跨膜丝氨酸蛋白酶研究进展 郭晓强 (解放军白求恩军医学院生物化学教研室,石家庄050081) 摘要 跨膜丝氨酸蛋白酶(T MPRSSs),又名II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)是一类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白家族,哺乳动物中已发现二十多个成员。T MPRSSs基本结构类似,C端蛋白酶结构域在胞外,N端位于胞内,还拥有单跨膜结构域,差异之处在于主干区。T MPRSSs具有多种重要生理功能,功能异常可造成耳聋、癌症、贫血和高血压等多种疾病。本文对T MPRSSs基本特征、结构、生理功能及相关疾病进行综述。 关键词 跨膜丝氨酸蛋白酶;耳聋;癌症;贫血;高血压 中图分类号 Q55 蛋白酶是一类水解蛋白质的酶类,最早于上世纪初在胃液中发现(胃蛋白酶),至今已鉴定多个成员。最早认为蛋白酶主要通过非特异性水解蛋白质参与食物消化,然而一系列研究表明哺乳动物体内还存在一些具有底物选择性的蛋白酶,它们参与更为多样的生理过程,如细胞周期、形态建成、细胞增殖和迁移、排卵、血管生成和细胞凋亡等,功能异常可造成代谢性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、关节炎和癌症等的发生(Puente等.2003)。相对于传统水溶性蛋白酶,新近发现一类特殊蛋白酶———具有单跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶,并且C端位于胞外,因此被称为II型跨膜丝氨酸蛋白酶(type II trans me mbrane serine p r oteases,TTSPs)(Hooper等. 2001),又称跨膜丝氨酸蛋白酶(trans me mbrane p r o2 tease serines,T MPRSSs),这些新成员的发现和深入研究使人们对蛋白酶有了全新的认识[1]。 一、T M PRSS结构与基本特征 自1988年发现第一个跨膜丝氨酸蛋白酶T M2 PRSS1(hep sin)(Leytus等.1988)以来,至今已在人、小鼠和大鼠中发现二十多个成员,仅人类就有十几种(表1)。T MPRSS表达具有明显组织特异性,T M2 PRSS6主要在胎儿和成年肝脏中表达(Velasco等. 2002),而T MPRSS10主要存在于心脏(Yan等. 1999),这种表达模式说明不同T MPRSS参与不同生理过程。T MPRSS家族成员在分子量上差别巨大,如人T MPRSS1包含417个氨基酸残基,而T M2 PRSS10由1042个氨基酸构成,两者相差1倍以上,但基本结构却高度相似,均含四部分,从N端到C 端依次为短细胞质结构域、跨膜结构域、主干区和丝氨酸蛋白酶结构域,后两者位于胞外,不同成员区别主要集中于主干区。 根据主干区不同,T MPRSS可被进一步分为四个亚家族:HAT/DESC、hep sin/T MPRSS、matri p tase 和corin[1]。HAT/DESC亚家族包括T MPRSS11d (HAT)和T MPRSS11e(DESC1),它们结构最为简单,主干区仅由单一SE A(sea urchin s per m p r otein, enter opep tidase,agrin)结构域构成[2](图1)。hep2 sin/T MPRSS亚家族包括T MPRSS1～5和T MPRSS13等,是包含种类最多的一个亚家族,主干区包含清道夫受体富含半胱氨酸(scavenger recep t or cys2rich, SRCR)结构域和低密度脂蛋白A类受体(l ow densi2 ty li pop r otein recep t or class A,LDLa)结构域。matri p tase亚家族包括T MPRSS14(matri p tase21)、T MPRSS6(matri p tase22)和T MPRSS7(matri p tase23),其主干区除含有SEA结构域外,还包含2个CUB (comp le ment p r otein subcomponents C1r/C1s,urchin e mbryonic gr owth fact or and bone mor phogenetic p r o2 tein1)结构域及3到4个串联重复LDLa结构域。corin亚家族目前只发现一个成员T MPRSS10(cor2 in),其结构最为复杂,主干区包含8个LDLa结构域,2个frizzled结构域和1个SRCR结构域。 图1 几个典型T MPRSS结构特点[1]
读书报告 钙蛋白酶抑制蛋白研究进展 汪超钟正泽杨飞云周晓蓉曹兰 （重庆市畜牧科学院重庆荣昌402460） 摘要：钙蛋白酶在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度，钙蛋白酶抑制蛋白是在细胞内广泛表达的、高效的、专一性抑制钙蛋白酶活性的蛋白质，因此引起了广大研究者的广泛关注。本文阐述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构，生物学作用，营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其活性测定方法。 关键词：钙蛋白酶抑制蛋白结构生物学作用活性测定 Research Progress of Calpastatin W ang chao, Zhong zhengzhe, Y ang feiyun, Zhou xiaorong ,Cao lan (Chongqing Academy of Animal Science,Rongchong 402460 ) Abstact: Calpain make a contribution to Meat Tenderization by degradation of protein in the postmortem meat tenderization process. Calpastatin , a special endogenous inhibitor expressed extensively in cell , has a special inhibition to calpain. Therefore ,This paper review the structure ,biologic function, influenced factors , separation and activity assay of calpastatin. Key words: Calpastatin. Structure , Biologic function, influenced factors , activity assay 钙蛋白酶(Calpain)是一种钙激活中性半胱氨酸内肽酶，分布于所有脊椎动物的肌细胞内部。钙蛋白酶家族包括μ-钙蛋白酶,m-钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin）等。钙蛋白酶在骨骼肌中通过涉及生肌细胞分化、激发肌原纤维蛋白周转来调控生长，同时在宰后肉类成熟过程中通过降解肌肉蛋白质而提高肉嫩度。钙蛋白酶被钙离子和钙蛋白酶抑制蛋白调控[1]。钙蛋白酶抑制蛋白是一种有着多种功能的内源抑制剂，它通过抑制钙蛋白酶而发挥作用。本文综述了钙蛋白酶抑制蛋白的结构、生物学作用、营养等因素对钙蛋白酶抑制蛋白的影响及其分离与活性检测方法等。 1 钙蛋白酶抑制蛋白的结构 肌肉组织中钙蛋白酶抑制蛋白的分子量为77 KDa，斯托克半径为6.8nm，含
血管内皮生长因子与肿瘤治疗的研究进展 【摘要】肿瘤生长和转移依赖于血管生成,肿瘤血管生成是受多种细胞因子、生长因子及其受体调控,其中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)被认为是最关键的调控因子, 以VEGF及其受体作用途径中的任一环节为靶点,阻断VEGF对肿瘤血管的作用,都可以达到遏制肿瘤生长和转移的目的。VEGF靶向抗肿瘤血管生成成为抗肿瘤的新策略。 【关键词】VEGF 肿瘤靶向治疗 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),也叫做血管通透因子(vascular permeability factor,VPF),在正常胚胎发育时有广泛的表达,但正常成年者的组织中呈低水平表达,在肿瘤等病理情况下其表达异常升高。VEGF是一种高度特异性的血管内皮细胞有丝分裂因子,通过与其特异性受体(VEGFR)结合,引起一系列的信号转导,释放多种细胞因子与生长因子,刺激血管内皮细胞增殖和迁移,促进新生血管生成,在肿瘤的生长和转移中起重要作用。 1．VEGF生物学功能 VEGF的功能包括:①诱导内皮细胞钙浓度短暂升高、形态改变、分裂及运动,影响内皮细胞基因表达,加快基底膜降解,从而发挥促血管生成功能。②增加血管通透性,使血浆蛋白外渗,形成血管化纤维蛋白基质,为内皮细胞迁移形成网架。血管内物质外漏也为肿瘤转移提供基质,这对于肿瘤发展和转移可能比促内皮细胞增生更重要。另外,肿瘤细胞分泌的VEGF弥散作用于肿瘤周围组织的毛细血管,使其通透性增加造成瘤周水肿。③改变内皮细胞基因表达,诱导其合成大量蛋白水解酶,加速血管构建。④抑制宿主抗原呈递细胞成熟,使肿瘤细胞得以逃避免疫监视。⑤诱导血管内皮细胞bcl-2基因表达,提高诸如放射损伤细胞、血管内皮细胞抗凋亡的能力。 2．VEGF促进肿瘤生长、侵袭、转移的机制 肿瘤的侵袭、转移涉及到多个步骤:包括在局部生长到一定大小后瘤细胞从原发灶脱落,细胞外基质和基底膜的降解,瘤细胞进入血循环后逃脱宿主的免疫监控而存活下来, 瘤细胞达远处组织器官后粘附, 继而新生血管形成, 最后继发成瘤。VEGF几乎参与了此过程中的各个步骤，而不仅仅只作为促血管生成因子和血管通透性因子。 2．1 VEGF通过对内皮细胞的增殖、迁移、粘附的调节而促进新生血管的形成。 2．2 肿瘤细胞分泌的VEGF通过自分泌机制与瘤细胞上的VEGFR-2(KDR)结合，调控下游基因的表达而促进瘤细胞的生长、侵袭、转移。 2．3 VEGF通过抑制树突细胞的分化、成熟，减少树突细胞的生成从而降低宿主免疫功能。3．VEGF肿瘤治疗中的应用 3．1 基因治疗 3．1．1 反义寡核苷酸 反义寡核苷酸可抑制VEGF基因水平的分泌,也可特异性降低细胞中VEGFR mRNA水平。高渝等利用超声微泡介导VEGF反义寡核苷酸转染作用于人膀胱癌裸鼠移植瘤模型，
胶原蛋白酶的研究进展 摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，可显著提高其营养及生理功能，胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了胶原蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等，并展望其研究方向。 关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素 Abstrac t: The nutritional and physiological function of collagen protein can be significantly improved via chemical or enzymatichydrolysis，as the collagen protein was difficult to be absorbed by human body due to the triple helical characteristic molecules structure. Collagen protease is a kind of high value of protease. In this paper, introduces the definition of collagen enzyme, selection, influence factors, mechanism etc. The future development direction it was also prospected. Key words: collagen protease, mechanism, influence factors 胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性［1 － 3］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增加［4］。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一[5-6]。 胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[7]。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收率几乎达100％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等[8]。寻找一种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。 1 胶原蛋白酶的定义和选择 1.1 定义 胶原蛋白酶(Collgaenolytci protease)定义为在适当的pH 和温度下，只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类[9-10]。 1.2 酶的选择 能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166 等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之外，还必须考虑酶对胶原的作用位点，因为这直接影响最后水解产物分子量的分布，是决定能否得到目标产物的一个关键因素[12-13]。细菌胶原酶可分泌到胞外，通过发酵可大量获得，微生物来源的胶原酶在应用方面具有更广的应用范围[11]。
内容摘要： 血管内皮屏障功能的调节机制相当复杂。α-凝血酶等炎症性介质引起内皮通透性增高的机制可能是通过g蛋白激活磷脂酶，介导三磷酸肌醇等第二信使产生，并进一步激活蛋白激酶c和肌球蛋白轻链激酶，最终引起球蛋白轻链磷酸化，从而导致内皮细胞f-肌动蛋白骨架重排，中心张力增加，细胞间裂隙形成，内皮细胞通透性发生改变。 血管内皮屏障功能的调节机制相当复杂。α-凝血酶等炎症性介质引起内皮通透性增高的机制可能是通过g蛋白激活磷脂酶，介导三磷酸肌醇等第二信使产生，并进一步激活蛋白激酶c和肌球蛋白轻链激酶，最终引起球蛋白轻链磷酸化，从而导致内皮细胞f-肌动蛋白骨架重排，中心张力增加，细胞间裂隙形成，内皮细胞通透性发生改变。 血管内皮包括内皮细胞（ec）单层和基膜，是血管腔面的一层半选择性通透屏障。血管内外溶质和液体的交换受体内皮通透性大小控制。通透性是检测内皮屏障功能的客观计量指标。许多炎性、成血栓性（thrombogenic）介质均可损伤内皮屏障功能，导致其通透性增高，血浆蛋白渗出，引起组织、器官水肿和功能障碍。血管内皮屏障功能障碍是炎症的主要特征之一，并参与肿瘤转移、免疫反应及多器官功能障碍的发生。本文就近年来血管内皮障碍功能调节的研究进展，特别是有关的信号转导机制作一简要综述。 一、内皮细胞间连接与内屏障功能 ec间存在紧密连接、中间连接和缝隙连接[2，3]。缝隙连接主要存在于动脉ec间，静脉ec间也有少量存在，新近发现人脐动、静脉内皮的缝隙连接含有cx37、cx40和cx43三种连接素（connexin）[3]。紧密连接和中间连接则普遍存在于ec间。细胞间接损伤导致ec 间裂隙形成和内皮通透性增高，是通透性水肿发生的基础。 （一）紧密连接紧密连接多存在于ec的近腔面。有的环绕整个细胞形成闭锁小带；有的则间断存在，称为闭锁斑。闭锁小带只见于脑血管内皮，其它器官ec间主要是闭锁斑。电镜观察发现，ec间的紧密连接部位存在由双侧胞膜形成的叶片（leaflets）状结构，彼此粘合紧密，对溶质分子的跨内皮转运起限制作用。紧密连接的胞浆面还存在着一种分子量为225kd蛋白质zo-1[1，2]，与胞内f-肌动蛋白骨架相连。 细胞骨架包括微丝、微管和中间丝。微丝主要由f-肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-辅肌动蛋白组成，f-肌动蛋白骨架包括不同的微丝束类型，如应力纤维、细胞周边的致密外周束（dense peripheral band）、中央短纤维等[4，5]。它们之间可以相互转化。位于核周的中央短纤维产生的中心张力（centripetal tesion）是调节内皮通透性的直接动力。中心张力来源于肌球蛋白轻链（mlc）磷酸化介导的肌动-肌球蛋白间相互作用[3]。它与由ec 间连接、ec-基膜间粘附所产生的拴缚力（tethering force ）是一对作用方向相反的力。前者使ec产生收缩；后者的作用则将ec与ec、ec与基膜拴缚在一起。两者平衡时，ec间隙和骨皮通透性维持正常状态；当内皮受到炎性介质如α-凝血酶等刺激时，f-肌动蛋白骨架发生重排，中心张力增加并通过zo-1使细胞间连接发生改变，结果细胞收缩变圆，ec间裂隙形成，内皮通透性增高[5，6]。 （二）中间连接内皮中间连接发生在相邻细胞的钙粘附素（cadherins）分子之间，由ca2++介导，以同质粘健（homotypic adhesion）的方式使两侧的钙粘附素分子端-羰连接[2]。同持粘附是指同种分子之间发生的粘附。钙粘附素分子的中一端通过纽带蛋白（vinculin）、α-辅肌动蛋白和catenin与f-肌动蛋白呈链状连接，因此f-肌动蛋白骨架的变化可通过以上链状结构影响中间连接，使ec间裂隙和内皮通透性发生改变。ca2+通过影响钙粘附素之间及钙粘附素与catenin之间的连接参与内皮屏障功能的调节，起着“钙开关”的作用。胞内ca2+浓度（[ca2+]i）升高，内皮屏障功能下降；ca2+]i下降到原来水平，内皮屏障功能又
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－ ＂．宁Ｊｆ啦汞统：，聊２ｔｘｌ２≈筚２２卷掉ｌ朗 钙粘附蛋白Ｅ与肺癌的关系讯 Ａ 河北医科大学第三医院呼吸内科（石家庄０５００５１）田凤军王智勇综述 河北医科太学第二医院呼吸内科（石家庄０５００００）马俊艾审校 摘要钙粘附蛋白Ｅ是钙粘附蛋自家族中的重要成员之一，其表达与多种肿瘤的生物学行为密切相关．近年的研究发现该蛋白与肺癌的类型、分期、分级、转移和预后有关，该蛋白低表达有可能成为啼癌的诊断指标和预后不良的预警信号。同时也有可能成为肺癌治疗的新靶点： 关ｔ词钙粘附蛋白Ｅ；肺癌；诊断 钙粘附蛋白（ｃａｄｈｅｎｎ）是一个同嗜型细胞粘着 蛋自家族，在多种组织中都有表达。该蛋白细胞外 区有５个串连的重复序列，其粘合性、刚性和稳定性 都需要与钙离子结合。钙粘附蛋白Ｅ（Ｅ．ｃａｄｈｅｒｉｎ， Ｅ－ｃａｄ）是该家族中的重要成员之一，位于染色体 １６ｑ２２．１，主要在上皮细胞表达，以平行二聚体形式 存在于细胞表面外侧细胞连接接触区…。在上皮 组织，粘着连接在细胞表面形成一个环形带，构成一 个细胞之间连续的拉链样连接。细胞膜的胞质侧有 一束机动蛋白纤维与粘着带平行，机动蛋白纤维束 通过～个含有连环蛋白（ｃａｔｅｎｉｎ）家族成员的复合蛋 白与Ｅ．ｃａｄ相连。复合蛋白包含ａ．ｃａｔｅｎｌｎ和 ｐｃａｔｅｎｉｎ／－／．ｃａｍｉｎ。／３－ｃａｔｅｎｉｎ和－／．ｅｎｔｅｎｉｎ同源，与 Ｅ—ｃａｄ的Ｃ末端同一特定基序结合，ｑ．ｃａｔｅｎｉｎ将 ［３－ｃａｔｅｎｉｒ戚７一ｃａｔｅｎｉｎ连接到机动蛋白细胞骨架上。 而辟ｃａｔｅｆｌｉｎ其具有调节作用．不参与细胞的连接川。 Ｅ—ｃａ小ｃａｔｅｎｉｎ复合物与细胞动力结构组分相互作用 而形成与细胞骨架的机动蛋白连接。 ｌ钙粘附蛋白Ｅ的作用 Ｅ＜ａｄ是细胞分化、生长和细胞移动的重要控 制因素。在胚胎细胞发展的二胚期既有Ｅ－ｃａｄ的合 成。上皮细胞的细胞与细胞基质（ＥＣＭ）粘着以及 Ｅ．ｃａｄ介导的细胞与细胞粘着是建立细胞极性所必 需的条件，是细胞分化的基础，同时，细胞骨架和信 号传导网络也是通过这些粘着点而建立起来的＿３Ｊ３。 Ｅ—ｃａｄ无效突变体的胚胎细胞不能保持细胞极性和 紧固性，不能形成滋养外胚层上皮细胞，在种植子宫 内膜时死亡。 ．细胞的牯附性和移动性这一对相互依赖的关系 不仅对细胞生长至关重要．而且对保持组织结构正 常和完整也非常重要。破坏Ｅ—ｃａｄ介导的细胞与细 胞间粘连和改变整连蛋白（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）介导的细胞与 细胞外基质作用形式将促进细胞从静止状态到移动 状态的表型变化。在乳腺组织正在出芽的小叶中发 现，Ｅ—ｃａｄ免疫活性降低。当小叶侵入基质时Ｅ－ｃａｄ 会被暂时抑制。在溃疡粘膜上皮再生时电发现这种 情况。提示Ｅ—ｃａｄ—ｃａｔｅｎｉｎ复合物的分解促进细胞失 去粘附性。 Ｅ—ｃａｄ在肿瘤形成、分化、侵袭和转移中发挥重‘ 要作用。免疫组织化学研究显示多种组织的肿瘤出 现Ｅ—ｃａｄ表达下降。这些肿瘤包括胃、肺、乳腺、前 列腺、食管和甲状腺等【…。人们观察到小叶乳腺原 位癌和粘膜内弥漫性胃癌早期既有Ｃ【）Ｈ１突变，提 示Ｅ＿ｃａｄ低表达可能与肿瘤的形成也有关系５Ｉ。 ＣＤＨｌ突变打乱了生长信号传导促进了肿瘤形成。 ０ｗ．日ｔｅｎｉｎ是ｗｍ信号传导通路的转录辅助因子， Ｅ．ｃａｄ能够直接调节／３－ｃａｔｅｎｉｎ游离水平，游离的 阻ｃａｔｅｎｉｒ冰平升高与人类肿瘤形成有关。同时多项 实验发现，Ｅ—ｃａｄ低表达和肿瘤的侵袭、转移和预后 不良有关。分化良好的肿瘤则Ｅ．ｃａｄ下降不明显或 不下降。对恶性肿瘤转染Ｅ．ｃａｄｃＤＮＡ可逆转其侵 袭表型。因此证实Ｅ．ｃａｄ是肿瘤侵袭的抑制因子。 应用抗体和反义ＲＮＡ可以降低Ｅ—ｃａｄ的表达，建立 具有侵袭力的转染细胞。通过转入显性缺失的 Ｅ—ｃａｄ基因抑制该蛋白介导的细胞粘附，诱导肿瘤出 现侵袭和转移。虽然缺失Ｅ－ｃａｄ介导的细胞粘附是 肿瘤生长的限速步骤。然而．缺失Ｅ—ｃａｄ却能通过促 进肿瘤侵袭和转移加快癌症疾病的进展。免疫组化 对肺癌患者淋巴结和远处转移灶的研究显示，Ｅ．ｃａｄ 低表达提示预后不良Ｌ６】。有时低分化恶性肿瘤的 Ｅ．ｃａｄ表达下降是短暂的。虽机制尚不清楚，但Ｅ— ｃａｄ再表达能够增强肿瘤宿主细胞粘附在转移位置 上。另外，原发肿瘤表达不同钙粘附蛋白可能决定 该肿瘤的转移位置。如前列腺癌细胞表达成骨细胞 所表达的ＯＢ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ．ＯＢ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ能够介导前列 腺癌细胞牯附在骨髓上，这就可以解释为什么前列 腺癌易发生骨转移。目前对肺癌的类似研究尚未见 报道。 万方数据
N-Cad，人N钙黏蛋白/神经钙黏蛋白（N-Cad）酶联 检测分析ELISA使用说明书 本试剂仅供研究使用标本：血清或血浆 樊克生物专业供应： 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本N钙黏蛋白/神经钙黏蛋白 （N-Cad）含量。 试验原理： N-Cad试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知N-Cad浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进 行检测。先将N-Cad和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶 结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中N-Cad的浓度呈比例关系。 试剂盒内容及其配制 试剂盒成份（2-8℃保存）96孔配置48孔配置配制 96/48人份酶标板1块板（96T）半块板（48T）即用型 塑料膜板盖1块半块即用型 标准品：80ng/ml 1瓶（0.6ml）1瓶（0.3ml）按说明书进行稀 稀 空白对照1瓶（1.0ml）1瓶（0.5ml）即用型 标准品稀释缓冲液1瓶（5ml）1瓶（2.5ml）即用型 生物素标记的抗N-Cad抗体1瓶（6ml）1瓶（3.0ml）即用型 亲和链酶素-HRP 1瓶（10ml）1瓶（5.0ml）即用型 洗涤缓冲液1瓶（20ml）1瓶（10ml）按说明书进行稀 释 底物A 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 底物B 1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 终止液1瓶（6.0ml）1瓶（3.0ml）即用型 标本稀释液1瓶（12ml）1瓶（6.0ml）即用型 自备材料 1．蒸馏水。 2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。 3．振荡器及磁力搅拌器等。
钙蛋白酶系统研究进展 梅承君1,庞辉2,康相涛1*,孙桂荣1(1.河南农业大学,河南郑州450000;2.河南省公安厅,河南郑州450000)摘要阐述了钙蛋白酶系统的分类、结构,并且综述钙蛋白酶系统的一般生物学功能及影响因素。 关键词钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;钙蛋白酶激活蛋白;嫩度 中图分类号Q55文献标识码A文章编号0517-6611(2006)22-5774-03 Research Adva nce in C alpain System MEI C heng-jun et al(Hen an Agricul tu ral University,Zhen gzh ou,Henan450000) Abstract This paper revie wed th e classi ficati on and structu re of cal pain sys tem,the general biological function and its affecting factors. Key w ords C alp ain;Cal pas tatin;Calpain activator;Tenderness 钙蛋白酶是1964年由Guroff首次发现,1972年Bush等首先在骨骼肌中确认,1976年Da yton等对其进行纯化。钙蛋白酶被鉴定、纯化后,其名称有钙活化中性蛋白酶(Calcium a ctiva te d ne utra l prote ase,Calcium ac tiva ted ne utral SH prote ase, c alpain)简写为CANP(EC,3,4,22,17)、钙激活酶(Ca2+-a ctiva t-ed enzy me)、钙激活中性蛋白酶(Calcium a ctiv ate d ne utral pro-te ase)等。1983年Go ll等提出钙蛋白酶在骨骼肌肌丝蛋白降解过程中起关键作用[1]。目前,已证明它广泛地分布于绝大多数动物的细胞中。在一定浓度的钙离子作用下,钙蛋白酶主要作用于细胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶,还参与细胞内的信号传递[2]。 1钙蛋白酶系统 1.1钙蛋白酶的分类Calpain中的Cal代表钙调蛋白(Ca-l moclulin),pain代表木瓜蛋白酶(Pa pain)。Calpain由钙调蛋白和木瓜蛋白酶两者以非共价键结合而成。钙蛋白酶系由多种同工酶构成。根据分布特点可将其分为组织特异性和非组织特异性蛋白酶两大类[3]。目前研究比较深入的是非组织特异性蛋白酶,已知的2种非组织特异性同工酶是Ca-l pain1和Ca lpain2。Ca lpain1可被L mol水平的钙离子激活,又称L-Calpain;Ca lpain2可被mmol水平的钙离子激活,又称m-Calpain。除活化时需要的钙离子浓度不同和结构略有差别以外,这2种同工酶生化和催化的性质几乎完全相同。红细胞内仅含有Calpain1,其余的哺乳动物细胞中均含有2种形式的钙蛋白酶。由于细胞内钙离子的波动在微摩尔(L mol)浓度水平以下,所以Ca lpain1很可能在正常生理条件下发挥功能,而Calpain2则可能在病理情况(细胞内钙超载条件)下才能激活[4]。 1.2钙蛋白酶系统的结构[5] 1.2.1钙蛋白酶的结构。钙蛋白酶系中L-Calpain和m-Ca-l pain由不均一的二聚体蛋白构成,其大、小亚基的分子量分别为80和30kD。Calpain3、8a、9、11、12和13也都分别由大、小2个亚基构成。大亚基具有催化活性,L-Ca lpain和m-Ca-l pain的大亚基分别由CANP1和CAN P2基因编码;小亚基具有调节功能。尽管L-Calpain和m-Calpain大亚基氨基酸 基金项目国家/8630计划资助项目(2002AA242021);河南省重大科技攻关项目(022*******,0322010600);河南省高校杰出科研人才 创新工程项目(2000KY CX005)。 作者简介梅承君(1979-),女,河南焦作人,硕士研究生,研究方向:家禽育种。*通讯作者。 收稿日期2006-08-09序列有明显差异,但是其高级结构基本相同,都由4个结构域组成,从N端起分别命名为?、ò、ó、?结构域。在大亚基中,结构域?由1~80位氨基酸残基组成,约占全部分子的10%,在蛋白酶激活的情况下很容易发生自溶,由此推测其可能起钙蛋白酶的活性调节作用,L-Calpain和m-Ca lpain仅在结构域?中不同;结构域ò含有81~330位氨基酸残基,约占全部分子的35%,是表现钙蛋白酶水解活性的关键部位,在未被激活的条件下含有2个次级区域[6];结构域ó由331~560位氨基酸残基组成,约占全部分子的35%,其功能为结合钙离子和磷脂,与蛋白酶调控亚基或其他调控蛋白有关;结构域?由561~705位氨基酸残基组成,占全部分子的20%,是结合钙离子的部位,含有4个钙结合蛋白所特有的EF-手型结构(1个EF-手型结构包含2个与钙离子结合环相连的氨基酸螺旋)[7]。L-Ca lpain、m-Calpain、Ca lpain9的小亚基含有2个结构域,这2个结构域由一段富含脯氨酸的序列相连,其中结构域ò与大亚基的结构域?相同,含有4个可以结合钙的EF-手型结构,故也具有结合钙的活性[8]。在其他钙蛋白酶中,如Calpain3、8a、11、12、13,尽管其大亚基也有结构域?,但其大、小亚基之间并没有相互联系。Ca lpain5、6、7、8b、10、15为非典型的钙蛋白酶,其部分结构域缺失或被取代,没有结构域?,因此推测其大、小亚基间也不存在联系。 1.2.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构。钙蛋白酶抑制蛋白(Ca-l pastatin)是细胞内专一抑制钙蛋白酶活性的蛋白质。通过抑制钙蛋白酶活性,可抑制肌肉内蛋白质降解,参与肌肉生长过程中蛋白质的更新。在屠宰后的动物体内,它可抑制钙蛋白酶的活性,从而明显影响肉的嫩度。它可以识别钙蛋白酶与钙结合引起的构象变化,并与之特异性结合。钙蛋白酶抑制蛋白通过抑制钙蛋白酶的自溶作用而发挥作用,且该抑制作用不受pH值的影响。钙蛋白酶抑制蛋白共由5个部分(?、ò、ó、?、?)组成,其中4个是钙蛋白酶抑制蛋白的活性中心。当钙蛋白酶被钙离子激活后,如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在,则将迅速与之结合而抑制蛋白酶活性,从而保证钙蛋白酶对底物只进行局部的特定位点的水解。 目前对钙蛋白酶抑制蛋白的生化性质了解的还不十分清楚。根据钙蛋白酶抑制蛋白在SDS电泳中的行为,可将其分为70和110kD两种类型。70kD类型主要存在于红细胞中,110kD类型存在于肝、心脏和其他组织中。虽然这2种钙蛋白酶抑制蛋白分子大小不同,但它们的功能性质相似。 安徽农业科学,Jou rnal of Anh ui Agri.S ci.2006,34(22):5774-5776责任编辑刘月娟责任校对孙能森
CA4P通过干扰血管内皮细胞钙粘蛋白信号诱导肿瘤血管的急性退化与生长
CA4P通过干扰血管内皮细胞钙粘蛋白信号诱导肿瘤 血管的急性退化与生长 维持肿瘤血管稳定的分子和细胞途径还没有明确定义。微管抑制剂如CA4P的在诱导肿瘤血管特定部位的急性退化上的功效为研究造成血管生成的因素开辟了新途径。在此，我们发现CA4P能够选择性的作用于血管内皮细胞而不作用于平滑肌细胞，通过快速破坏体外和小鼠活体内内皮细胞交接处的特定分子结构——VE钙粘蛋白诱导不稳定新生肿瘤血管的退化。CA4P能够增强内皮细胞的渗透性，同时主要通过VE钙粘蛋白/β-catenin/Akt信号转导途径抑制内皮细胞的迁移和毛细管的形成，从而导致血管快速崩解和肿瘤坏死。值得注意的是，在带有腺病毒E4基因或嵌入平滑肌细胞的内皮细胞中，VE-钙粘蛋白信号途径的稳定对CA4P具有抗性。CA4P通过与无毒、低剂量的中和性单克隆抗体协同，作用于VE-钙粘蛋白阻塞新生血管的装配，从而抑制肿瘤的生长。这些数据表明，微管靶向药物CA4P在一定程度上通过破坏VE-钙粘蛋白信号途径选择的诱导不稳定新生血管的退化。微管靶向药物与抗VE-钙粘蛋白的联合作用为以最低毒性和不破坏正常的稳定血管，选择性的破坏肿瘤血管和不稳定新生肿瘤血管的退化提供了新的协同策略。 引言 肿瘤新生血管的稳定和功能性组装是由多器官特异性细胞和血管生成因子共同控制的。典型的具有强选择性和高效性的血管靶向药物如CA4P对肿瘤血管的抑制性表明，肿瘤新生血管是靠一些尚未确定激活的细胞或分子因素来维持稳定的。 大鼠肿瘤模型中有针对性的基因操作，抗体介导的血管生成抑制的生长因子以及他们的受体已经鉴定了促进血管生成的关键血管生成调控代谢物。中和性单克隆抗体与VEGF-A或它的一个受体VEGFR-2结合，通过络氨酸激酶调节内皮细胞的完整性，诱导肿瘤中不稳定新生血管的退化，从而使肿瘤血管正常化。然而，仍然需要确定哪些血管生成因子保持这些正常血管的稳定性。因此，了解肿瘤靶向药物破坏肿瘤血管的机制为鉴定肿瘤新生血管亚群正常化和
胶原蛋白酶的研究进展三亿文库 设为首页收藏本站 首页考试资料幻灯片工程技术公务员考试小学教学中学教学大学教学外语资料 36胶原蛋白酶的研究进展 胶原蛋白酶的研究进展；摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸；关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素；Abstract:Thenutritionala； Keywords:collagenproteas；胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是；加［4］［1－3］和生物活性等特性，被愈来愈多的；[5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展 胶原蛋白酶的研究进展 摘要：胶原蛋白特有的三股螺旋结构使其难于被人体吸收，将胶原蛋白水解为胶原多肽后，可显著提高其营养及生理功能，胶原蛋白酶是一种价值很高的蛋白酶种。本文介绍了胶原蛋白酶的定义、选择、影响因素。作用机理等，并展望其研究方向。 关键词：胶原蛋白酶，作用机理，影响因素 Abstract: The nutritional and physiological function of collagen protein can be significantly improved via chemical or enzymatichydrolysis，as the collagen protein was difficult to be absorbed by human body due to the triple helical characteristic molecules structure. Collagen protease is a kind of high value of protease. In this paper, introduces the definition of collagen enzyme, selection, influence factors, mechanism etc. The future development direction it was also prospected. Key words: collagen protease, mechanism, influence factors 胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性 加［4］［1 － 3］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、 [5-6]抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一。 胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，三条链相互平行而且由链间氢键相连，具有十分稳定的性质，一般的加工温度及短时间加热都难使其分解，因此难被人体吸收，食用利用率较低[7]。将胶原蛋白水解为胶原多肽后，其营养及生理功能可显著提高：蛋白质消化吸收率几乎达100％，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，对关节炎等胶原病具有很好的预防及治疗作用，能促进钙吸收和降低血清中胆固醇含量等[8]。寻找一种高效的降解胶原蛋白的酶也成为了当今的一个热门课题。 1 胶原蛋白酶的定义和选择 1.1 定义 胶原蛋白酶(Collgaenolytci protease)定义为在适当的pH 和温度下，只切割活性胶原螺旋区或明胶而不作用于其他蛋白底物的酶类 1.2 酶的选择 能使胶原蛋白酶解的酶类较多。按照作用位点可以分为内切酶和外切酶；从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶(如枯草杆菌1.398、放线菌166 等)；此外，较常用于水解的蛋白酶还有风味复合酶等。在实际应用中，酶的选取通常要考虑三个方面：一是酶对胶原蛋白作用的强度；二是酶的价格；三是水解产物的要求。如果酶对胶原的作用太弱，则无法得到高的胶原水解率，而酶的纯度直接影响酶的价格，纯度较高的酶与工业用酶的价格往往相差甚远。因此开发的产品如没有特殊要求，一般可以考虑选择用已完全工业化的酶。除此之