江西农业大学学报2015，37（2）：302－307http：//xuebao．jxau．edu．cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis DOI：10．13836/j．jjau．2015045
闫学艳，何后军，刘宝生，等．健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析［J］．江西农业大学学报，2015，37（2）：302－307．
健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析
闫学艳，何后军，刘宝生，李昆，张锦华*
（江西农业大学动物科技学院，江西南昌330045）
摘要：探讨腹泻对仔猪肠道菌群变化的影响，以健康仔猪和腹泻仔猪新鲜粪便为研究对象，利用传统平板计数的方法和PCＲ-DGGE技术比较了不同日龄健康和腹泻仔猪肠道菌群数量差异和菌群结构变化。结果表明不同日龄的仔猪粪便样品中的细菌总数，乳酸杆菌数腹泻组较健康组均有下降，其中21日龄健康与腹泻仔猪的细菌总数差异极显著，乳酸杆菌数差异显著；DGGE指纹图谱聚类分析表明，与其它日龄组相比21日龄健康组与腹泻组样品肠道总细菌和乳酸杆菌菌群结构均相似度最低。说明仔猪发生腹泻引起的细菌数量变化与菌群结构复杂程度变化可能存在一定的相关性。
关键词：仔猪；腹泻；活菌计数；乳酸杆菌；PCＲ-DGGE；菌群多样性差异
中图分类号：S828．286．4文献标志码：A文章编号：1000－2286（2015）02－0302－06
Diversity Difference Analysis of Intestinal Microflora
between Healthy and Diarrheal Piglets
YAN Xue-yan，HE Hou-jun，LIU Bao-sheng，LI Kun，ZHANG Jin-hua*（College of Animal Science，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330045，China）
Abstract：In order to study the effects of diarrhea on piglet’s intestinal microflora，healthy and diarrheal piglets feces were used as the research objects，the total number of bacteria and lactobacillus were counted by the traditional culture method．The diversity of total bacteria and lactobacillus was compared between healthy and diarrheal piglets by the method of PCＲ-DGGE．Compared to healthy piglets，there was a decrease in the number of total bacteria and lactobacillus at the stadium of21days in pigfarm A of diarrheal piglets．And the difference was significant．From the analysis of DGGE cluster．The similarity of total bacteria and lactobacillus between healthy and diarrhea piglets at the stadium of21days was the lowest．This suggests that maybe there is a certain correlation between the changes of bacteria structure and bacteria number with piglets’diarrhea．
Key words：piglet；diarrhea；live bacteria counts；lactobacillus；PCＲ-DGGE；diversity of microflora
正常仔猪肠道微生物菌群是一个复杂的微生态系统。Kim等2011年研究表明哺乳动物胃肠道菌群总量约为1014个，由500 1000种细菌组成［1］。通过菌群相互作用，使胃肠道这个复杂的微生态系统处于一个相对平衡的状态。正常肠道菌群起着很重要的作用，如肠道的发育、营养消化与吸收、生物拮抗、免疫等作用。动物机体抵抗外界环境不利因素，防止机体造成伤害的第一道防线就是肠黏膜屏障，
收稿日期：2014-05-28修回日期：2014-08-03
基金项目：国家自然科学基金（31460651）、江西省自然科学基金（20122BAB204015）和江西省科技支撑计划项目（20142BBF60001）
作者简介：闫学艳（1984—），女，硕士生，主要从事预防兽医学研究，E-mail：yanxueyansuc@163．com；*通信作者：张锦华，副教授，博士，E-mail：zhjh_1122@163．com。
第2期闫学艳等：健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析若肠道黏膜中的微生物数量和结构发生剧烈变化，使机体内微生物结构失衡，机体将会出现腹泻反应。仔猪腹泻是由多种原因引起的腹泻症状的总称，给养猪业造成了巨大损失，目前己经成为世界性的研究课题。仔猪在受到外界环境影响时，如病原微生物、应激等，肠道菌群结构和数量等易发生改变，加之仔
猪的生理结构、肠黏膜形态结构和功能不健全，体质较差的仔猪就可能肠道菌群失调，发生腹泻［2］。仔
猪发生腹泻时，消化道固有菌群会发生改变，如乳酸杆菌、双歧杆菌数量会降低，大肠杆菌的数量增加，
肠球菌的数量无显著差异［3］。同时有研究表明不同日龄，断奶，以及饮食变化也影响仔猪肠道内菌群
结构变化［4］。本研究利用传统细菌平板计数的方法和PCＲ－DGGE 技术比较了健康和腹泻仔猪肠道菌群数量差异和菌群结构变化，初步探讨腹泻对仔猪肠道菌群变化的影响。
1
材料方法1．1主要试剂、酶及引物
MＲS 肉汤、平板计数琼脂、TEMED 、溶菌酶、
Taq 酶、10?PCＲBuffer 、dNTPs 表1本研究所用引物序列Tab．1
List of DNA oligo nucleotides used in this study 引物
Primer
序列5'－3'Sequence 5'－3'参考文献Ｒeference U968－GC
CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGG CACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC Nübel 等［5］，1996L1401
CGGTGTGTACAAGACCC Bact0027
GTTTGATCCTGGCTCAG Heilig 等［6］，2002Lab0677
CACCGCTACACATGGAG Uni0515－GC
CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGATCGTATTACCGCGGCTGGCA Lab0159GGAAACAGGTGCTAATACCG 依据王迪［7］的方法配制蛋白酶K 溶液，
3mol /L NaAc ，TE ，20%SDS 溶液，1%的琼脂糖凝胶，磷酸盐缓冲溶液，
V （苯酚）?V （氯仿）?V （异戊醇）=25?24?1，EDTA （0．5mol /L ，pH =8．0），50?TAE 储备液，40%丙烯酰胺贮存液，0%变性剂储存液，100%变性剂储存液，10%过硫酸铵，8?固定液，1?固定液，银染液，显影剂。
1．2样品采集
采集7、14、21、28、35日龄健康仔猪和腹泻仔猪新鲜粪便，每个样取两份，一份用于细菌计数，另一
份－20?保存，进行PCＲ－DGGE 总菌菌群多样性及乳酸杆菌菌群多样性分析。
1．3细菌计数
将采集的7、14、21、28、35日龄三份健康仔猪和三份腹泻仔猪新鲜样品，以灭菌的0．85%生理盐水进行
稀释，取4个连续的稀释度，每个稀释度混合物取100μL ，涂布平板计数琼脂平板进行细菌总数计数，涂布MＲS 平板，进行乳酸杆菌计数，每个稀释度设两个重复。涂布完毕，先正置10min ，然后倒置放入培养箱培
养，细菌总数37?，48h 计数，乳酸杆菌烛缸中37?，
24h 计数。计算出每克样品中的细菌数。1．4仔猪肠道总细菌及乳酸杆菌的PCＲ－DGGE 菌群多样性分析方法
将保存于－20?冰箱的粪便样品按日龄，健康，腹泻分类，某日龄健康的和腹泻的粪便样品至少分别提取3份样品的DNA ，并用核酸微量浓度测定仪对提取的DNA 进行浓度测定，并保存于－20?冰箱。
1．5PCＲ扩增与样品DGGE
1．5．1肠道总细菌的16S rDNA 片段PCＲ扩增用带有GC 夹子序列的细菌通用引物（U968-GC 和L1401）对细菌总基因组DNA 的16S rDNA V6-V8区进行PCＲ扩增。PCＲ体系（25μL ）为ddH 2O 17．25μL ，
10?PCＲBuffer 2．5μL ，dNTPs 1．0μL ，上游引物1．0μL ，
下游引物1．0μL ，rTaq DNA 聚合酶0．25μL ，模板DNA 2．0μL ，空白对照不加模板，加2．0μL ddH 2O 。PCＲ反应程序为94?预变性5min ，
94?变性30s ，56?退火20s ，68?延伸40s ，35个循环，最后68?延伸7min 。1%琼脂糖凝胶电泳对PCＲ产物进行检测。
1．5．2乳酸杆菌的16S rDNA 片段套式PCＲ扩增用第一对引物（Bact0027和Lab0677）PCＲ扩增出16S rDNA700bp 左右的片段。PCＲ体系同肠道总细菌的16S rDNA 片段PCＲ扩增，PCＲ反应程序为
·303·
江西农业大学学报第37卷94?预变性5min ，94?变性30s ，66?退火20s ，68?延伸40s ，35个循环，最后68?延伸7min 。
以第一对引物PCＲ扩增出的产物为模板，
Uni0515-GC ，Lab0159为引物PCＲ扩增出16S rDNA 440bp 左右的片段。PCＲ体系（25μL ）为ddH 2O 18．75μL ，
10?PCＲBuffer 2．5μL ，dNTPs 1．0μL ，上游引物1．0μL ，下游引物1．0μL ，rTaq DNA 聚合酶0．25μL ，模板DNA 0．5μL ，空白不加模板，加0．5μL ddH 2O 。PCＲ
反应程序及检测同肠道总细菌的16S rDNA 片段PCＲ扩增。
1．5．3样品DGGE 制备及其指纹图谱分析将两块玻板组装成“三明治”结构，以1．5%琼脂糖封底，配
制高浓度和低浓度胶液，灌胶，胶凝固后，将梳子拔下，将整个“三明治”结构用夹子夹到电泳架上，加样
10μL ，设定温度为60?，电压为85V ，时间设为12h ，启动。电泳完毕，将仪器电源全部关闭，取出电泳架，取下胶片，固定、银染、显色，条带出现后相机拍照。利用Quantity One 软件对不同日龄的健康和腹泻仔猪肠道总细菌及乳酸杆菌DGGE 指纹图谱进行聚类分析。
2
结果分析2．1细菌计数结果
本研究将样品按日龄和健康腹泻分类，计数各培养基上的菌落数，计数结果以3个样品的平均值取
对数表示，结果如图1，并利用等方差t 检验对健康与腹泻仔猪肠道菌群数进行分析，
21日龄细菌总数差异极显著，21日龄乳酸杆菌数差异显著，其它日龄菌数差异均不显著
。
同一个图表中，大写字母不同表示差异极显著（P ＜0．01），小写字母不同表示差异显著（P ＜0．05），不标记表示差异不显著。
In the same figure ，different capital letters mean very significant difference （P ＜0．01），
different small letters mean signif-icant difference （P ＜0．05），no scripts means no significant difference．
图1不同日龄健康和腹泻仔猪肠道细菌总数，乳酸杆菌数的log 值
Fig．1The log value of the number of total bacteria ，lactobacillus of healthy and diarrhea piglets samples at different days
2．2样品中总细菌及乳酸杆菌的16S rDNA PCＲ扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
H ：表示健康仔猪粪便样品，D ：表示腹泻仔猪粪便样品。H is healthy piglet feces sample ，D is diarrheal piglet feces sample．图2不同日龄健康腹泻仔猪肠道菌群DGGE 图谱Fig．2The DGGE fingerprint of bacteria flora of healthy and diarrhea piglets at different days
采用带有GC 夹子序列的细菌通
用引物（U968－GC 和L1401）对微生
物总基因组DNA 的16S rDNA V6－V8
区进行PCＲ扩增，目标片段440bp 。
目标条带大小与预期结果一致，且扩
增的目的片段条带无拖尾和杂带，可
以进行DGGE 。
用套式PCＲ扩增乳酸杆菌属特
异的16S rDNA 片段，先用引物
（Bact0027和Lab0677）首先扩增出大
概700bp 的片段，再用带GC 夹子的
引物（Uni0515－GC 和Lab0159）扩增
出440bp 左右的片段，目标条带大小
与预期结果一致，且扩增的目的片段
条带无拖尾和杂带，可以进行DGGE 。·403·
第2期闫学艳等：健康与腹泻仔猪肠道菌群多样性差异分析2．3健康和腹泻仔猪总细菌及乳酸杆菌16S rDNA DGGE 及分析结果
根据预实验结果确定总细菌DNA 的PCＲ扩增产物DGGE 变性剂的梯度为45% 65%，根据预实验结果确定乳酸杆菌的DGGE 变性剂的梯度为35% 55%。
总细菌DGGE 图谱如图2，图谱中的条带比较丰富。不同日龄的健康和腹泻仔猪肠道菌群的DGGE 聚类分析如图3，表明，健康样品之间的相似性在68% 86%之间；相同日龄的健康和腹泻仔猪样品的相
似性，14日龄最高，达到81%，21日龄最低，为65%
。
图3不同日龄健康腹泻仔猪肠道菌群DGGE 图谱的聚类分析Fig．3The picture of the clustering on DGGE fingerprint of bacteria flora of the healthy and diarrhea piglets at different
days
H 表示健康仔猪粪便样品，D 表示腹泻仔猪粪便样品。H is healthy piglet feces sample ，D is diarrheal piglet feces sample．图4不同日龄健康腹泻仔猪乳酸杆菌的DGGE 图谱Fig．4The lactobacillus DGGE fingerprint of healthy and diarrhea piglets at different
days
图5不同日龄健康腹泻仔猪乳酸杆菌的DGGE 图谱的聚类分析Fig．5The picture of the clustering on DGGE fingerprint of lactobacillus of the healthy and diarrhea piglets at different days
·
503·
江西农业大学学报第37卷
乳酸杆菌DGGE 图谱显示如图4，在条带出现的主要区域内，健康组样品及腹泻组样品中条带数均
在13条左右。由图5聚类分析可知，十组样品的相似性在71% 96%之间，
21日龄的健康与腹泻的样品相似度最低为71%，与其它日龄比，腹泻导致的肠道菌群失调的严重程度比较高。其它日龄健康组与腹泻组菌群相似度都比较高，以28日龄最高为94%。
3讨论与结论
PCＲ－DGGE 方法研究肠道菌群的多样性与传统的体外培养技术相比具有优越性，主要体现在：这种方法不依赖于微生物的分离培养，而是通过直接从样品中提取DNA 进行研究，研究对象既包括了可培养的微生物，也包括了存在但不可培养的微生物，这样可以更全面的反映样品中微生物的组成情况；这种方法与传统的培养技术相比，节省时间，直观，可进行聚类分析。
同时PCＲ－DGGE 方法研究肠道菌群多样性也存在局限性，主要体现在：从样品中提取到的DNA 的质量直接影响DGGE 的结果，微生物种类在除杂质及沉淀DNA 等的过程中容易发生改变，这样会影响DNA 的提取效果［8］，使一些含量比较低的微生物在图谱中无法反映出来；同时不同的DNA 模板可能出现错配，而且扩增效率也不一定相同，还有，图谱反应的情况可能与样品中的微生物的情况有差异；试验操作过程中，如变性剂的范围，电泳的时间以及染色的方法和时间等都可能导致研究结果不准确；一些研究DGGE 图谱中的单一条带常被鉴定为不同的菌，也就是条带存在共迁移现象，将导致估计的样品中的微生物种类数偏低［9］。研究发现［10］16S rDNA 在单个菌株中常常有多个拷贝数，它们之间仅存在微小的差别，用单个菌株的DNA 进行DGGE ，在DGGE 图谱中会出现多个条带，将导致估计的样品中的
微生物种类数偏高，而且只有500bp 以下的DNA 片段才能在含变性剂的丙烯酰胺胶上得到分离［11］，
所以如果片段过大，将得不到很好的分离。
PCＲ-DGGE 技术有优点也有不足，可以通过改进DNA 的提取方法，优化PCＲ条件，优化变性剂梯度范围等方法加以改进，同时可结合其它方法共同研究，使研究结果更可信。
魏华等实验研究表明［12］对HFA 仔猪肠道各段优势细菌PCＲ-
DGGE 与3个类群特异性PCＲ-DGGE 分析结果均提示，盲肠与结肠近端的黏膜黏附菌群组成非常相似。Eckburg 等对3个美国健康成人的盲肠黏膜、横结肠黏膜、升结肠黏膜、乙状结肠黏膜、降结肠黏膜、直肠黏膜以及粪便分别构建16S
rDNA 文库，发现各段黏膜黏附菌的菌群组成差异很小［13］。本试验选择既能反应肠道菌群的真实情况，
又方便易采的新鲜粪便为研究对象，通过传统的平板计数法对不同日龄，健康腹泻样品的细菌总数和乳酸杆菌进行了计数。一般来说，腹泻影响肠道菌群的构成，并且随着腹泻的发展，最终使肠道微生物区系遭到严重破坏［14］。有研究显示，仔猪发生腹泻，仔猪肠道内优势菌群数量会发生改变，如乳酸杆菌、
双歧杆菌数量会降低，大肠杆菌的数量增加，肠球菌的数量无显著差异［15］。何明清等［16］使用传统培养
方法计数下痢仔猪空肠和直肠中菌群数量研究发现，大肠杆菌等需氧菌数量均增加、双歧杆菌等厌氧菌数量均减少。本试验计数结果表明健康组和腹泻组的粪便样品中的细菌总数腹泻组较健康组均有下
降，21日龄的差异极显著，其它日龄组差异不显著。乳酸杆菌数，腹泻组较健康组均有所下降，
21日龄的差异显著，其它日龄差异均不显著。总菌，乳酸杆菌，
21日龄组的差异显著与相关研究［16］一致，差异不显著腹泻组可能处于腹泻早期，还未发生菌群严重失调。
21日龄细菌总数腹泻组较健康组数量减少，且差异极显著，DGGE 指纹图谱分析，与其它日龄组相比21日龄健康与腹泻仔猪样品相似度最低；21日龄乳酸杆菌数腹泻组较健康组数量减少，且差异显
著，DGGE 指纹图谱分析21日龄的健康与腹泻仔猪样品相似度最低，说明仔猪发生腹泻，细菌总数变化与菌群结构复杂程度变化可能存在一定的相关性。谢飞［17］研究表明仔猪腹泻后，粪样菌群的相似性呈
下降趋势，
暗示粪样中的菌群可能发生变化；仔猪粪样中的总细菌、大肠杆菌和乳酸杆菌进行定量分析表明，与健康仔猪相比，腹泻仔猪粪样中的总细菌和乳酸杆菌数量显著下降（P ＜0．05），而大肠杆菌的数量有增多的趋势，但差异不显著。本研究结果与之具有一致性。
·603·
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肠道菌群研究的主要方法 长期以来，为了研究肠道菌群的成员及其功能，科学家们建立和发展了众多技术 手段。经典的微生物学研究方法主要通过对细菌进行纯培养，然后在不同的培养条件下对细菌的生理活性进行研究。而随着分子生物学技术的飞速发展，在对环境中的复 杂微生物群落进行研究时，科学家们越来越多地运用不依赖于培养的方法，全面分析 各种微生物在环境中的活动和对环境的影响。 基于分离培养的方法 在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对 粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格 的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长非常重要。但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。 二．分子生态学研究方法 分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或RNA）为研究 对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基 RNA 基因（细菌中的16S r RNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基 因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌16S r RNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息 量巨大且更新迅速的公开数据库，如Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的16S r RNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位。类似的，为了对肠道菌群中具有特定功能的类群进行检测，研究者们也建立了以功能基因片段为分子标签的分析方法。 常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和末端片段长度多态性（Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP）等。 不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法， 对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的16S r RNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法，已被多次应用于人体肠道菌群的多样性分析，并获得了在物种检测深度和物种鉴定水平上均远远优于DNA 指纹图谱技术的结果 肠道菌群与健康相关研究中的应用
Nature Genetics上的肠道菌群GWAS研究是怎么做的 木子君 肠道菌群与人类健康的密切关系越来越受到重视，已经成为时下最热门的研究方向之一。被称为人类“第二基因组”的肠道菌群除了受到环境、饮食、疾病等因素的影响以外，还在一定程度上受到遗传因素影响，也就是说肠道微生物会受到宿主基因的控制。例如已报道的乳糖编码基因（lactase gene，LCT）与双歧杆菌的关联性(Goodrich, Davenport et al. 2016)。尽管这种概念已被广泛接受，但是基于GWAS的肠道菌群研究还很有限，到底有多少微生物受到宿主基因的影响，以及这种关联如何影响健康和疾病的发生，都非常值得研究。 那么一篇肠道菌群的GWAS研究如何做，怎样才能发到高水平的期刊呢？今天就以2016年发表在Nature Genetics上的一篇文章为例，讲讲肠道菌群的GWAS研究思路。 Genome-wide association analysis identifies variation in vitamin D receptor and other host factors influencing the gut microbiota 本文主要利用1812人样本集进行GWAS研究，发现了一系列影响肠道菌群induvidual bacteria 和β-diversity的SNP。之后针对VDR基因上的SNP为例，研究了该基因影响肠道微生物的机制。 大致可以把这篇文章的思路分为三步： 下面我们看看作者如何一步步有理有据地走下来。 第一步：全基因组关联分析 本文的数据来自两个人群（PopGen和FoCus），共1812个样本有肠道微生物的16S测序以及SNP芯片数据。同时还有性别，年龄，吸烟状况，饮食情况等一些对于肠道微生物有影响的环境因素数据。 1. 前期处理 1.1 协变量 在做关联分析之前，要先确定协变量，校正其他因素对于肠道微生物的影响。经过相关性分析发现年龄，性别，吸烟，饮食等情况对于肠道微生物的影响都是显著的（图1），因此都被纳入关联分析作为协变量。
作者简介：窦会娟（1977-），女，硕士，副教授，从事微生物生态学方面研究，Email：douhj106@163．com 通讯作者：窦会娟·综述· 肠道菌群研究方法进展 窦会娟，郭文涛，王婷婷，李林珂 漯河医学高等专科学校，河南漯河462000 摘要：肠道正常微生物在平衡人体健康和疾病的过程中起着重要作用，如何对肠道菌群的丰度与数量变化进行全面分析是开展肠道微生态研究的瓶颈问题。通过查阅大量资料，总结了当前肠道菌群研究常用的方法及每种方法的优缺点，为进一步深入进行肠道微生态方面的研究提供参考。 关键词：肠道菌群；分离培养技术；基因检测技术；质谱技术 中图分类号：Ｒ378文献标志码：A文章编号：1005-376X（2014）01-0119-03 DOI编码：10．13381/j．cnki．cjm．201401032 Progress on the research technology of intestinal flora DOU Hui-juan，GUO Wen-tao，WANG Ting-ting，LI Lin-ke Luohe Medical College，Luohe462000，China Corresponding author：DOU Hui-juan，Email：douhj106@163．com Abstract：Intestinal microorganisms play an important role in the maintenance of human health and prevention of disease．It is very important to analyze the intestinal flora well for further researches．Based on a number of refer-ence literatures，we summarized most of the methods used in studying the intestinal flora，as well as the advantages and disadvantages of each method，in order to provide useful reference for further studies on gut microflora． Key words：Intestinal flora；Isolation and culture；Genetic testing；Mass spectrometry 人体肠道中的微生物有1000多种，总重量大约为1．0 1．5kg，总数在1014个以上，相当于人体所有组织细胞总数的10倍。肠道正常微生物在平衡人体健康和疾病的过程中起着重要作用［1］，肠道微生物群落及其对人类健康的影响近年来已成为广受关注的热点。肠道菌群分析是进行复杂微生态系分析的基础，如何对肠道菌群丰度与数量变化进行全面分析是开展微生态研究的瓶颈问题。现将肠道菌群研究方法的进展做一综述，方便肠道微生态研究者进行参考。 1基于分离、培养的方法 该方法一般是采用各种选择性培养基培养细菌，将各种细菌分离并根据染色、生化反应及血清学实验等方法对细菌进行鉴定，同时可进行倍比稀释和菌落计数来测定活菌数量。此方法比较成熟，依然被许多进行肠道菌群的研究者采用。例如陈琛等［2］研究了中草药对小鼠肠道的影响，在研究中采用分离培养、生理生化鉴定的的方法鉴定出了小鼠肠道菌群中的乳杆菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球菌。李建婷等［3］采用选择性培养基分离培养细菌，研究了王氏保赤丸对小鼠肠道菌群的影响。O'Keefe等［4］发现7α-去羟化菌在结直肠癌高风险人群肠道菌群中的比例显著高于低风险人群，而植物乳酸杆菌（Lactobacilli plantarum）在高风险人群肠道菌群中的比例则显著低于低风险人群。 对环境中获得的细菌菌株进行培养有助于全面、完整地研究细菌的功能和不同生长条件下的生理活性。例如，Falony等［5］以果寡糖为唯一碳源，将长双歧杆菌株（Bifidobacterium longum）BB536分别与来源于人体肠道的丁酸盐产生菌株Anaerostipes caccae DSM14662和Ｒoseburia intestinalis DSM14610进行共培养，发现了这些细菌之间两种不同的交叉互养（Cross-feeding）模式，作者提示，这些行为的揭示有助于理解肠道微生态系统中各种细菌对营养成分的利用情况和各种细菌之间的互作。但自然界中有90% 99%的微生物用传统方法无法培养出来，因此该方法只能对部分的菌群进行分析，而且耗时。
健康仔猪肠道内抗逆性乳酸菌的选育 邱进杰1,熊 焰1,杨 智2 (1.四川农业大学动物医学院,四川雅安625014;2.四川七环公司良种猪场,四川温江611100) 中图分类号:S852.6 文献标识码:B 文章编号:052926005(2008)0420086201 仔猪腹泻在兽医临床上十分普遍,它严重的影响和制约着仔猪的存活率及养殖者的经济收入。市场上治疗仔猪腹泻的药物很多,但存在药物残留问题。研究开发无毒、无副作用和无残留的益生菌制剂已成为热点课题。1998年美国动物饲粮管理协会(AA FCO)年鉴公布了43种可用作益生素的菌种,其中半数以上是乳酸菌(lactic acid bacite2 ria)[1]。因此,乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重要的角色。本试验的目的是从健康仔猪的新鲜粪便中分离、选育出抗逆性(耐酸、耐胆盐)强的乳酸菌菌株,用于防治仔猪肠道疾病。 1 材料与方法 1.1 样品 健康乳猪新鲜粪便,采自四川多个规模化养猪场。 1.2 培养基 增菌培养基、分离培养基和生化培养基,参见文献[2]配制。 1.3 细菌的分离鉴定 按常规方法进行细菌的分离鉴定[324]。 1.4 耐胆盐试验 取24h乳酸菌新鲜培养物,用灭菌生理盐水作10-4～10-7稀释(选取一适宜的稀释度),用微量加样器吸取0.1mL乳酸菌稀释液均匀涂布于胆盐浓度分别为0%,0.2%,0.3%, 0.4%,0.5%MRS营养琼脂平皿上,于37℃温箱中培养24～48h,进行菌落计数。每个菌株作3个平行。计算存活率。1.5 耐酸试验 将24h乳酸菌培养物按1%(V/V%)接种于p H 2.5的MRS肉汤中,接种后于37℃培养箱中培养。分别在0h和8h,取出适量的培养物用灭菌生理盐水进行梯度稀释至10-3～10-5(选取一适宜的稀释度),用微量加样器吸取0.1mL菌液于MRS营养琼脂平皿上均匀涂布,置入37℃培养箱中培养24～48h,进行菌落计数。每个菌样做3个平行。计算存活率s=h8/h0。 2 结果 2.1 细菌的分离鉴定 本试验分离到5株乳酸菌,编号为6#、7#、9#、19#、22#,根据革兰氏染色镜检和相关生化试验指标,参见《伯杰细菌鉴定手册》[3],最终鉴定为:菌株6#为乳酸乳杆菌,7#为乳链球菌,菌株9#为懒惰乳杆菌,菌株19#为嗜酸乳杆菌,菌株22#为嗜酸乳杆菌。 2.2 耐胆盐试验 菌株6#、7#、19#、22#能耐高达0.3%以上的胆盐,乳酸菌在不同胆盐浓度下的存活率见图1 。 表1 菌株6#、7#、19#、22#在pH2.5的MRS肉汤中培养8h活菌数及存活率菌号时间平皿1活菌数平皿2活菌数平皿3活菌数平均活菌数(h)8h存活率(s=h s/h0) 6#0h 2.7×108 3.0×108 2.2×108 2.6×108167.63% 8h 4.0×108 4.5×108 4.4×108 4.3×108 7#0h8.2×1078.1×1078.1×1078.1×1070.49% 8h 5.0×106 3.0×106 4.0×106 4.0×106 19#0h 2.6×107 2.1×107 2.4×107 2.0×107106.84% 8h 2.5×107 2.4×107 2.6×107 2.5×107 22#0h 3.2×107 3.5×107 3.1×107 3.1×10790.03% 8h 2.7×107 2.7×107 2.9×107 2.8×107 注:菌株6#稀释至10-7,菌株7#、19#、22#稀释至10-5。 收稿日期:2006208210 通讯作者:熊焰,E2mail:xyan2004@hot https://www.doczj.com/doc/8d2657694.html, 2.3 耐酸试验 耐酸结果见表1:菌株6#、7#、19#、22#在p H2.5的MRS肉汤中培养8h,其存活率分别为167.63%、0.49%、106.84%、90.03%。 68中国兽医杂志2008年(第44卷)第4期 Chinese Journal of Veterinary Medicine
仔猪肠道损伤修复营养调控及其机制和应用 1 2 徐子伟 3 （省农业科学院畜牧兽医研究所，310021） 4 摘要：仔猪早期断奶是现代养猪业中的一项重要技术措施，但断奶应激又导致仔猪出现早5 期断奶综合征，尤其是肠道损伤。肠道正常的功能依赖肠道黏膜上皮屏障、免疫屏障、生物6 屏障的完整性来维持。断奶应激会导致仔猪肠道黏膜形态结构改变、肠上皮屏障通透性增加、7 消化吸收功能降低、黏液层厚度下降、肠道pH升高、免疫抑制、肠道微生物菌群失衡等，8 甚至造成肠道功能的继发性损伤和功能紊乱。因此，肠道损伤修复及其营养调控研究日益受9 到关注。直接或间接调控因子主要包括：1）多肽类生长因子。主要包括表皮生长因子（EGF）、10 胰高血糖素样肽-2（GLP-2）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和转化生长因子（TGF）等。 11 本文介绍了本团队制备的pGLP-2长效化产物对降低仔猪肠道炎性反应，提高黏膜屏障功能12 的作用。2）微生态调控剂。包括益生菌制剂和抗菌肽。猪饲粮中常用益生菌有屎肠球菌、芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳球菌、酵母菌等。已报道用于仔猪饲粮的抗菌肽主要有天蚕素、 13 14 防御素、抗菌肽buforin Ⅱ、抗菌肽P5及复合肽等。3）营养代调控剂。报道较多的氨基酸15 及其衍生物有谷氨酰胺及其替代品α-酮戊二酸、L-精氨酸、N-乙酰半胱氨酸等。研究较多的16 其他调控剂还有短链脂肪酸、壳聚糖、植物多糖、锌和硒等。本文对上述各类损伤修复调控17 因子研究进展进行了综述。 18 关键词：断奶仔猪；肠道；损伤修复；多肽类生长因子；微生态调控剂；营养代调控剂 中图分类号：S 文献标识码：A 文章编号： 19 20 在现代养猪业中，仔猪早期断奶是提高母猪年生产力和减少母-仔猪疾病传播的技术措21 施。但断奶应激则又导致仔猪出现早期断奶综合征，首当其冲的是仔猪肠道损伤。因此，肠道损伤修复及其营养调控研究日益受到关注。肠道正常的功能依赖肠道黏膜上皮屏障、免疫 22 23 屏障、生物屏障这三大屏障的完整性来维持。断奶应激会导致仔猪肠道屏障功能受损，表现24 为仔猪肠道黏膜形态结构改变、肠上皮屏障通透性增加、免疫抑制、肠道微生物菌群失衡等。 25 直接或间接调控仔猪肠道营养、生长发育与促进肠道损伤修复的因子种类繁多，主要包括多26 肽类生长因子、微生态调控制剂和营养代调节剂等。本文在分析仔猪断奶导致的肠道损伤问27 题基础上，对相关的各类损伤修复调控因子研究进展进行综述。
肠道菌群领域研究进展（完整版） 已有大量研究证实，肠道菌群与肥胖、糖尿病、高脂血症、高血压、心脑血管疾病、慢性肾病、神经系统疾病等相关，肠道菌群科学家们2019年在肠道微生物组研究领域取得了研究成果； 【1】Nat Biotechnol：突破！科学家在人类肠道微生物组中鉴别出100多种新型肠道菌群！ 近日，一项刊登在国际杂志Nature Biotechnology上的研究报告中，来自英国桑格研究院等机构的科学家们通过对肠道微生物组研究，从健康人群的肠道中分离出了100多个全新的细菌类型，这是迄今为止研究人员对人类肠道菌群进行的最全面的收集研究，相关研究结果获奖帮助研究人员调查肠道微生物组在人类机体健康及疾病发生过程中所扮演的关键角色。 本文研究结果能帮助研究人员快速准确地检测人类肠道中存在的细菌类型，同时还能帮助开发出治疗多种人类疾病的新型疗法，比如胃肠道疾病、感染和免疫疾病等。人类机体中细菌大约占到了2%的体重，肠道微生物组就是一个主要的细菌聚集位点，同时其对人类健康非常重要。肠道微生物组的失衡会诱发诸如炎性肠病等多种疾病的发生，然而由于很多肠道菌群难以在实验室环境下生存，因此研究人员就无法对其进行更加直观地研究。
【2】Science：肠道微生物组可能是药物出现毒副作用的罪魁祸首 药物本是用于治疗很多患者，但是一些患者遭受这些药物的毒副作用。在一项新的研究中，来自美国耶鲁大学的研究人员给出了一种令人吃惊的解释---肠道微生物组（gut microbiome）。他们描述了肠道中的细菌如何能够将三种药物转化为有害的化合物，相关研究结果发表在Science期刊上。 研究者表示，如果我们能够了解肠道微生物组对药物代谢的贡献，那么我们能够决定给患者提供哪些药物，或者甚至改变肠道微生物组，这样患者具有更好的反应。在这项新的研究中，研究人员研究了一种抗病毒药物，它的分解产物可引起严重的毒副反应，并确定了肠道细菌如何将这种药物转化为有害的化合物。他们随后将这种药物给予携带着经基因改造后缺乏这种药物转化能力的细菌的小鼠，并测量了这种毒性化合物的水平。利用这些数据，他们开发出一种数学模型，并成功地预测了肠道细菌在对第二种抗病毒药物和氯哌嗪（一种抵抗癫痫和焦虑的药物）进行代谢中的作用。 【3】Nat Med：肠道微生物组的改变或与结直肠癌发生密切相关肠道中“居住”着很多不同的微生物群落，即肠道微生物组，其与人类健康和疾病息息相关，近来有研究表明，评估粪便样本中的遗传改变或能准确反映肠道微生物组的状况，或有望帮助诊断人类多种疾病。近日，一项刊登在国际杂志Nature Medicine上的研究报告中，来自
断奶仔猪营养需要特点及饲养管理 姓名：宁椿游班级：动科10—2 学号：20100884 摘要：仔猪生产是养猪业生产过程中一个非常重要的环节，直接关系到猪场的经济效益。而断奶仔猪从开始接触外加固体饲粮而停止母乳，且生活环境的改变，造成应激反应，会引起仔猪烦躁不安，食欲不振，生长发育停滞，形成僵猪，严重时可导致仔猪的死亡。因此，必须重视断奶仔猪的营养需要和饲养管理的特点，以提高仔猪的成活率。 关键词：断奶仔猪应激营养需要管理 断奶仔猪是指仔猪从断奶至70日龄左右的仔猪。在国内，仔猪一般采用21~28日龄断奶，有些发达国家采用超早期隔离断奶技术，14日龄即可断奶，这样可有效控制疾病发生。但是，仔猪断奶太早，会产生断奶应激反应，严重影响其生长速度，所以控制好断奶仔猪时间，把握保育期间仔猪的营养需求特点，维持哺乳期内的生活环境和饲料条件，做好饲料、环境和管理制度的过渡，为提供优质生长育肥猪打下基础。 1断奶仔猪的应激反应 仔猪断奶时，从摄食母乳到开始摄食饲粮，其消化道面临着巨大的改变。母乳中，以母乳脂肪、乳糖和乳蛋白为主，而饲粮中含有不同程度抗原特性的植物性蛋白质、分子结构迥异的植物性多糖与脂类养分，从吮吸母乳(液体)到采食配合饲料(固体)，从与母亲一同生活到离开母亲独立生活，从保育舍转到仔猪培育舍，所有这些都从心理、营养、环境多方面刺激仔猪，导致断奶应激。具体表现为：仔猪食欲降低、消化功能紊乱、腹泻、生长缓慢、饲料利用率低、精神状况以及外貌表现不佳等。营养应激是导致仔猪断奶应激的主要因素。要克服断奶应激，使早期断奶取得成功，首先要解决营养应激问题。研究仔猪的消化生理是进行营养研究的基础，也是探讨通过营养调控措施来减缓与消除仔猪的断奶应激的重要基础。 2 断奶日龄及方法 2.1 断奶日龄 最适宜的断奶日龄应该是每头仔猪生产成本最低，因猪场具体生产条件而异。一般成产条件下采用21～35d断奶比较合适，21d后母猪子宫恢复已经结束，创造了
肠道菌群失调症的研究进展 王晓华1a,夏文涵1b,王晓刚2,黄广萍2 (1.南昌市卫生学校a.免疫及微生物教研组; b.解剖教研组,南昌330006; 2.南昌市第一医院检验科,南昌330008) 关键词:肠道菌群;肠道菌群失调症;研究进展 中图分类号:R446.5 文献标识码:A 文章编号:1009-8194(2007)08-0136-03 健康人群的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物,这些微生物被统称为肠道菌群[1]。种类不同的肠道菌群按一定的比例组合,各菌间互相拮抗,互相协同,在质和量上形成一种动态生物平衡,一般情况下,肠道菌群与人体和外部环境保持着一个平衡状态,对人体的健康起着重要作用。但在某些情况下,这种平衡可被打破形成肠道菌群失调,引发疾病或者加重病情,引起并发症甚至发生多器官功能障碍综合征和多器官功能衰竭[2]。这种由于敏感肠菌被抑制,未被抑制的细菌便乘机繁殖,从而引起菌群失调,导致其正常生理组合被破坏,产生病理性组合,引起临床症状就称为肠道菌群失调症[3](alteration of intestina flor a)。近年来因肠道菌群失调而导致临床发病的机率约为2%~3%。为更好的预防和治疗因肠道菌群失调而致的不良后果,本文针对肠道菌群的特点与机能、肠道菌群失调症病因病理学改变、分类、检查、治疗和预后等相关研究作如下综述。 1 肠道菌群特点 肠道内的细菌是一个巨大而复杂的生态系统,一个人的结肠内就有400个以上的菌种,从口腔进入胃的细菌绝大多数被胃酸消灭,剩下的主要是革兰阳性需氧菌[4],胃内细菌浓度<103 10-3CF U/L(CFU:colony form ing unit菌落形成单位)。小肠菌的构成则介于胃和结肠之间。学者们为了将研究更为细致化,按照Dubos法将主要菌种如类杆菌属,双歧菌属和真杆菌属等根据其存在模式分成三大类:(1)与宿主共生状态的原住菌(autochlho no us m icrobio ta);(2)普遍存在于某种环境的普通菌(nor mal m icrobito ta);(3)偶然进入宿主的病原菌(pathog ens)。依照肠道菌群所持有合成维生素,协助营养素的消化和吸收,产生糖皮质激素作用增强因子,产生过氧化氢、硫化氢及其各种酸、抗生素等物质并结合其对宿主免疫机能的影响力,在机体感染防御中起积极作用这一生理学机能,我们不难理解肠道菌群具有相互影响的特点,任何打破其内外环境的举措都可导致菌群的失调。 2 肠道菌群失调症的发病机制 2.1 病因学 1) 饮食因素:运用测定细菌酶类的方法研究菌丛代谢活性的结果表明,饮食可使粪便菌丛发生明显改变。无纤维食物能促进细菌易位。G unffip等[5]用大鼠作试验研究,结果表明食物纤维能维持肠道菌群正常生态平衡,且细菌代谢纤维的终产物对小肠上皮有营养作用,纤维能维持肠黏膜细胞的正常代谢和细胞动力学。M acF ie[6]报道加入纤维的低渣饮食对保存肠的结构和功能有好的效果,纤维的保护作用是否通过直接刺激肠黏膜或诱导释放营养性胃肠激素尚不清楚。食物纤维能减少细菌易位,但不能使屏障功能恢复至正常。 2) 菌丛的变化因素:菌丛组成可因个体不同而存在差异,但对同一个人来说,在相当长的时期内菌丛组成十分稳定。每个菌种的生态学地位由宿主的生理状态、细菌间的相互作用和环境的影响所确定[7]。在平衡状态下,所有的生态学地位都被占据。细菌的暂时栖生可使生态平衡发生改变。 3) 药物的代谢因素:肠道菌丛在许多药物的代谢中起重要作用[8],包括乳果糖、水杨酸偶氮磺胺吡啶、左旋多巴等。任何抗生素都可导致结肠菌丛的改变,其取决于药物的抗菌谱及其在肠腔内的浓度。氯林可霉素和氨苄青霉素可造成大肠内生态学真空状态,使艰难梭菌增殖。应用甲氰咪胍等H2 受体拮抗剂可导致药物性低胃酸和胃内细菌增殖。 4) 年龄因素[9]:随着年龄的增高,肠道菌群的平衡可发生改变,双歧菌减少,产气荚膜梭菌增加,前者有可能减弱对免疫机能的刺激,后者导致毒素增加使免疫受到抑制。老年人如能维持年青时的肠道菌群平衡,也许能够提高免疫能力。 5) 胃肠道免疫功能障碍因素[10]:胃肠道正常免疫功能来自黏膜固有层的浆细胞,浆细胞能产生大量的免疫球蛋白,即分泌型IgA,此为胃肠道防止细菌侵入的主要物质。一旦胃肠道黏膜合成单体,或双体Ig A,或合成分泌片功能发生障碍,致使胃肠道分泌液中缺乏分泌型Ig A,则可引起小肠内需氧菌与厌氧菌过度繁殖,从而造成菌群失调,引起慢性腹泻。无症状的Ig A缺乏者,小肠内菌群亦可过度繁殖。新生儿期菌群失调发生率较高,亦可能与免疫系统发育未成熟或不完善有关。 2.2 病理改变 1) 细菌生长过盛:胃肠道的解剖和生理学异常会导致近段小肠内结肠型丛增殖,而出现各种代谢紊乱[11],包括脂肪泻,维生素缺乏和碳水化合物吸收不良。并可伴发生于小 收稿日期:2007-06-04
益生元与肠道菌群 摘要： 益生菌是一类对人体健康有益的活菌，它与人体健康密切相关。而益生元是有益细菌的食物，可以促进一些有益菌的生长与活性，从而改善人体肠道健康。是肠道有益菌的能量来源，肠道疾病在我国的发病率逐年上升，临床研究表明此类患者的肠道内存在着严重的菌群失调，通过给予益生菌对局部的微生态环境进行调节，可缓解病情。益生菌是一类消化时能对宿主的健康和生理功能产生积极影响的非病原微生物。该文就有关益生菌与肠道疾病的研究作一综述。 肠道菌群是构筑肠道粘膜屏障的主要组成部分，在维持肠道功能及机体的健康方面发挥着重要的生理意义。胃肠功能的紊乱，包括菌群失调、便秘、及胃粘膜的损伤是临床常见的药物并发症，也是现代生活模式下发病率高、患病人群范围较广的一类疾病。乳酸杆菌和双歧杆菌是肠道有益菌的主体，是肠道生物屏障的重要组成部分，与胃肠道的免疫、营养及正常功能的维持紧密相关。微生态学运用“以菌治菌”的理论，通过生物拮抗纠正微生态失衡，是治疗医学和预防医学的重要补充，是一种全新的治疗观念，不仅可以避免上述抗生素应用的副作用，而且在临床实践上的初步研究中已收到了十分肯定的疗效，具有极大的发展潜力，可以成为防治肠源性感染的新措施。而目前国内已有的微生态制剂多存在配方单一及功效不稳定等问题，限制了微生态制剂的应用和发展。因此，本研究拟筛选一株性能良好的乳酸杆菌，与益生元合理配伍，组成合生元配方，通过动物试验验证其对胃肠道的调节作用，包括对肠道菌群的调节作用，润肠通便作用及对胃粘膜损伤的辅助保护作用；并采用先进的冷冻干燥工艺将其制成一种性能稳定的新型微生态制剂，使其充分发挥对胃肠道的调节作用。 近年来随着人们生活水平的上升，饮食结构的变化，肠道疾病在我国的发病率逐年上升。益生菌是一类消化时能对宿主的健康和生理功能产生积极影响的非病原微生物。他们由酵母菌和细菌，特别是乳酸菌组成，其在肠道的命运及作用因菌株而异。益生菌的作用可直接或间接的通过调节内源性菌群或免疫系统来实现。虽然益生菌的使用对其他疾病也有减轻作用，但通常被用来治疗与胃肠相关的疾病。尽管如此，只有少数益生菌菌株在随机抽样、安慰剂做对照的临床试验中被认为是有益生作用的。 益生菌治疗人类肠胃疾病。例如急性胃肠炎、乳糖不耐症、炎症性肠疾、抗生素性腹泻、便秘、旅行者腹泻、结肠直肠癌等。本文就目前益生菌在治疗人类胃肠疾病中的应用效果，以几个病例的实践应用效果综述如下。 急性胃肠炎：可由细菌或病毒引起。在工业国家，轮状病毒是引起小儿急性腹泻最常见的病原之一，轮状病毒侵入小肠上皮柱状细胞并在其中复制，使微绒毛损失，绒毛/滤泡比例下降，肠渗透性增加，从而导致肠黏膜损伤。用一定的益生菌治疗时，会使轮状病毒特异性IgA产生量增加，肠粘膜渗透减少，肠道菌群的组成恢复正常。益生菌在人类细菌性腹泻中的保护作用如何，资料还不充足，自相矛盾的结论在动物身上时有报道。在家兔模型中，用E.coli肠毒素诱导腹泻，之后在感染的回肠绊处接种含乳酸杆菌的制品，结果表现出明显的抗毒素应答。手术后患急性腹痛的马给予益生菌以预防沙门菌的扩散及腹泻，但未成功。总之，虽然细菌疗法的效果在不同动物和细胞培养模型中有所报道，但人类细菌性腹泻的细菌疗法效果如何，还是值得
2016这一年，有关肠道菌群相关研究精华一览（TOP 10） 2016这一年，三大期刊Nature、Science和Cell纷纷发表肠道微生物组方面的重磅研究文章，这些文章从不同的角度揭示了肠道微生物组在人类健康和疾病中发挥着至关重要的作用。本文中小编盘点了近年来肠道微生物相关研究报道。 【1】Nature：肠道微生物竟是这样在幕后操纵我们的胖瘦的 6月9日，顶级期刊《自然》杂志刊登了耶鲁大学医学院Gerald I Shulman教授团队的研究论文(3)，他们的发现几近完美地解释了「肠道菌群究竟是如何引起肥胖的？」这一困扰学界多年的问题。 Shulman教授并不是偶然发现了这个秘密，早在2006年，由微生物领域大牛Jeffrey I. Gordon教授领衔的研究已经表明(4)，肠道微生物是肥胖的一个重要致病因素，尤其是微生物产生的某些短链脂肪酸可能是罪魁祸首。后来，越来越多的研究表明，短链脂肪酸与多食、肥胖和代谢综合症之间存在关联。但是研究人员一直不清楚短链脂肪酸究竟是如何导致肥胖的。 Shulman教授在前人的基础上，对那些短链脂肪酸展开了研究，最终发现醋酸盐（acetate）是导致肥胖的关键所在。
经过在小鼠体内复杂地探索与反复地验证，Shulman教授以小鼠为模型，帮我们还原了肠道微生物失衡引起啮齿动物肥胖的全过程。（梅斯医学公众号首页回复“ Nature：肠道微生物竟是这样在幕后操纵我们的胖瘦的”，即可查看详细内容）【2】Science：华人科学家揭示肠道微生物不会感染人体自身的机制 来自爱丁堡大学MRC炎症研究中心的科学家们揭示出了，免疫系统阻止我们肠道中的细菌渗入血液中引起败血症一 类全身性炎症的机制。并帮助解释了尽管在我们的肠道中自然存在大量的细菌，我们却不会遭受更多感染的原因。研究发现有可能会改善对危及生命的感染的治疗和预防。他们的论文发布在《科学》（Science）杂志上。 这些研究结果有可能促使开发出一些新方法来阻止全身感染——如果不能早期控制它们可以危及生命。这些称作为败血症或脓毒症的感染是危重患者的最大杀手之一。 爱丁堡大学MRC炎症研究中心的姚成灿（Chengcan Yao，音译）说：“肠道屏障损伤可以导致往往致命的疾病——败血症，它是危重病人最大的杀手之一。我们的研究揭示了可以用来帮助阻止败血症常见原因之一的一种新治疗方法。PGE2是前列腺素分子家族的一个成员，常用抗炎药物包括阿司匹林（aspirin）和布洛芬（ibuprofen）可以阻断前列腺素分子。这些药物是否会带来全身性炎症的风险，值得评估。
肠道菌群研究方案设计汇总 研究菌群与疾病，从整体上看，无外乎三种模式：关联关系探究、因果关系探究和应用菌群干预疾病的研究。其实这三点即独立也相互关联。 一、疾病与菌群关联关系类研究 ①特征菌群类研究 此类研究目的主要是客观地描述人体菌群组成的特征，解释某种疾病或现象与其共生菌群的关系。 研究思路： 此类研究方法相对比较简单，设立疾病组和健康组，通过大样本量对比研究，确定特定人群的特征微生物组成。目前此类文章已经发表了很多很多，几乎各种疾病与肠道菌群的关系都有涉及，如今想发高分文章，选题角度一定要新颖，而且一般需要的样本量较大，最好能再结合代谢组学等其他组学做多组学关联分析，在找到差异菌群的同时，对差异的代谢通路进行关联分析，这样文章相对比较容易上档次。 ②菌群影响因素类研究 影响肠道菌群的因素有很多：遗传、生活方式、饮食习惯、运动、生活环境等都是影响肠道菌群平衡的重要原因。 例如：对新生婴儿菌群组成影响因素的研究，比如分娩方式、孕期饮食、喂养方式（母乳、提前添加辅食、配方奶粉）、早产儿等，研究对婴儿肠道菌群影响的因素，对后续指导和维护婴儿健康有重要的作用。
二、疾病与菌群因果关系类研究 ①细菌功能验证及疾病机理研究 潜在致病菌或有益菌的功能验证及疾病机理研究思路： 1.确定一种或几种目标菌，利用动物实验对该菌进行验证，通过分析临床理化指标，探讨该菌与疾病的关系。 2.收集处理后动物模型粪便样本，测序，探讨该菌如何影响肠道菌群致病或改善疾病； 3.结合临床指标、理化结果、微生物结果，综合分析作用机制。 ②疾病的发生发展与菌群相关性研究 研究思路：
三、菌群干预类研究 肠道菌群研究常用的干预手段： 研究思路： 1.研究治疗手段（不同药物干预、同药物不同剂量干预、干预不同天数、益生菌、粪菌移植等）对疾病的治疗效果（临床指标、理化指标等）。基于临床指标判断治疗效果。 2.比较疾病组、疾病干预组、及健康对照组微生物组成的差异 3.验证治疗手段是否是通过改变菌群后治疗效果 至于具体的研究方法，其实现在研究肠道菌群的方法无外乎16S rRNA 测序/宏基因组学测序+代谢组学，可以说这是目前最流行的做法了。代谢组学相对更接近表型，基因测序与代谢组学的结合，能够更全面的阐述深层次的机制问题。
2019年4月第27卷一第2期中国实验动物学报ACTA LABORATORIUM ANIMALIS SCIENTIA SINICA April 2019Vol.27一No.2黄树武,闵凡贵,王静,等.常见SPF 级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究[J].中国实验动物学报,2019,27(2):229-235.Huang SW,Min FG,Wang J,et al.Diversity of intestinal flora in commonly used SPF mice and rats [J].Acta Lab Anim Sci Sin,2019,27(2):229-235.Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2019.02.016 [基金项目]广东省科技计划项目(2016A030303024,2017B030314171,2017A070702001,2018B030317001)三 Funded by Science and Technology Planning Project of Guangdong Province (2016A030303024,2017B030314171,2017A070702001, 2018B030317001).[作者简介]黄树武(1990 ),男,医学学士,研究方向:实验动物质量监测和微生物学研究三Email:hsw2015@https://www.doczj.com/doc/8d2657694.html, [通信作者]潘金春(1979 ),男,副研究员,研究方向:实验动物质量监测和比较医学研究三Email:jcpan@https://www.doczj.com/doc/8d2657694.html, 常见SPF 级小鼠和大鼠肠道菌群多样性研究 黄树武,闵凡贵,王静,潘金春? (广东省实验动物监测所,广东省实验动物重点实验室广东广州一510663)一一?摘要?一目的一研究常见SPF 级小鼠和大鼠的肠道菌群多样性三方法一分别采集广东地区三家实验动物生产单位的C57BL /6二ICR二BALB /c 小鼠和Wistar二SD 大鼠的盲肠内容物样品,用细菌16S rDNA 通用引物扩增V4-V5 区域,采用Illumina Miseq 2?300bp 测序平台进行测序,使用生物信息学方法进行微生物群落分析二Alpha 多样性分析与Beta 多样性分析三结果一对序列去杂优化后OTU 聚类分析,稀释性曲线说明本次测序的数据量合理;实验小鼠和大鼠肠道菌群共分成八个门,其中拟杆菌门(Bacteroidetes )二厚壁菌门(Firmicutes )占据主要地位,属水平上主要是拟杆菌属(Bacteroides )二Hungatella 二副杆状菌属(Parabacteroides )二乳酸杆菌属(Lactobacillus )等;样品间差异性分析显示相同设施来源动物的菌群组成相似性较高;Alpha 分析结果显示来源于同种设施的动物物种丰富度相近;Beta 分析显示相同设施动物的肠道菌群差异较小,但品系对肠道菌群差异性有所影响三结论一不同来源设施的饲养环境是动物肠道菌群多样性的主要影响因素,不同品系对肠道菌群多样性有一定影响三 ?关键词?一小鼠;大鼠;肠道菌群;Illumina miseq ?中图分类号?Q95-33一一?文献标识码?A一一?文章编号?1005-4847(2019)02-0229-07Diversity of intestinal flora in commonly used SPF mice and rats HUANG Shuwu,MIN Fangui,WANG Jing,PAN Jinchun ?(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute,Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663,China)Corresponding author:PAN Jinchun.E-mail:jcpan@https://www.doczj.com/doc/8d2657694.html, ?Abstract ?一Objective 一To study the diversity of intestinal flora in commonly used SPF mice and rats.Methods The cecum contents of C57BL /6,ICR,BALB /c mice as well as Wistar and SD rats were collected from three experimental animal production units in the Guangdong area.The V4-V5region was amplified using 16S rDNA primers and sequenced by the Illumina Miseq 2x 300bp sequencing platform.Microbial community analysis,alpha diversity analysis,and beta diversity analysis were carried out by bioinformatics.Results 一In OTU cluster analysis after sequence removal optimization,the dilution curve indicated that the data quantity of the sequencing was reasonable.The intestinal microflora of mice and rats were divided into eight phyla.Bacteroidetes and Firmicute phyla occupied the main position,mainly in the level of Bacteroides ,followed by the genuses Hungatella and Parabacteroides and then Lactobacillus.Analysis of the differences among the samples showed that the flora composition of animals from the same facility,and that of the same strains from the same facility was also similar.Alpha analysis showed that the species richness was similar in animals from the same facility,and beta analysis showed little difference in intestinal flora of the same origin animals.Moreover,the strain had an effect on the difference of intestinal flora.Conclusions 一The origin is the main factor influencing the diversity of intestinal flora,and
转自《生物学通报》2004年第39卷第3期，26页。 肠道菌群与疾病 尹军霞 (绍兴文理学院生物学系浙江绍兴312000) 林德荣 (绍兴第二医院肿瘤科浙江绍兴312000) 摘要：一般情况下，肠道茵群与人体和外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作用，但在某些情况下，这种平衡可被打破，形成肠道茵群失调，引发疾病或者加重病情，引起并发症甚至发生多器官功能障碍综合症或多器官功能衰竭。本文对肠道菌群在种类、数量、比例、定位和疾病的关系以及调整肠道菌群失调的措施作了简单的介绍。 1 肠道菌群一般介绍 刚出生的婴儿由于在子宫内是处于无菌的环境．所以肠道内是无菌的，出生后，细菌迅速从口及肛门侵人，2 h左右，其肠道内很快有肠球菌、链球菌和葡萄球菌等需氧菌植入，以后随着饮食，肠道就有了更多的不同菌群进驻，3 d后细菌数量接近高峰…。而一个健康成人胃肠道细菌大约有1014个，由30属、500种组成，包括需氧、兼性厌氧菌和厌氧菌。从来源上看，有常住菌和过路菌两种，前者是并非由口摄入，在肠道内保持稳定的群体；而后者则由口摄入并经胃肠道。常住菌是使过路菌不能定植的一个因素。 人体胃肠道各部位定植的细菌的数量和种类不同：胃内酸度高，含大量消化酶，不适合细菌成长，所以胃内菌数量很少，总菌数0～103个，主要是一些需氧抗酸性细菌，如链球菌、乳杆菌等。而小肠是个过渡区，虽然pH值稍偏碱，但含有消化酶，蠕动强烈，肠液流量大，足以将细菌在繁殖前冲洗到远端回肠和结肠。所以，小肠菌量在胃和结肠之间逐渐增多；空肠菌数105个，仍以需氧菌为主；回肠菌较多，总菌数103-107个，以厌氧菌为主，如拟杆菌、双歧杆菌等；结肠内菌量最多达1011-1012个，厌氧菌占绝对优势，占98％以上，菌种也达300多种，干大便的重量近1／3是由细菌组成。 同一肠道，不同类菌的空间分布也不相同。总的来说，人体肠道菌群在肠腔内形成3个生物层：深层的紧贴粘膜表面并与粘膜上皮细胞粘连形成细菌生物膜的菌群称为膜菌群，主要由双歧杆菌和乳酸杆菌组成，这两类菌是肠共生菌，是肠道菌中最具生理意义的两种细菌，对机体有益无害；中层为粪杆菌、消化链球菌、韦荣球菌和优杆菌等厌氧菌；表层的细菌可游动称为腔菌群，主要是大肠杆菌、肠球菌等好氧和兼性好氧菌…。 肠道菌群的种类和数量只是相对稳定的，它们受饮食、生活习惯、地理环境、年龄及卫生条件的影响而变动。 正常情况下，肠道菌群、宿主和外部环境建立起一个动态的生态平衡，对人体的健康起着重要作用。 1．1 防御病原体的侵犯 1)直接作用