1.细胞培养：用酶消化法讲组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适
宜的条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。
2.BSS溶液：平衡盐溶液，是人工合成培养基的基础成分，也常用来洗涤组织细胞，其主
要成分是无机盐和葡萄糖，无机盐构成细胞的生命成分，维持细胞渗透压既其生存环境的稳定。葡萄糖供给细胞生存所需的能量。其中含少量酚红作为溶液酸碱度的指示剂。
Hank’s液是常用的BSS液。
3.原代细胞培养：又称为初代细胞培养，从机体去的材料（细胞、组织或器官），在培养
瓶内培养到第一次传代前。
4.传代培养或传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。
5.组织块培养法：将组织块剪切成小块，直接送入培养瓶（皿）中，贴附一段时间后，细
胞从组织块长出，最终形成单层细胞。
6.细胞系：原代细胞首次传代成功后即可成为细胞系
7.细胞株：通过筛选或克隆化，且有特殊性质或特异标记的细胞，这些特性在以后的培养
中必须存在。这些特性包括：具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性，以及具有特殊的抗原性等。
8.接触抑制：当一个细胞被其他细胞阻挡而无去处时就停止移动，接触区域的细胞膜皱褶
样活动停止，这样保证了细胞不会重叠生长。
9.密度抑制：正常细胞生长汇合成单层时，细胞密度达到一定程度时，细胞即停止分裂的
现象。
10.合成培养基（synthetic medium）是通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸
馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究
11.有丝分裂指数：mitotic index一个细胞群体中正在进行有丝分裂的细胞的百分数。
12.悬浮培养：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培
养方法。细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
二、细胞培养技术的优缺点？
优点：1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态结构、生命活动
2.可控制：选择对象、性质、调节条件。
3. 应用广，学科多：对象广。各种动物：低等动物--高等动物--人类一种动物：不
同年龄不同组织: 正常或异常（肿瘤）
4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象
5. 不易污染环境
缺点：1. 现人工无法完全模拟体内环境a. 失去彼邻关系b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响
2. 细胞趋向单一化
3.失去原有组织结构和细胞形态
4.分化减弱或不显要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
5. 某些类型细胞还很难培养
6.大规模培养难度大
三、体外细胞培养的方式及特点？
1、粘附型培养: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。粘附是大多数有机体细
胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式
2、悬浮型培养: 不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。来源: 来
自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团优点: 生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获可获得稳定状态.缺点:观察不方便, 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
四、体外培养细胞的生长形态分类？
主要2类：上皮样、成纤维细胞样、其它不定型
上皮样细胞型。来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
成纤维细胞样细胞。培养中形态与成纤维细胞类似来源：中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮细胞形态：似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核五、解释下列常用术语：1).细胞系（cell line）：2).细胞株：3).原代培养：4).n传代培养：5).转染（transfection）：6).lipofection：
1.细胞系（cell line）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。不能或有限传代下去称有
限细胞系。能连续传代的称连续细胞系。
2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。
3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养。
4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。
5.转染（transfection）：将某个基因转移到培养细胞核内。
6.lipofection：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA）后形成复合物可转染到动
物细胞。
六、细胞培养的条件及设备？
a.细胞培养室
b.常用设备1. 超净工作台；2. 纯水装置；3. 抽气泵；4. 消毒装置；5. 干燥装置；6. CO2
培养箱(孵箱)；7. 液氮生物容器；8. 冰箱；9. 离心机10. 天平11. 显微镜12. 过滤装置
13. 空调14. 酸度计15. 干燥器
七.、原代培养技术的过程？
取材→漂洗→剪切→消化→计数→接种（具体可以看课本）
八.、传代培养技术过程？
传代培养技术：去旧换新液→消化→分装
九、每代细胞基本的生长过程？
1. 游离期细胞接种后最初一段时间, 细胞在培养基中呈悬浮状, 胞体圆形.
2. 贴壁期细胞附着于支持物上
3. 潜伏期细胞活着但无分裂. 细胞株6—24h 原代24—96h
4. 指数增长期细胞增殖旺盛, 数量成倍增多, 最适合实验研究. 3—5d以后来到.
5. 停止期(衰退期) 细胞长满瓶壁, 有活力, 不增殖, 能存活一段时间. 如传代进入下
一循环.
十、细胞培养技术的应用？
1、基本生长特点、活动及细胞周期
2、细胞遗传学
3、细胞内蛋白、酶及其它物质的定性、定量分析（细胞化学、免疫组化和荧光定量等）
4、分子生物学a.DNA分离、分析b.基因导入c.基因表达的原位检测
5、生物技术a.疫苗的制备b.细胞工程抗体
6、药物开发药理、毒力和药效试验
7、细胞分化,如干细胞研究
8、肿瘤学研究发生、发展、浸润、转移和转化等
9、细胞衰老、凋亡
2、乳鼠心肺组织块原代培养的方法
1)取材：将乳鼠断髓——用镊子夹尾，将鼠身浸入75%酒精中旋转3s——取出后，置小鼠于培养皿中（已消毒）——固定小鼠于操作台——用安尔碘消毒胸廓部位皮肤——在胸部中线处用2把镊子撕开小鼠胸部皮肤——剪开胸腔，去除胸骨——用弯头镊子取出小鼠心肺组织——置于已加入Hanks液的青霉素瓶
2）漂洗：用Hanks液冲洗小鼠心肺组织2次
3）剪切：置组织块于青霉素瓶一角，眼科剪用力反复剪切组织2分钟
4）制备：用胶头吸管转移并涂布组织于25ml培养瓶——加全培养液于对面——2小时后翻转培养瓶
3、培养细胞的分型
细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为贴壁依赖性细胞（包括大多数动物非淋巴组织细胞核许多异倍体肿瘤细胞）、非贴壁依赖性细胞（来源于血液淋巴组织的细胞、杂交瘤细胞、某些肿瘤细胞核转化细胞）。
贴附型
细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。只能贴附在带适量正电荷的固体或半固体表面上生长。
贴附型细胞的分型
1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层
特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型、扇形或星形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。
起源：细胞来自中胚层间充质组织。
除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
注意：细胞在培养时成为成纤维型细胞是一种惯称,与体内细胞不同。
2.上皮型细胞(epithlium cell type) 来自外胚层。
特点：扁平不规则多角型、圆形核、角为钝角，大小相仿。细胞外观透明，细胞彼此紧密相连成单层膜；边缘细胞很少脱离细胞群而单独活动“ 拉网”现象与起源内外胚层组织有关。
组织: 皮肤表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。
3. 游走型细胞(wandering cell type)
特点：起源于网状内皮系统的细胞皆属本型。在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则, 密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。
4. 多形型细胞(polymorphic cell type)
特点：无规律的形态，如神经细胞。形态特征并非一成不变，易受培养条件的影响。
悬浮型
特点：不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间的生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。S180肉瘤、血液里的白细胞、K562、HL－60。
分型的目的：
方便描述细胞在培养过程中的形态变化。培养条件好时，细胞相对稳定，可反映出起源、正常异常的区别，作为判定细胞生物学性状指标。
强调：一般形态并不是一项可靠指标要受各方面影响。
如：反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。细胞在接种时呈三角型状态，经培养一定时间后，细胞在传代前已形成上皮型细胞。
4、细胞传代的方法
1）取1/2原培养液置于50ml培养瓶
2）去除剩余培养基，加Hanks液冲洗组织块，去除剩余Hanks液
3）加入1管胰酶，静置30s，去掉多余的胰酶，剩少许继续消化10分钟
4）加2管完全培养基于25ml培养瓶并沿瓶壁冲洗细胞
5）转移细胞悬液至50ml培养瓶，再加入2管培养基
6）置于37℃、5%培养箱中培养。
5、细胞冻存、复苏的原则与方法
原则：慢冻快融
实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO（二甲基亚砜）作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
冻存的方法
1、预先配制冻存液
10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）
2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×1 06 ~ 5 ×106细胞/ml）
3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。液氮长期保存
复苏的方法
1、快速解冻
冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
2、解冻后的细胞可直接接种到含完全生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO。
3、如果细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中。
6、玻璃器皿的清洗
1）旧的：浸泡——煮沸10min——刷洗——流水冲洗15-20次——烘干——泡酸24h——流水冲洗15-20次——沥干——三蒸水浸泡2次（每次24h）——烘干——包装
2）新的：5%稀盐酸泡过夜——刷洗——流水冲洗15-20次——三蒸水浸泡——烘干、包装
7、器械清洗和消毒的步骤
严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。
①热灭菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。
②蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃)高压灭菌15~20min。
③滤过除菌：分正压、负压式滤过消毒。适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22μm微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。
④紫外线：紫外线的波长为200~300nm，最强是在254 nm，6~15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。
⑤熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰
酸钾5~7.5g，加甲醛（40%）10~15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时，致少4小时以上。
⑥煮沸消毒：紧密情况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。
⑦化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。常用的有：2%煤酚皂溶液（来
苏尔）、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3~5%甲醛溶液、75%酒精。
8、原代培养的肺细胞和复苏的肺癌细胞各自的形态特征
9、细胞冻存的意义、操作步骤和注意事项
冻存的意义：可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
注意事项：1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
4.冷冻细胞体积占冷冻管体积的1/2.
2、细胞培养基本条件
（1）合适的细胞培养基
合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细
胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境.
（2）优质血清
目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分.
（3）无菌无毒细胞培养环境
无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外
培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,
或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物.
（4）恒定的细胞生长温度
维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.
（5）合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳. 细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类.干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,
用户可直接使用,非常方便.每种细胞都有其合适的培养基,
2、细胞培养基本条件
（1）合适的细胞培养基
合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细
胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境.
（2）优质血清
目前,大多数合成培养基都需要添加血清.血清是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分.
（3）无菌无毒细胞培养环境
无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件.在体外
培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,
或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡.因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物.
（4）恒定的细胞生长温度
维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度.
（5）合适的气体环境
气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳. 细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基和天然培养基(目前使用的培养基绝大部分是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类.干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便.每种细胞都有其合适的培养基,
7 细胞传代要点与注意事项
细胞传代方法
贴壁细胞
（1）洗掉旧培养液；
（2）、用无钙镁PBS洗涤细胞一至二次；
（3）、加入适量Trypsin-EDTA溶液
方法一：37℃或温室作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆颗粒状时，洗掉消化液，轻敲培养瓶边缘使细胞自瓶壁脱落，然后加入适量的新鲜培养液，与脱落的细胞或细胞团块混合均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。
方法二：37℃或室温作用数分钟，待细胞自瓶壁脱落后，加入适量含血清的新鲜培养液，以终止trypsin作用，离心后除去上清液，或不作离心处理，添加新鲜培养基后依稀释比例传至新的培养瓶中，依正常条件继续培养之。
悬浮型细胞
（1）、吸去细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm、5min
（2）、吸除上清液，加入适量的新鲜培养基，与沉淀细胞混合均匀后，依稀释比例转移至
新的培养瓶中，依正常条件继续培养。
大规模细胞培养技术简介 大规模培养技术应用简介通过大规模体外培养技术培养哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。上世纪60-70 年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织获取生物制品已远远不能满足这一需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培养技术趋于成熟。 所谓动物细胞大规模培养技术( large-scale culture technology )是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等) ，在细胞培养工厂 (Cosmo Cat.No. 1101-400 or 1101-800 )或生物反应器( bioreactor )中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢) 细胞、BHK-21( 仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。 在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培养，发展为一次性细胞培养工厂( Made by Cosmo )或生物反应器 (Bioreactor )进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70 年代以来，细胞培养用生物
总结---细胞培养 一．基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系：原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型：细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式：贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态（形态不一定，环境改变形态可能改变）：成纤维性型细胞，上皮型细胞（单层膜样生长），游走性细胞（游散生长，常有伪足跟突起） 二．培养过程及要点（切记无菌操作） （一）工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 （二）试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： （1）玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 （2）胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 （3）塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。
肿瘤干细胞培养技术 随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。 肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。 无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。 一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子 (一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming Growth
细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
MDCK细胞培养 一、目的MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。 二、适用范围适用于疾控中心所有技术人员。 三、程序 （一）生物安全要求实验室生物安全级别：BSL-1所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。 （二）材料 1.生长成片的MDCK细胞 2.无菌的T25细胞培养瓶 3.D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 4.青、链霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃ 5.HEPES缓冲液，1M母液 6.胎牛血清 7.EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mMEDTA-4Na），分装后保存于-20℃8.7.5%牛血清白蛋白组分V9.1mL、10mL无菌移液管10.70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 （三）实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 1.D-MEM培养液的准备 500mLD-MEM液中加入：青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素），HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL 2.细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 3.首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 4.温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。
5.重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 6.加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。 7.加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 8.取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 9.每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 10.于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。
细胞培养 第一节细胞培养基本技术 一、免疫细胞分离技术 1、淋巴细胞的分离 取肝素抗凝血1m1加Hanks液1m1稀释后，沿管壁徐徐滴 流叠加盛有2m1淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混 合，然后2000r／min水平离心20min，管内分为4层，自上而 下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。 用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面 上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks液洗两次，每次 2000r／min离心10min，最后用RPMI l640培养液将细胞配成 2×106／m1的细胞悬液备用。 2、T细胞及B细胞的分离 将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞粘附于尼龙棉上，T 细胞则不粘附，先用RPMI l640培基洗脱尼龙棉柱，流下的细 胞悬液含有丰富的T细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘 附在尼龙棉上的B细胞，并用少量的RPMI l640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。 3、CD4细胞及CD8细胞的分离 （1）CD4细胞的分离：将一定量的T细胞悬液通过一根SephDdexC—10柱，然后用少量的RPMll640培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4细胞。 （2）CD8细胞分离：用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。然后将已标记有抗CD8单克隆抗体的T细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1加入上述的平皿内，4℃放置2小时，用PBS轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640培基中备用。CD4细胞亦可用此法分离。 4、单核巨噬细胞的分离 单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02温箱内温育1小时，然后用RPMI 1640培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。 二、肿瘤细胞株的传代培养 传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75％，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是：①具恒定繁殖特性，少数细胞即有繁殖能力，在琼脂内能形成克隆；有的为贴壁生长，有的悬浮生长。②染色体组型为异倍体，大多数人源细胞染色体为60－70条左右。③保留种属特异性，但组织分化性与脏器特性均消失。④具致癌性。由于传代细胞繁殖迅速，易获取、易保存，已为各实验室广泛采用。 1、HeLa细胞的传代培养 试剂与仪器 ●HeLa细胞。
1.操作台基本要求： 2.随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： （1）细菌污染
（2）酵母污染 （3）霉菌污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 （4）病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 （5）支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5．适合贴壁的细胞和悬浮的细胞
6.基础培养基，减血清培养基，无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4； 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH7.4-7.7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳 昆虫细胞在27℃为最佳 禽类细胞在38.5℃最佳 冷血动物（15℃-26℃） 9.动物细胞形态划分： ●成纤维细胞，贴附生长 ●上皮样细胞呈多角形，贴附 ●淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附 ●特殊形态： ?I型有长突触 ?Ⅱ型没有轴突 10.细胞增长模式
11.何时传代？ ●哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（） 0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。 ●昆虫细胞PH值会上升但不超过6.4 12．贴壁细胞的解离
细胞培养及检测相关技术小结 一、细胞培养基配制 以1000ml培养基为例。 1000ml成骨细胞培养基 = 850mlα－MEM培养液 + 150 ml 特级胎牛血清FBS (15%) (1). α－MEM powder: 10.2 g/L ~~~ 8.67 g for 850 ml (2). NaHCO3: 2.2 g/L ~~~ 1.87 g for 850 ml (3). Twice distilled water 850 ml, dissolve the powder in water (4). FBS (15%,v/v) 150 ml (5). Filter to sterilized bottle (6). Label the bottle and store in 4℃. Notes: 4,5 should be operated in the sterile working place. And if necessary, we can add some antibiotics into the medium（usually in primary cell culture）. 二、PBS（10×） NaCl: 80g/L KCl: 2g/L Na2HPO4: 14.4 g/L KH2PO4: 2.4 g/L PH=7.4, with HCl or NaOH Too much PO42-is harmful to cell, so only very little amount is necessary. Get some certain to dilute this 10 times concentration PBS when we need. 三、胰蛋白酶Trypsin- EDTA 消化液(10×) This solution is used for cell released from the culture flask。 The final concentration of EDTA is 0.05%; The final concentration of Trypsin is 0.53 mmol/L. Take 40 ml solution for example (10×) (1). Trypsin: 40ml×0.05%×10 =0.02g (2). EDTA: 40ml×0.53×10-3×376(molecular weight)×10-3×10 =0.0797g (3). PBS 40 ml
第一章 细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节 体外培养的概念 一、基本概念 体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 ●组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 ●细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 ●器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1.差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2.分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节 细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应
从二维到三维细胞培养的 变迁 Newly compiled on November 23, 2020
细胞培养技术进展概述及分析 细胞培养一直是细胞生物学中基础且核心的部分。无论是进行细胞性状研究，还是进行细胞产物的研发，都需要以细胞体外扩增技术-即细胞培养技术为基础。随着生命科学的发展，细胞培养技术更是被广泛应用于生物学、、新药研发等多个领域，成为生命科学最重要的基础技术之一。 传统的细胞培养即细胞的平面培养，细胞在培养过程中只能沿平面延伸，属于细胞的二维培养技术。这种培养方式经济、便利、易操作，符合某个历史阶段对细胞培养技术的要求。但随着研究的深入，传统的二维培养技术已经不能满足细胞培养需求。盖因生物体内的细胞是在立体三维的微环境中生长的，二维培养微环境与体内微环境差异太大，影响细胞的基因表达、信号转导等，导致所培养的细胞逐渐丧失其在生物体内的生物学特性及功能，失去研究及应用价值。传统的二维培养技术，已经成为细胞学为基础的众多学科进步的壁垒之一。 科学家开始寻求更贴近自然状态的细胞培养技术。一种与活体组织内的细胞外基质相似的，能更好的模拟细胞在体内生长环境的培养技术，即细胞的三维培养技术。 目前已开发出很多细胞三维培养技术，大致可分为需要支架的三维培养技术和不需要支架的三维细胞培养技术。支架类主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构, 细胞依附于支架进行三维生长和迁移, 主要的支架材料有胶原和水凝胶等；而不需要支架的三维培养技术主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的, 目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术。
第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化
1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。第二节细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
悬浮细胞传代及细胞计数 一、细胞传代 实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。进一步掌握细胞培养的操作技术。 实验原理： 培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。 实验用品： （一）仪器 净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱； （二）玻璃器皿 吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、 （三）塑料器皿 吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架 （四）其他物品 微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪 （五）试剂 1640培养液、PBS 操作步骤： 1.准备： 打开培养液，PBS； 取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。从吸管筒中依次取出吸管，装上吸 头，插入离心管备用。 2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。 3.首先观察培养板孔中培养液量。用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液， 转入离心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，
吸出转入离心管。 4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。 5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。吸取培养液约7ML放入离心管， 轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。 6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。 7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。 8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。 9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。 二、细胞计数及生长曲线测定 培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期 潜伏期(latent phase) 细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96 小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24 小时。 (2) 指数增生期(logarithmic growth phase) 这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitotic index, MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5 天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contact
名词解释： 细胞组织培养：细胞（组织）培养是指从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。 二倍体细胞株：具有二倍体染色体数的细胞株。 细胞组织培养选材：根据实验目的、观察指标确定所选组织器官。培养选材一般来自胚胎组织的培养物；比成体组织更易生存和生长。这主要是因为胚胎组织有更多的胚胎组织干细胞，它们具有更高的自我更新和多能分化能力。 原代培养：一般指从组织中分离在体外生长至传代之前的细胞培养。这种培养通常是异质性，生长缓慢，但比较能代表原组织的类型并表达原组织特性。缺点是在培养过程中会失去许多原组织的细胞。 传代细胞：原代细胞生长物或细胞系生长到一定阶段，分散成单个细胞，按一定比例接种于新的培养容器内称之传代。传代细胞称之细胞系，可分为两类：有限细胞系和连续细胞系。传代形成的具有各自生物特性或标志的细胞系称之为细胞株。 世代：指细胞经过一次分裂后完成后至下次分裂的过程。 细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。 细胞纯化：是指从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。通过细胞分离和纯化得到细胞株或系。 传代：也称为再培养，把一瓶培养细胞全部或分成几份再培养的过程。 组织工程：组织工程是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 Density inhibition:密度抑制，由于细胞密度过大，培养液营养耗尽、代谢产物过多和生存空间消失所引起细胞增殖的抑制现象。 消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。 平衡盐溶液（BSS）：集缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度，同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用，常用的BSS有PBS、Hanks等。 清洁液：是一种不含磨蚀性物质，能迅速清除物品上污垢,分解脏污，令物品透明亮如的清洁用品。 去分化：指已分化成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。但去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态，可重新表现出分化特点。 接触抑制：指细胞相互接触后失去运动（移动）的现象。 细胞融合：细胞融合是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。可在自发或人工诱导下发生。它可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达相应的功能，这样的细胞称异核体，若异核体出现有丝分裂时，则可使两个不同来源的细胞核的染色体汇聚，形成合并有亲本的大核，这样的细胞称为杂种细胞或杂交细胞。 转化细胞系：通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。 Stem cell:干细胞，是指一类具有自我更新能力和分化潜能的细胞。
细胞培养技术总结 （，，，） 1·培养环境的要求（切记无菌操作） 工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒。 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 2·仪器设备的要求 定期检测下列项目： CO2 钢瓶之CO2 压力。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 3·无菌处理 1）器具的无菌操作 试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗： a玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置） 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 b胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 c塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。 2）消毒灭菌： a物理消毒法（紫外线，湿热，烘干，过滤）含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时 b化学消毒法（70%酒精，千分之一的新洁尔灭） c抗生素：培养用液灭菌或预防培养物污染 3）无菌的操作技术 培养物的污染及控制 污染种类：
1、细胞（组织）培养年鉴 1878 Claude Bernard:证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以 人工维持。 1885 Wilhelm Roux:在一个生理溶液中维持一快鸡胚的活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。 1887 Ross Harrison:利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维的生长，从解决了神经纤维的来源问题。Ross Harrison被人称为细胞培养之父。 1910 Burrows:率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞. 1911 Lewis & Lewis:由海水、血清、胚胎提取物和盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。 1916 Rous & Jones:开创使用胰酶来收获贴壁生长的细胞。 1923-1931 Carrel & Baker:研制T型培养瓶大规模培养细胞。 1927 Carrel & Rivera:制造了第一个病毒疫苗：牛痘疫苗。 1933 Gey: 发明了转管培养细胞的技术。 1948 Fisher: 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006，该培养液至今还在使用。 1952 Gey 和同事：分离培养了Hela细胞。 1952 Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。 1954 Abercrombie: 观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。 1961 Hatflick & Moorhead：显示人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。 1965 Ham:配制了第一个无血清培养液。 1975 Kohler & Miltein:成功的得到了第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。 2、怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？ ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数常用细胞的详细资料。