3-5% 的细胞仍然还可以表达
正常的 AQP2 ，是表达正常的一部分。
同样对敲除后的肾功能、尿浓缩机制也进行了检
测，见右图。发现条件敲入小鼠在诱导正常 AQP2 敲
除的过程中，尿的渗透压明显降低。虽然还要略微高
于纯粹的条件敲除， AQP2 条件敲除的小鼠，但是与
野生型小鼠比较，尿的渗透压明显降低。说明小鼠模
型建立是成功的。
通过检测尿浓缩能力来证实 AQP2 突变蛋白影响到尿浓缩能力，见下图。
达，来研究基因结构与功能，建立人类疾病的动物模型，研究各种药物的作用
2008年8月 第16卷 第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16 N o.4 研究报告 Dicer 1转基因小鼠模型的建立 郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1 , 吕相川1,张梅英1,王禄增 1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳 110001) 【摘要】 目的 建立Dicer 1转基因小鼠模型。方法 构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论 成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。 【关键词】 Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠 【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203 Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse Model ZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1 , LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(https://www.doczj.com/doc/8216402113.html,boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ; 21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China ) 【Abstract 】 Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA. 【K ey w ords 】 Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice [基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。 [作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与 基因敲除。E -mail :zhihongzheng @1631com [通讯作者]王禄增。E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是 2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码 蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表 达。其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA 剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。 DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶, DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。1 材料方法 111 Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
转基因小鼠肿瘤模型的研究进展 沈富毅，潘隽玮，郁嘉伦，余昂，侯晓骏 [摘要]动物模型在肿瘤病因的揭示，发病机理的探索以及治疗措施的评估中有着不可替代的重要作用。继常规转基因方法之后，可诱导表达转基因、基因打靶、条件性基因打靶以及基因捕获等技术的出现及其在肿瘤模型建立中的应用为我们提供了大量能较好模拟人体相应肿瘤的动物模型，极大地深化了我们对肿瘤生物学行为的认识，并有助于人们找到攻克肿瘤的办法。 [关键词]肿瘤，小鼠模型，转基因 肿瘤是一类严重危害人类健康及生命的重大疾病，动物模型在肿瘤病因、发病机理的揭示以及治疗措施的评价中发挥着不可替代的作用。肿瘤动物模型最早源自小鼠自发突变系或经致癌剂诱变而得，对它们的研究使我们对环境致癌物及其代谢活动机理有了一定的认识；但自发突变频率在自然状态下通常很低，而诱发模型也因其不可精确控制性而限制了它们的应用。在过去的二十多年里，随着人们对癌基因激活或抑癌基因失活在肿瘤发生发展中作用的认识日益深入，以及近年发展起来的小鼠生殖系引入可诱导或精细调控突变技术的应用，小鼠肿瘤模型的建立工作取得了突破性进展，本文就此作一简要综述。 1.常规转基因（transgenic） 上世纪80年代初发展起来的原核显微注射技术，使我们可以将外源DNA直接导入小鼠生殖系以构建转基因动物模型。目的基因在合适启动子驱动下表达，可赋予转基因动物新的表型，通过其表型分析可识别研究基因的功能。转基因动物技术在肿瘤研究中的主要作用就是建立转基因的肿瘤动物模型，该研究始于1974年，Jaenisch等1用显微注射法将多瘤病毒SV40的DNA导入到小鼠的囊胚（blastocyst）中，在子代小鼠的肝、肾组织中检测到了SV40的DNA。这一结果证明，将外源基因导入胚胎细胞中并实现整合是可能的。以后相继有人用同样的方法实现了外源基因向小鼠受精卵的转移，并能遗传给后代。在基因转移的方法上相继出现了逆转录病毒载体法、电脉冲法等。1985年，Adams2等用转基因方法首次构建了B淋巴瘤myc癌基因易位的小鼠模型，此后10年，陆续发展了针对各种类型恶性肿瘤的转基因小鼠研究。如今这项技术运用较为成熟的是，利用免疫球蛋白启动子调控的c-myc基因在转基因小鼠中的表达，导致早期淋巴瘤的发生3。在LTR/c-myc转基因小鼠模型中，利用哺乳类动物肿瘤病毒长末端重复序列（LTR）驱动c-myc广谱的表达，可造成多种组织形成肿瘤，如睾丸、乳腺和淋巴系。1984年Stewart把小鼠乳腺癌病毒（MMTV）的增强子与myc基因或ras基因连接,形成的MMTV-myc转基因小鼠和MMTV/V-Ha-Ras转基因小鼠都有高的乳腺癌发生率4。近年来，这项技术更多的运用于肿瘤发生机制的探索上。Li等5构建了乳腺癌WAP-Tag转基因小鼠模型，该模型由小鼠乳清酸蛋白WAP启动子和SV40大T抗原构建而成，可用于乳腺癌变过程中细胞的增殖与凋亡、DNA突变及修复机制等方面的研究。在慢性粒细胞性白血病(CML)的研究中，Heisterkamp等6构建的bcr-abl和crkl双转基因小鼠发病潜伏期及存活期均大大缩短，直接证明了crkl参与
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.doczj.com/doc/8216402113.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医
转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
基金项目：国家自然科学基金资助（３１２７１２７１ ）＊通讯作者文章编号：１ ００７－４２８７（２０１９）０７－１２３９－０６Ｔ ＳＣ１转基因敲除小鼠动物模型的构建及敲除效果的初步研究 王 红１， ２，３，蒋 莉４，王 岩５，许振凯６，王威平６，方 航１，２，３，孙 鹏７，８，９＊，白晓春１，２，３，６＊（１． 南方医科大学附属第三医院，广东广州５１０６３０；２．广东省骨科研究院，广东广州５１０６３０；３．广东省骨科医院，广东广州５１０６３０；４．吉林大学第一医院急诊科，吉林长春１３００２１； ５． 吉林大学中日联谊医院科学研究中心，吉林长春１３００３３；６．南方医科大学，广东广州５１０５１５；７．中山大学肿瘤防治中心麻醉科，广东广州５１００６０；８．华南肿瘤学国家重点实验室广东广州５１００６０； ９． 肿瘤医学省部共建协同创新中心，广东广州５１００６０）摘要：目的 为探讨ｍＴＯＲ信号通路在骨骼发育过程中的机制作用，建立骨骼发育相关的ＴＳＣ１转基因小鼠， 提供稳定的动物模型。方法 取８周龄健康清洁级ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠分别与肢芽干细胞特异性重组酶（Ｐｒｘ－１－Ｃ ｒｅ）小鼠、软骨细胞特异性重组酶（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）小鼠及成骨细胞特异性重组酶（Ｏｓｘ－Ｃ ｒｅ）小鼠进行杂交。将繁殖出的小鼠继续与ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ小鼠回交，并对其子代小鼠的基因型进行鉴定及ｍＴＯＲ活性检测。结果 杂交后分别获得肢芽 干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠和成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠各８只。与正常组 比较，上述３种转基因小鼠ｐ－ Ｓ６均比正常组升高（Ｐ＜０．０５）。结论 本实验成功应用Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系统构建肢芽干细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、软骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠、成骨细胞特异性ＴＳＣ１敲除小鼠，均提示ｍＴＯＲ活性增高， 有明显ＴＳＣ１敲除效果，为ｍＴＯＲ信号通路研究骨与软骨发育的机制作用提供实验基础。 关键词：基因敲除小鼠；骨发育；Ｔ ＳＣ１；ｍＴＯＲ信号通路中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｅｆｆｅｃｔ ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ１，２，３，ＪＩＡＮＧ Ｌｉ４，ＷＡＮＧ Ｙａｎ５，ｅｔ ａｌ．（１．Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆ ｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；３．Ｏｒｔｈｐａｅｄｉｃ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇ ｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；４．Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉ Ｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；５．Ｃｈｉｎａ－Ｊａｐａｎ Ｕｎｉｏｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊ ｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｓ ａｉｍｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＴＳＣ１ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ａｂｏｕｔ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏ－ｖｉｄｅ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｂｏｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８－ｗｅｅｋ－ｏｌｄ ｈｅａｌｔｈｙ ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ｍｉｃｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｐｒｘ－１－Ｃｒｅ）ｃｈｏｎｄｒｏ－ｃｙ ｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ（Ｃｏｌ２ａｌ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ（Ｏｓｘ－Ｃｒｅ）ｍｉｃｅ．Ｔｈｅｂｒｅｅｄｉｎｇ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ ｗｉｔｈ ＴＳＣ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ｍｉｃｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｍＴＯＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｏｆｆ－ｓｐｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎ ８ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ．Ａｎｄ ｐ －Ｓ６ｏｆ ｔｈｏｓｅ ３ｔｒａｎｓ－ｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｌｉｍｂ ｂｕｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ，ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ａｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｂｙ Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ ｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｙ ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈ ｍＴＯＲ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ ｈａｖｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ ＴＳＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｅｆｆｅｃｔ，ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ ａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ；ｂｏｎｅ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ＴＳＣ１；ｍＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄｉａｇ ｎ，２０１９，２３：１２３９） 结节性硬化复合物１（Ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｏｍ－ｐ ｌｅｘ１，ＴＳＣ１），是人类的一种抑癌基因，与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐ ａｍ－ｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）有着密切的联系。目前研究发现，ｍＴＯＲ能整合细胞内外各种信号，是机体与细胞感受营养的信号通路［１］。ＴＳＣ１位于ｍＴＯＲ信号通路的上游，对ｍＴＯＲ有一定抑制作用。既往研究主要集中ｍＴＯＲ信号通路对心脑疾病及肿瘤发病机制的探讨，而近期实验发现ｍＴＯＲ信号通路在骨骼— ９３２１—中国实验诊断学 ２０１９年７月 第２３卷 第７期
1. 基因准备 2. 实验用鼠的饲养 小鼠品系的选择需结合实验要求，如果必须使用规定的品系，则可按规定或特定要求进行。用于转基因实验的小鼠根据其作用可分为供体鼠、受体鼠、结扎公鼠、种质公鼠。供体鼠是提供受精卵的母鼠，为了得到更多的受精卵，通常要对其进行激素注射；受体鼠是用于胚胎移植的假孕母鼠，以后生育转基因小鼠；结扎公鼠是有交配能力，但没有繁殖生育能力的公鼠；种质公鼠用于与供体母鼠配种。本项试验将全部应用C57/BL6 ×DBA杂交的F1代小鼠。 转基因实验需要定期提供相当数量的母鼠作为受精卵供体和假孕母鼠，以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎输精管的公鼠（简称结扎公鼠）。这些鼠可由实验动物中心提供，在实验前做好这些鼠与转基因相关的管理与饲养。 2.1 供体鼠 一般说来，杂交子一代鼠较纯系鼠产卵多，受精卵显微注射后两细胞分裂率较高，产仔较好。作为供体母鼠的种系，自然产卵数与超排卵数均应较高。一般用4～6周产仔更多但卵细胞膜脆性较大，在操作过程中易破裂；而6周以后母鼠产卵逐渐减少。 2.2 受体鼠（即假孕母鼠） 母鼠在正常发情期与结扎公鼠交配即产生假孕母鼠，假孕母鼠作为显微注射后受精卵的受体及其后代的养母。这种母鼠以6周龄至5个月龄较适宜，体重最好大于20克。母鼠一般4～5天为一个发情周期，因此在1个较大的母鼠群中约有20～25％进入发情期，如进入发情母鼠数与结扎公鼠数相近，可将每个公鼠笼内放1只母鼠；如母鼠数显著多于公鼠，可于每个公鼠笼内放2～3只母鼠。也可不考虑发情期，随机将每个公鼠笼内放2～4只母鼠。一般准备较多的假孕母鼠以防移卵失败。未使用的假孕母鼠可在阴栓产生两周后重复使用。 2.3 结扎公鼠 结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠和供体母鼠。用作母鼠假孕的结扎公
转基因小鼠的制备 显微注射法 这一方法的实验程序如下： ⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母； ⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配。次日从输卵管内收集受精卵备用； ⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内； ⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟； ⑸对幼鼠的鉴定： ①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）； ②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系； ③自小鼠内脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。亦可取胚胎进行分析。显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。
基因打靶与基因剔除技术 ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner cell mass）中分离出来的。它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。 基因打靶是指外源DNA片段上带有与受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。该方法的一般策略如下：
转基因小鼠制备实验方法（protocol) 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并与正常公鼠 合笼；另取数只适龄母鼠（2月龄以上）作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同 颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒 细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中 放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的 受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴 入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中 的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位臵，将注射针刺入受精卵的雄 原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上 下分开放臵，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱
培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。 吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个 气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其 余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三 个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时， 即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
转基因小鼠的饲养小鼠饲养的技术 为了使饲养小鼠工作有条不紊，必须将各项操作统筹安排，建立固定的操作程序，使饲养人员不会遗漏某项操作，下面是精心为你的小鼠饲养的技术，一起来看看。 动物房： 应该建立合理的动物房，对于所用动物的研究，按合理的等级进行建立。 饲料： 应该购买专门供实验用鼠吃的饲料，不可以用宠物资料对待。 饮水： 根据动物房的送风系统，选择合适的鼠笼，然后根据鼠笼情况选择饮水水瓶。对于动物的饮水也要根据实验要求选择不同的水质。 温湿度：
要配合动物房情况，进行合理通风，保持一定的温度和湿度。 温度和湿度要按照国际规定进行相关设定和控制。 光照： 要进行昼夜光照，模拟自然环境，最好进行一些程序测定。进 行昼夜光照的测定。 1. 饲喂 小鼠胃容量小，随时采食，是多餐习性的动物。成年鼠采食量 一般为3～7克/天，幼鼠一般为1～3克/天。应每周添料3～4次， 在鼠笼的料斗内应经常有足够量的新鲜干燥饲料，在小鼠大群饲养中，每周应固定两天添加饲料，其它时间可根据情况随时注意添加。 根据小鼠不同阶段的生长发育特点，应有不同的给饲标准。由 于种鼠群和生产鼠群交配繁殖频繁，尤其生产种母鼠的负担重，能量消耗大，因此除供给足够的块料外，还要定时饲喂少量葵花籽、麦芽和拌有鸡蛋的软料。葵花籽供应量为0.5～1克/天/只成年鼠。而麦 牙和软料由于微生物条件较难控制，目前趋于淘汰不用，而致力于颗粒料的全价营养，即用维生素合剂代替。
2. 给水 用饮水瓶给水，每周换水2～3次，成年鼠饮水量一般为4～7ml/天，要保证饮水的连续不断，应常检查瓶塞，防止瓶塞漏水造成动物溺死或饮水管堵塞使小鼠脱水死亡。小鼠在吸水过程中，口内食物颗粒和唾液可倒流入水瓶。为避免微生物污染水瓶，换水时应清洗水瓶和吸水管。严禁未经消毒的水瓶继续使用。 3. 清洁卫生和消毒 每周应至少更换两次垫料。换垫料时将饲养盒一起移去，在专门的房间倒垫料，可以防止室内的灰尘和污染。一级以上动物的垫料在使用前应经高压消毒灭菌。 要保持饲养室内外整洁，门窗、墙壁、地面等无尘土。 坚持每月小消毒和每季度大消毒一次的制度。即每月用0.1 %新洁尔灭喷雾空气消毒一次,室外用3%来苏尔消毒,每季度用过氧乙酸(0.2%)喷雾消毒鼠舍一次。笼具、食具至少每月 __消毒一次，鼠舍内其它用具也应随用随消毒。可高压消毒或用0.2 %过氧乙酸浸泡。