DNA探针与基因诊断制剂项目IPO上市咨询（2013年最新细分市场+募投可研+招股书底稿）
综合解决方案
北京博思远略咨询有限公司IPO事业部
二零一三年三月
目录
第一部分DNA探针与基因诊断制剂项目创业板IPO上市审查要点分析 (4)
一、2013年创业板最新审核政策分析 (4)
二、专业机构在企业IPO上市过程中主要作用 (5)
第二部分DNA探针与基因诊断制剂项目细分市场（行业研究）调查解决方案7
一、创业板DNA探针与基因诊断制剂项目细分市场调查政策依据 (7)
二、细分市场调查（行业研究）在企业IPO上市过程中的重要性 (7)
三、博思远略IPO细分市场调查研究思路及关键问题说明 (8)
四、博思远略DNA探针与基因诊断制剂细分市场（行业研究）调查大纲11 第三部分DNA探针与基因诊断制剂项目募投可行性研究报告（甲级资质）编制解决方案 (14)
一、证监会关于募集资金运用及募投可研的编制要求 (14)
二、IPO上市募投可研与一般可研报告主要区别 (16)
三、DNA探针与基因诊断制剂募投项目可研报告在企业上市过程中的重要
作用 (16)
四、博思远略DNA探针与基因诊断制剂募投项目（基于2013年最新大纲
及审查重点）可研方案设计原则 (16)
五、博思远略IPO募投项目可研分阶段服务内容 (17)
六、博思远略IPO募投项目可研报告标准大纲（2013最新版） (18)
七、博思远略IPO募投项目可研编制重点解决问题 (25)
第四部分博思远略最新成功案例展示 (28)
一、行业构成 (28)
二、区域构成 (28)
三、案例成果展示（包括但不限于） (28)
第五部分博思远略咨询公司介绍 (30)
一、公司基本情况 (30)
二、团队构成 (31)
三、咨询服务流程 (31)
三、博思远略服务优势 (32)
第六部分本解决方案关键词 (34)
DNA探针与基因诊断制剂项目上市咨询方案；DNA探针与基因诊断制剂项目上市可行性研究报告；DNA探针与基因诊断制剂募投项目可研报告；DNA 探针与基因诊断制剂细分市场调查；DNA探针与基因诊断制剂行业研究；
证监会发审委；博思远略咨询公司；创业板IPO上市咨询；2013年DNA探针与基因诊断制剂项目最新募投可研编制方案；发改委甲级资质 (34)
第一部分DNA探针与基因诊断制剂项目创业板IPO上市审查要点分析
一、2013年创业板最新审核政策分析
企业上市主要目的之一就是要募集资金，而募集资金必须投资相应的项目。创业板要求“发行人募集资金应当围绕主营业务进行投资安排”，也就是说至少60%—70%的资金应该用于主营业务项目的投资建设。研发类不产生收益的项目应该尽可能少占用募集资金。除了这个直接要求，博思远略咨询公司（甲级资质）根据证监会发审委最新审核政策对所重点审核的节点总结如下：
(1)、规模的合理性
(2)、新产品的技术成熟性
(3)、固定资产投资规模与新增收入的匹配性
(4)、与发行人历史数据的匹配性
(5)、研发类项目投资比例的合理性
根据博思远略咨询公司研究发现，创业板企业大多有服务收入比重较高，无形资产较多，企业重置成本低等特征。如果按照企业原有设备规模和技术水平进行项目设计，那么募集资金规模会很小。这使得很多企业在项目设计中做大设备投资、增加土建投资、增加铺底流动资金以完成既定的募集资金目标。这一现象十分普遍，也是造成募集资金运用部分经常被反馈的原因。采取上述策略虽然可以满足募集资金规模的要求，但是固定资产增加过多、比例增大问题难以解释。由于项目收入测算要求严谨保守，那么又出现了投入产出的匹配性问题。
为了解决上述问题，博思远略建议采取以下策略：
(1)、募集资金规模能小则小，越小问题越少；
(2)、项目设备尽量采取现有设备的最新升级型号，避免大换血；
(3)、建设规模和项目收入参照现有规模设计，不建议超过当前规模的 1.5倍；
(4)、土建投资最好自有资金出资或者实物出资以表明节约募集资金；
(5)、土建投资比例应少于30%，避免房地产投资嫌疑；
(6)、回收期控制在5年之内，内部收益率不低于20%；
(7)、项目收入规模上限不能高于市场容量预测的增加值；
(8)、选择知名工程咨询公司进行项目的审核以证明其合理性；
(9)、采用先进设备引起投资规模大增的要说明现有设备的不适用性；
(10)、募投项目市场分析与行业基本情况分析互相支持。
上述策略是上市募投项目设计中应该注意的基本问题，除此之外，上市用项目可行性研究报告应该重视风险防控措施的论述。做到项目设计合理、风险防控得当、经得起股民推敲，募集资金运用这一部分才算是符合上市要求。
二、专业机构在企业IPO上市过程中主要作用
第二部分DNA探针与基因诊断制剂项目细分市场（行业研究）调查解决方案一、创业板DNA探针与基因诊断制剂项目细分市场调查政策依据
二、细分市场调查（行业研究）在企业IPO上市过程中的重要性
三、博思远略IPO细分市场调查研究思路及关键问题说明
博思远略根据大量创业板、中小板上市咨询项目经验，对DNA探针与基因诊断制剂细分市场调查研究过程中应重点解决的问题做了详细总结，并提出了实际操作建议：
关键问题一：对DNA探针与基因诊断制剂上市企业所在细分市场和企业定位
需要根据上市企业主要产品和业务选定一个细分市场作为企业所在行业。选择的
时候要注意以下问题：
1、不同的细分市场对应的市盈率不同，会影响募投项目总体的资金规模。
2、不同的细分市场会影响上市企业在该行业的市场地位。
3、主营产品的市场容量及市场份额要依据选定的行业论证。
4、选定的细分市场其发展前景和新产品发展方向会影响上市企业研发方向和研发项目设计。
5、选定的细分市场要与上市企业对自己的定位相匹配。
关键问题二：DNA探针与基因诊断制剂细分市场容量分析注意要点
上市企业产品细分市场容量大小及其发展趋势是证监会十分关注的问题。市场容量一般用该产品的市场需求量或者市场规模（销售额）来表述。涉及近三年甚至更长时间的历史数据和未来3-5年募投项目达产时的市场容量数据。
产品的未来的市场容量应该是不断增长的，历史的数据则尊重事实。历史数据如果有较大的波动还需要进一步解释其原因，表明其不会对未来有不利影响。如果确实是周期性规律，则要在未来的市场容量预测中考虑该周期性的影响。
产品的未来的市场容量还需要保障能够容纳募投项目带来的新增产能。而募投项目新增的产品产量和当前企业的产量之和是未来拟上市企业产品的总产量，其与市场容量的比值即为市场占有率。因此，未来市场容量数据也要考虑企业市场占有率是提升还是下降。企业市场地位的上升与下降要与行业发展的趋势和竞争格局的走势相一致。
关键问题三：DNA探针与基因诊断制剂细分市场调研数据来源
产品细分市场数据大致有以下几个来源渠道：
公开数据——权威机构或者国家公布的数据，如统计局、海关总署、DNA探针与基因诊断制剂行业协会、相关网站、DNA探针与基因诊断制剂行业期刊、DNA 探针与基因诊断制剂杂志、DNA探针与基因诊断制剂研究院、知名第三方咨询公司等。
产业链数据——上下游产业数据，如关联产品数据、关键的原料或者配件数据可以用来估算产品细分市场数据。
发布数据——根据调研结果，由同行业权威机构（如报纸、协会、期刊杂志等）发布的数据。
推算数据——根据本行业及上下游行业的公开数据或者发布的数据用合理的估算方法来推算得到的数据。
四、博思远略DNA探针与基因诊断制剂细分市场（行业研究）调查大纲
一、DNA探针与基因诊断制剂行业主管部门、行业监管体制、行业主要法律法规及政策
1、行业主管部门及监管体制
2、行业主要法律法规及政策
二、DNA探针与基因诊断制剂行业概况（重点）
1、企业的行业定位
2、上下游产业链及关联产业关系
3、行业市场容量分析（总的市场容量、关键设备产品的市场容量）
4、行业发展趋势分析
三、DNA探针与基因诊断制剂行业竞争格局和市场化程度
1、行业竞争格局（自由竞争、垄断竞争、垄断）
2、市场化程度（完全开放、政府控制、国企垄断、外商主导）
四、DNA探针与基因诊断制剂行业内的主要企业和主要企业的市场份额（重点）
1、行业内主要企业（3—6家）
2、主要企业市场份额
五、DNA探针与基因诊断制剂行业进入障碍
1、技术壁垒
2、政策准入
3、资金规模壁垒
4、人才壁垒
5、品牌壁垒
六、DNA探针与基因诊断制剂市场供求状况及变动原因
1、市场需求情况及其发展趋势
2、市场供给情况及其存在问题
3、供求格局及其变动原因
七、行业利润水平的变动趋势及变动原因（重点）
1、近三年行业利润水平及其变动趋势
2、影响传业利润水平变动的因素分析
八、影响行业发展的因素
1、产业政策因素
2、技术替代因素
3、行业发展瓶颈
4、国际市场冲击
5、其他因素
九、DNA探针与基因诊断制剂行业技术水平及技术特点
1、行业技术发展历程及当前发展水平
2、行业当前主要技术及其特点
十、DNA探针与基因诊断制剂行业特有的经营模式（重点）
1、生产模式
2、销售模式
3、盈利模式
4、其他特殊模式
十一、DNA探针与基因诊断制剂行业的周期性、区域性、季节性特征
1、行业的周期性
2、行业的区域性
3、行业的季节性
十二、DNA探针与基因诊断制剂行业与上下游行业之间的关系
1、发行人所处行业与上下游行业之间的关联性
2、上游行业发展状况对本行业及其发展前景的有利和不利影响
3、下游行业发展状况对本行业及其发展前景的有利和不利影响
十三、产品进口国政策及竞争环境
1、产品进口国政策及其影响
2、进口国同类产品的竞争格局
十四、公司在行业中的竞争地位
1、公司市场份额及变动趋势
2、主要竞争对手及其简要情况
3、公司的竞争优势
4、公司的竞争劣势
附件：
1、主要结论引用资料
2、市场数据引用材料
3、分析图表参考资料
4、拟发布的数据材料
5、市场容量数据推算表及基本假设
6、竞争对手资料汇总
7、行业研究报告和专家文章汇总
第三部分DNA探针与基因诊断制剂项目募投可行性研究报告（甲级资质）编制解决方案
一、证监会关于募集资金运用及募投可研的编制要求
第十二节募股资金运用
第一百四十九条发行人应披露：
（一）预计通过本次发行募股资金的总量及其依据；
（二）董事会或股东大会对本次募股资金投向项目的主要意见；
（三）募股资金运用对主要财务状况及经营成果的影响，包括对净资产、每股净资产、净资产收益率、资产负债率、盈利能力、资本结构等的影响。未披露盈利预测的，应详细披露募股资金运用的影响。
第一百五十条发行人应充分考虑实际募股资金量不足或超过所申报资金需求量的可能。所筹资金尚不能满足规划中项目资金需求的，应详细说明其缺口部分的资金来源及落实情况；所筹资金超过了规划中项目资金需求的，应披露多募资金的大体安排及资金管理措施，并披露其对财务状况和经营成果的影响。
第一百五十一条如属直接投资于固定资产项目的，发行人可视实际情况并根据重要性原则披露以下内容：
（一）各投资项目的轻重缓急及立项审批情况（如需要）；
（二）投资概算情况，预计投资规模，募股资金的具体用项及其依据，包括用于购置设备、土地、技术以及补充流动资金等方面的具体支出；
（三）所投资项目的技术含量，包括产品的质量标准和技术水平，生产方法、工艺流程和生产技术选择，主要设备选择，主要技术人员要求，研究与开发措施，核心技术及其取得方式；
（四）主要原材料、辅助材料及燃料等的供应情况；
（五）投资项目的产出和营销情况，包括产品现有和潜在生产能力，投资项目的产量、价格及产销率，替代产品，产品出口或进口替代，产品销售方式及营销措施；
（六）投资项目可能存在的环保问题及采取的措施；
（七）闲置资金（若存在）的利用计划，或资金缺口（若存在）的补充来源；（八）投资项目的选址，拟占用土地的面积、取得及处置方式；
（九）投资项目的效益分析，包括现金流、内部收益率、达产期、回收期和产品的市场生命周期等。
（十）项目的组织方式，项目的实施进展情况。
第一百五十二条发行人募股资金拟用于对外投资、与他人合资进行固定资产项目投资的，除相应披露上述具体内容外，还应主要披露：
（一）合资方的基本情况，包括名称、法定代表人、住所、注册资本、主要股东、主要业务，与发行人是否存在关联关系等；
（二）投资规模及各方投资比例；
（三）合资方的投资方式和资金来源；
（四）合资协议中有关可能给发行人造成损失及损失处理的条款，如合资方不能按时投资，可能给发行人造成的损失以及损失的补偿方式等。
第一百五十三条发行人募股资金拟用于对外股权投资组建企业法人或其他法人的，应主要披露：
（一）拟组建企业法人或其他法人的基本情况，包括设立、注册资本、主要业务等；
（二）投资规模及各方投资比例；
（三）法人的组织及管理情况；
（四）合作方的基本情况及与发行人是否存在关联关系或竞争关系。
第一百五十四条发行人募股资金拟用于收购在建工程的，应主要披露：
（一）在建工程的已投资情况；
（二）投资来源；
（三）还需投资的金额；
（四）负债情况；
（五）建设进度；
（六）计划完成时间；
（七）收购价格的确定方式。
第一百五十五条发行人募股资金拟用于收购兼并其他法人股份或资产的，应主要披露：
（一）被收购企业的基本情况及最近一个完整会计年度及最近一期的主要财务会计数据；
（二）收购的股份或资产；
（三）所收购股份或资产的评估、定价等情况；
（四）收购兼并后参股、控股的比例及其控制情况。
第一百五十六条发行人募股资金拟投入其他用途的，应披露具体的用途，以及对发行人经营和财务的影响，包括对发行人财务结构、盈利预测、净资产收益率、股东利益等的影响。
第一百五十七条上述应披露的各类募股资金用途，如涉及关联关系及关联交易的，应披露董事会或股东大会的决策依据。
二、IPO上市募投可研与一般可研报告主要区别
一般来说，中小板、创业板IPO募投项目可研报告（上市可研）与一般用于立项的可行性研究报告主要有以下几点区别：
1、上市募投项目项目可行性研究报告应纳入上市筹划的总体方案中，因为募集资金的投向直接关系到能否实现上市的关键问题；
2、上市募投项目可研报告需要上市咨询团队中的各中介机构（券商、律师事务所、会计师事务所、第三方调查公司）密切配合，特别是应与财务评估机构密切配合，将募集资金项目的投入产出而导致的资金流的变化纳入到总体财务预测中；
3、募集资金只能用于发展主营业务；
4、项目的财务分析应该考虑到上市公司信息披露的具体要求，
5、不再要求就发行人的募集资金投资项目是否符合国家产业政策和投资管理的规定征求国家发展与改革委员会的意见。
三、DNA探针与基因诊断制剂募投项目可研报告在企业上市过程中的重要作用
IPO上市项目可行性研究报告主要用于IPO上市项目在国内备案并作为券商招股书底稿提交证监会。
报告一般分为两个版本：一个版本是用于前期获取发改委立项批文，另一个版本则是用于券商招股书编制并作为工作底稿。
立项用IPO上市项目可行性研究报告中涉及的项目总投资、建设地址、建设内容将体现在发改委的立项批文中，因此招股书编制用IPO上市项目可行性研究报告必须保证上述内容不变，只能调整文字、数据的配比、论证方式。
四、博思远略DNA探针与基因诊断制剂募投项目（基于2013年最新大纲及审查重点）可研方案设计原则
1、如果您是外资企业、外商再投资企业募项目获取批复文件需要编制项目申请报告；如果企业是内资企业，但项目被纳入《政府核准的投资项目》，那么募投
项目也是项目申请报告。
2、内资企业募投项目一般采取备案制，需要编制可行性研究报告。此外，企业需要环评审查，项目需要做环评、节能评估；
3、募投项目可研报告（包括项目申请报告）要解决批复获取和券商底稿两个问题，因此可分成2个版本进行编制。其中发改委申报或核准的需要投资基础数据和建设内容准确论证即可；
4、募投项目设计要求与企业历史财务数据、财务制度具有连贯性，折旧算法、毛利率、各种税率、坏账准备、应收账款比例、周转次数等应该保持一致；
5、募投项目中土地一般要求先行获取，土地投资计入项目总投资但不算作募集资金；
6、利用既有房产或者在建房产进行募投项目建设的房产价值可以用募集资金置换，土地价值不可置换；
7、募投项目产品产能设计要考虑产品的市场容量、新增产能的募投项目，企业的市场占有率要考虑原有产能和新增产能合计对市场的影响；
8、募投项目建设周期一般不超过两年；
9、募投项目一期投资不宜过大，投资过大会造成企业当期损益表现为利润下滑；
10、募投项目与企业现有产品和业务的关联性要比较分析，确定是否扩产、升级新产品还是支持企业发展的研发或营销项目；
11、募投项目必要性分析要考虑原有产能是否超负荷、是否改变经营模式以提高利润水平、是否通过规模经济降低成本、是否增加投资获得关键环节生产自动化、是否是募投项目带来新的客户、是否是有利于企业提高竞争力、是否填补行业空白、是否是支持企业转型等等；
12、募投项目的设备选型重点考虑各个项目的同类设备价格是否一致，是否有设备可以公用，对于使用企业现有设备、配套设施、人员的需要考虑对原有企业生产能力的影响；
13、募投项目如果是将企业原来外包的业务转为自主生产，那么项目的收入要包含原有业务收入和增加投资带来的新增收入两部分。
五、博思远略IPO募投项目可研分阶段服务内容
博思远略编制IPO募投项目可研报告撰写一般分为两个阶段：
第一阶段：确定募集资金总额及各个项目总投资、建设内容等关键指标数据，完成备案核准版可研报告或者申请报告撰写，上报获取批文。同期根据项目环境影
响到环保局办理环评审查。
第二阶段：根据券商招股书需要，详细撰写项目投资建设的必要性、可行性、背景、市场容量分析、营销推广策略、设备选型表、投资构成描述、效益成本分析等部分。
博思远略具有甲级工程咨询资质，可以根据客户需求编制募投项目可行性研究报告、项目申请报告，为券商招股书编制提供全方位工作底稿及数据资料核实服务。
六、博思远略IPO募投项目可研报告标准大纲（2013最新版）
一、总论
（一）项目背景
1、项目名称
2、承办单位
2.1 公司介绍
2.2 公司项目承办的技术基础和优势（重点）
3、可行性研究报告编制依据
4、项目建设背景及必要性（重点）
4.1产业发展要求
4.2 市场发展与竞争要求
4.3 产品技术发展要求
4.4 企业发展的要求
4.5 项目建设的意义与影响
5、募集资金投资项目与公司现有业务及产品的关联
（二）DNA探针与基因诊断制剂项目概况
1、拟建项目
2、建设规模与目标
3、主要建设条件
4、项目总投资及效益情况
5、主要技术经济指标
（三）主要问题说明
1、项目资金来源问题
2、项目原料供应问题
3、项目供电供水保障问题
二、DNA探针与基因诊断制剂市场分析（一）市场容量分析
（二）产品目标市场
（三）产品价格
（四）营销策略
1、营销策略
2、营销模式
3、促销措施
三、建设规模与产品方案
（一）项目产品方案
（二）项目建设规模
四、场址选择
（一）项目选址及用地方案
1、项目选址
2、建设地条件
（二）土地利用合理性分析
（三）征地拆迁和移民安置规划方案五、技术方案、设备方案和工程方案（一）项目技术方案
1、项目主要技术
2、项目工艺流程
（二）项目设备方案
1、设备选型原则
2、项目设备选型表
（三）项目工程方案
1、项目主要构、建筑物
2、项目建筑工程造价
六、主要原材料、能源供应
（一）项目主要原料材料
（二）能源供应
（三）主要原材料、燃料及动力年需要量七、总图运输与公用辅助工程
（一）总图布置
1、平面布置
2、竖向布置及道路
3、总平面图
4、总平面布置主要指标表
（二）场内外运输
1、场外运输量及运输方式
2、场内运输量及运输方式
3、场外运输设施及设备
（三）公共辅助工程
1、供水工程
2、供电工程
3、通信系统设计方案
4、通风采暖工程
5、防雷设计
八、节能方案分析
（一）节能措施
1、节能依据
2、设计原则
3、节能方案
（二）能耗指标分析
1、用能标准与能耗计算方法
2、能耗状况和能耗指标分析
九、节水措施
（一）节水措施
（二）水耗指标分析
十、DNA探针与基因诊断制剂项目环境影响评价（一）环境和生态现状
（二）生态环境影响分析
1、施工期环境影响
2、运营期环境影响分析
3、环境影响综合评价
（三）生态环境保护措施
组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型） 储存条件 该试剂盒置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。2-8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10 min，以溶解沉淀。 注意事项 1．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。2．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。 3．若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。 4．所有离心步骤均为使用台式离心机，室温下离心。 操作步骤 使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 1. 处理材料 用干烤过的镊子和剪刀剪取一定量的冰冻组织，体积约两个绿豆大小，放入DNAase-free的1.5ml EP中。向EP管中加入等体积的磁珠，以及加入200 μl缓冲液GA，振荡悬浮。置于组织破碎仪中运行5mins/次，共3次。每破碎一次，需将含组织的EP管放入离心机中短暂离心来沉淀组织和磁珠，使其在下次破碎时更好的接触。可根据观察匀浆的效果来决定匀浆的次数，目标是“碾磨均匀”，不能有较大体积的组织块（>2mm的组织块）。 如果需要去除RNA，需加入4 μl RNaseA（100 mg/ml）溶液（客户自备，目录号：RT405-12），振荡15 sec，室温放置5 min。 2. 加入20 μl Proteinase K溶液，混匀。提取组织基因组时，加入Proteinase K混匀后，在56℃放置1~3 h，直至组织溶解，每小时颠倒混合样品2-3次，用水浴振荡器也可。放入10,000rpm (~11,500×g) 的离心力高速离心1mins来沉淀未碾碎的组织和磁珠。将上清转移至新的EP管中。 3. 加入200 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。 4. 加人200 μl 无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。 6. 向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD （使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7. 向吸附柱CB3中加入600 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g)离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8. 重复操作步骤7。
基因诊断试题
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(一）选择题 A型题 １．判定基因结构异常最直接的方法是 A．PCR法 B．核酸分子杂交 C．DNＡ序列测定 Ｄ．RFLP分析 E．ＳSCP分析 2．不符合基因诊断特点的是 A.特异性强 B．灵敏度高 C.易于做出早期诊断 Ｄ．样品获取便利 E．检测对象仅为自体基因 ３．遗传病基因诊断的最重要的前提是 A.了解患者的家族史 B.疾病表型与基因型关系已被阐明 C.了解相关基因的染色体定位 Ｄ．了解相关的基因克隆和功能分析等知识 E.进行个体的基因分型 ４.若要采用Soutｈern或Ｎｏrthern印迹方法分析某特定基因及其表达产物,需要 A．制备固定在支持物上的组织或细胞
B.收集组织或细胞样品，然后从中提取总DNA或ＲNＡ Ｃ．利用PCＲ技术直接从标本中扩增出待分析的片段Ｄ．收集组织或细胞样品,然后从中提取蛋白质 Ｅ.收集培养细胞的上清液 5．目前基因诊断常用的分子杂交技术不包括哪一项A．Sｏuthern印迹 B.Wｅsterｎ印迹 Ｃ.Noｒthern印迹 D．ＤＮA芯片技术 E．等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 6.SNP的实质是 Ａ．碱基缺失 B.碱基插入 C.碱基替换 D．移码突变 E．转录异常 ７.DNＡ指纹的遗传学基础是 Ａ.连锁不平衡 B.DNA的多态性 Ｃ.串联重复序列 D．MHC的限制性 E．ＭHC的多样性
8．在对临床病例进行基因诊断时，若遇到不能检测出已知类型突变的情况，如果表型明确指向某种疾病,适用下列哪一类筛查技术 A．PCR法 B．AＳO分子杂交 Ｃ.反向点杂交 D．变性高效液相色谱(DＨPLC） E．ＳTR拷贝异常的诊断 9.生殖细胞若发生基因结构突变可引起哪种疾病 A.肿瘤 Ｂ．高血压 Ｃ．糖尿病 D．遗传病 Ｅ．传染病 10.PCR技术容易出现 Ａ.假阴性结果 B．假阳性结果 C.灵敏度不高 D．适用不广 Ｅ．操作繁冗 1１．目前检测血清中乙肝病毒最敏感的方法是 A.斑点杂交试验 B.等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 C．Sｏutｈern印迹
第二十一章基因诊断与基因治疗 基因诊断与基因治疗能够在比较短的时间从理论设想变为现实，主要是由于分子生物学的理论及技术方法，特别是重组DNA技术的迅速发展，使人们可以在实验室构建各种载体、克隆及分析目标基因。所以对疾病能够深入至分子水平的研究，并已取得了重大的进展。因此在20世纪70年代末诞生了基因诊断(gene diagnosis)；随后于1990年美国实施了第一个基因治疗(gene therapy)的临床试验方案。可见，基因诊断和基因治疗是现代分子生物学的理论和技术与医学相结合的范例。 第一节基因诊断 一. 基因诊断的含义 传统对疾病的诊断主要是以疾病的表型改变为依据，如患者的症状、血尿各项指标的变化，或物理检查的异常结果，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，而且是在疾病发生的一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。现知各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是指采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。基因诊断有时也称为分子诊断或DNA诊断(DNA diagnosis)。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。 二. 基因诊断的原理及方法
（一）基因诊断的原理 疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述的变化或利用连锁方法进行分析，这就是DNA诊断。 对表达产物mRNA质和量变化的分析为RNA诊断(RNA diagnosis)。 （二）基因诊断的方法 基因诊断是以核酸分子杂交(nucleic acid molecular hybridization)和聚合酶链反应（PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析，近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。 1.DNA诊断 常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。 ⑴斑点杂交：根据待测DNA 样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。 ⑵等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe, ASO probe）杂交：是一种检测基因点突变的方法，根据点突变位点上下游核苷酸序列，人工合成约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有该点突变的DNA样本，才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。一般尚合成正常基因同一序列，同一大小的寡核苷酸片段作为正常探针。如果受检的DNA样本只能与突变ASO探针，不与正常ASO探针杂交，说明受检二条染色体上的基因都发生这种突变，为突变纯合子；如果既能与突变ASO探针又能与正常ASO探针杂交，
基因测序技术的优缺点及应用 随着人类基因组计划的完成,人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时,分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善,使得基因检测技术得到了迅猛发展,基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术,到 2005 年,以Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序 (next-generation sequencing,NGS) 的相继出现,测序效率明显提升,时间明显缩短,费用明显降低,基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展,极大地提高了基因检测的检出率,并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月,约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术,发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2,标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年,《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后,通过 NGS 技术,与遗传相关的致病基因不断被发现,NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年,《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。 近两年,基因检测成为临床诊断和科学研究的热点,得到了突飞猛进和日新月异的发展,越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时,基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域,其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前,基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。 本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法,比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用,对指导研究生和临床医生课外学习,推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年,Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法,这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法,并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH,因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP,延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成,将模板、引物和 4 种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP 分别与DNA 聚合酶混合形成长短不一的片段,大量起始点相同、终止点不同的 DNA 片段存在于反应体系中,具有单个碱基差别的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来,得到放射性同位素自显影条带。依据电泳条带读取DNA 双链的碱基序列。 人类基因组的测序正是基于该技术完成的。Sanger 测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。目前,依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。例如,临床上采用 Sanger 直接测序 FGFR 2 基因证实单基因 Apert 综合征和直接测序 TCOF1 基因可以检出多达 90% 的
双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明 产品说明： 报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。 本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。 产品内容： 名称数量保存条件5x Universal Lysis Buffer(通用裂解液)25ml-20℃ Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃ Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃ Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃ Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃可作100次双荧光素酶检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。
基因诊断在单基因遗传病中的应用 【摘要】基因诊断是利用分子遗传学技术在DNA或RNA水平上对某一基因进行突变分析，从而对特定疾病进行诊断。基因诊断因其直接诊断性、高特异性、灵敏性、早期诊断性弥补了表型诊断的不足而被广泛应用。本文主要从基因诊断方法如核酸分子杂交、聚合酶链反应及相关技术、DNA序列测定、DNA芯片、连锁分析等在单基因遗传病中的应用进行综述。 【关键词】基因诊断；单基因遗传病；分子诊断；血友病 1基因诊断 基因诊断(gene diagnosis)又称DNA诊断或分子诊断，通过从体内提取样本用基因检测方法直接检测基因结构及其表达水平的改变，检测病原体基因型，进而判断是否有基因异常或携带病原微生物，或利用分子生物学技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷。应用基因诊断技术可以针对已确诊或拟诊遗传性疾病的患者及其家系成员，根据遗传学的基本原理，通过分子生物学的实验手段检查被检个体相关基因的异常，确定隐形携带者状态及在症状出现前的疾病易感性等，从而达到临床确诊的目的。因此，基因诊断迅速在临床诊断领域特别在遗传病研究领域得到了较为广泛的应用。目前的基因诊断方法主要有核酸分子杂交、聚合酶链反应及相关技术、DNA序列测定、DNA芯片、连锁分析等。 2单基因遗传病 单基因遗传病是指由单个基因异常导致且以孟德尔方式遗传的疾病，是我国常见出生缺陷的重要原因之一，较为常见且研究较多的有血友病、苯丙酮尿症(PKU)、肝豆状核变性、地中海贫血等等。除部分单基因遗传病可通过手术加以矫正外，绝大部分遗传病是致死、致残、致畸性疾病，且目前均无法治疗，进行遗传性疾病的产前诊断，是避免致死、致残、致畸性疾病胎儿出生的重要手段。 3基因诊断的应用 3.1在B型血友病中的应用 血友病B(hemophilia B)是因凝血因子Ⅸ(FlX)基因缺陷引起的x-连锁隐性遗传出血性疾病，在男性中的发病率约为1／30000，散发率可达患者总数的30％-50％[1]由于目前还不能根治，对于携带者和高危胎儿进行基因诊断非常必要。血友病B基因缺陷类型十分繁多，基因缺陷包括缺失、插入和点突变，其中80％左右为单个碱基突变[2]。目前已发现的突变位点中，除了导致氨基酸序列改变的突变外，还发现不少的CpG区、剪切位点的突变[3]。常用于血友病B连锁分析的方法有限制性片段多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLP)
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene(PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号 传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的 热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺 癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织 K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个 体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 表1 本品可检测的K-ras基因突变 K-ras基因12密码子突变K-ras基因13密码子突变 Gly12Ser GGT > AGT Gly13Ser GGC > AGC Gly12Arg GGT > CGT Gly13Arg GGC > CGC Gly12Cys GGT > TGT Gly13Cys GGC > TGC Gly12Asp GGT > GAT Gly13Asp GGC > GAC Gly12Ala GGT > GCT Gly13Ala GGC > GCC Gly12Val GGT > GTT Gly13Val GGC > GTC 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras 基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras
基因诊断在遗传病监测中的应用 目前发现人类遗传性疾病有3 000多种，如果仅依靠以往的染色体分析技术或对基因产物与代谢物的测定，我们只能对其中为数极少的一部分疾病在发病前或产前进行诊断。因为许多基因的表达有时相性和组织特异性（如有些基因在胎儿早期并不表达、苯丙氨酸羟化酶只在肝组织中表达）。用常规的方法采集的胎儿标本或其他人体材料，常常不能测出这些基因的产物或代谢产物。 然而，作为构成机体基本单位的细胞，无论其来自何种器官或组织，它们的基因组成却是完全一致的；虽然在某些特异化的组织细胞中某些基因并不表达，但那些基因的突变却存在于一切细胞之中。如果采用基因分析的方法进行监测，在个体发育的任何阶段，以任何一种有核细胞为检材，基因的缺陷都能被监测出来。 这就是近十几年来飞速发展的重组DNA技术给遗传病的早期（症状前和出生前）诊断带来的福音。重组DNA 技术不仅极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，而且同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。自从1978年发现第一个限制酶切位点多态性并应用于遗传病（镰形细胞贫血）的基因诊断以后，能够进行基因诊断的病种不断增加，方法和途径越来越多。 一、基因突变的类型 造成基因突变的原因很多，有自发的也有外界理化因素的影响。从DNA序列改变的角度来看，不外乎单核苷酸的取代和DNA片段的插入或缺失两大类型。所产生的后果取决于突变发生的位置和性质，只要影响了基因表达过程中的任何一个环节，都会导致遗传性疾病。归纳起来如表1所示 表1 基因突变及效应一览表 DNA序列的改变突变发生的部位mRNA水平的表现基因产物的改变举例 1.大片段缺失或插入 整个基因缺如缺如α地中海盆血 基因片段异常功能缺陷DMD、BMD 2.少数核苷酸的缺失或插入 外显子与内含子接界拼接异常缺如 3的整数倍外显子缩短或延长异常（氨基酸缺失或插入）Hb Leiden 非3的整数倍外显子缩短或延长异常（移码突变）β地中海盆血 3.单核苷酸取代 启动子减少减少β地中海盆血 剪接信号剪接异常缺如β地中海盆血 PolyA信号不稳定减少β地中海盆血 密码子中性突变正常 密码子错义突变氨基酸取代异常血红蛋白 密码子或内含子剪接异常缺如或移码突变β地中海盆血 密码子无义突变肽链提前终止β地中海盆血 终止密码肽链延长，量减少Hb Canstant spring 起始密码β地中海盆血缺如β地中海盆血 二、遗传病基因诊断的途径 在了解了基因突变的各种类型之后，对应用何种方法来诊断它们便很容易理解了。例如某种遗传病是由于基因缺失造成的，可通过监测受检者是否缺失该基因来直接判断其基因型。如果某遗传病是核苷酸取代造成的点突变，便可以通过监测该突变的方法（ASO探针或酶切位点监测）来进行诊断。如果致病突变或病
基因诊断和治疗的医学应用 郭龙飞 （保山学院资源环境学院云南保山678000） 摘要：各种癌症和恶性肿瘤是目前危害人类健康最为严重的疾病之一，且死亡率很高，现在还没有一种有效的治疗方法。传统的手术、放疗和化疗等方法对中晚期的患者治疗疗效已经明显不足。因此。找到一种新的治疗癌症和恶性肿瘤的治疗方法对人类健康发展是意义重大的。而基因治疗则是用各种手段从基因水平上来治疗各种疾病。于是，基因治疗为众多患者提供了希望，成为了现在医学界的热门话题。本文就是依据前人的研究成果，以基因治疗癌症和恶性肿瘤为主来论述基因治疗在医学上的应用。 关键词：基因诊断基因治疗癌症恶性肿瘤 1基因治疗概述 基因治疗的基本含义是通过遗传或分子生物学技术在基因水平上治疗各种疾病[1]。它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞,以纠正基因缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗,而通常所称狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基因替代治疗,一般用DNA序列[2]。它是运用基因工程技术直接纠正肿肿瘤细胞基因的结构及（或）功能缺陷，或者间接通过增强宿主对肿瘤的杀伤力和机体的防御功能来治疗肿瘤。通过外源基因的导入，激活机体抗瘤免疫，增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达或增加肿瘤细胞对药物的敏感性，这些基因主要包括细胞因子基因、抗肿瘤基因、肿瘤药物相关基因和病毒基因等[3]。 目前基因治疗的方式(type of gene therapy)主要有3种：①基因矫正或置换：即对缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，或以正常基因原位置换异常基因，因此不涉及基因组的任何改变。②基因增补：不去除异常基因，而是通过外源基因的导人，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能。③基因封闭：有些基因异常过度表达，如癌基因或病毒基因可导致疾病，可用反义核酸技术、核酶或诱饵转录因子来封闭或消除这些有害基因的表达[4]。 2基因诊断应用 2.1基因诊断新生儿脊髓性肌萎缩 目前报道有一些较严重的SMA I型患儿会出现关节挛缩、骨折、呼吸困难和感觉神经元受损的表现，但机制还不清楚，可能与5ql3缺失大小有关。SMA尚无特异的治疗方法，临床主要是对症治疗，如早期发现SMA患儿呼吸系统受累并干预性通气治疗可以延长疾病的病程、改善患儿生活质量、减少肺部继发性感染及呼吸衰竭发生。本例患儿经抗炎、吸氧、吸痰、补充维生素、给予丙种球蛋白等对症治疗和支持治疗，呼吸困难逐渐缓解，双肺痰鸣音减少，但最终家长考虑远期预后不良而放弃治疗[5]。 最近，在体外实验研究中发现丁酸纳、丙戊酸和Htra—ISl的调节因子可以增加SMN2基蛋白的作用，而且对细胞几乎没有毒性作用，但研究工作还处于动物实验阶段，没有正式应用于临床，该类药物可能为SMA的治疗开辟了新的途径[5]。 2.2早期胰腺藩的基因诊断 近年来，胰腺癌的发病率和死亡率呈逐渐上升趋势，每年有新发病例约20万人，占全部恶性肿瘤发病的2％。其发病匿，早期缺乏特异表现，恶性程度高，极易出现转移，80％-90％的胰腺癌病人就诊时，已经到了晚期，手术切除率只有15％，年生存率为1％-5％。而早期胰腺癌的手术切除率为90-100％，5年生存率可达70％- 100％。另有研究表明，肿瘤的大小是重要的生存率预测因子，如果直径 第2节基因诊断与基因治疗 (时间：30分钟满分：50分) 难度及题号 考查知识点及角度 基础中档稍难 基因诊断 2 1 基因芯片3、7 4 基因治疗5、6 8 一、选择题(共6小题，每小题4分，共24分) 1．用DNA探针诊断疾病的具体方法是()。 A．与被测样品的DNA碱基序列做比较 B．与被测样品的DNA分子重组 C．与被测样品的DNA分子杂交 D．A、B、C三种方法均可 解析基因诊断是指用标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理， 与待测样品DNA杂交，从而推测待测DNA序列。 答案 C 2．对某些传染性疾病(例如SARS)的诊断的困难在于病原体数量在初期极少，因此稳定、可靠而快捷的检测手段是()。 A．病毒的大量培养B．患者体内相关抗体的检测 C．PCR技术扩增D．临床症状确诊 解析对于病原体数量极少的待测样本，可利用PCR技术，对待测核酸进行 PCR技术扩增，获得大量核酸。 答案 C 3．基因芯片()。 A．是计算机上的微处理器 B．只能少量地对DNA分子的碱基序列进行测定和定量分析 C．是将少量DNA片段有序地固定在尼龙膜、玻片或硅片上 D．是一种高密度的DNA阵列 解析基因芯片是将大量特定序列的DNA片段(探针)有序地固定在尼龙膜、 玻片或硅片上，从而能大量、快速、平行地对DNA分子的碱基序列进行测 定和定量分析。基因芯片实际上是一种高密度的DNA阵列。 答案 D 4．下列对基因芯片的叙述中，错误的是()。 A．基因芯片可直接检测样品DNA和RNA B．基因芯片技术依据DNA分子杂交原理 C．基因芯片技术有助于发现不同个体对疾病易感性的差异 D．基因芯片技术不会造成社会负面效应 解析基因芯片技术也会造成负面效应，如基因歧视所引发的社会问题；婚姻、就业、保险等方面受到不公平的待遇；侵犯隐私权；对自己的心理、生活带来许多压力等。 答案 D 5．基因治疗的步骤是()。 ①治疗基因的表达②选择治疗基因③将治疗基因转入患者体内④选择 运输治疗基因的载体 A．②③①④B．②③④① C．③④②①D．②④③① 解析基因治疗的步骤包括选择治疗基因、选择运输治疗基因的载体、将治疗基因转入患者体内、治疗基因的表达。 答案 D 6．对基因治疗安全性的问题叙述不当的是()。 A．基因治疗中最常用的载体是病毒，它们能自我复制 B．在基因治疗中，科学家抑制逆转录病毒的某种活动防止它们引起疾病，使之能被安全地使用 C．使用病毒载体运载基因，它们可能更多地改变目标细胞 D．目的基因插入载体DNA的位置可能出现错误，导致癌症和其他损伤的产生解析基因治疗中最常用的载体为病毒，大多数基因治疗临床实验用小鼠逆转录病毒运送目的基因，其他病毒载体还包括腺病毒、痘病毒和疱疹病毒等。 QIAGEN EpiTect? Bisulfite ?重亚硫酸盐处理DNA时， 需要经高盐浓度、高温和低PH 条件，会导致DNA断裂和片段 化，并在随后的纯化过程中丢 失，所以需要大量的input DNA ?重亚硫酸盐转化未甲基化 的胞嘧啶，转化率超过99% ?Bisulfite Mix 足够做8个 反应，用时要将Bisulfite Mix 溶于800μl RNase-free water中， 溶解的Bisulfite Mix 在-20℃可 以保存4周 ?DNA Protect Buffer 能保 护重亚硫酸盐处理的DNA在高 温、低ph条件下被片段化 ?Carrier RNA 能提高小量 DNA（小于500pg，体积大于 40μl）绑定在回收柱滤膜上的 效率，帮助核酸沉淀；总量大 于100ng的基因组DNA没有必 要加Carrier RNA ?EpiTect Bisulfite Kit 在-20℃ 可以保存3年；可以适用于大 范围的DNA量，input DNA范 围为1ng~2μg；模板DNA片段 范围可以在500bp~30kb之间 DNA量在1ng~2μg之间，体积20μl以上 开始前的准备重点： ?Bisulfite Mix 足够做8个反应，如果样本少于8个，可以把溶解的Bisulfite Mix 保存于-20℃，4周内并不会影响其性能 ?DNA Protect Buffer在加入DNA–Bisulfite Mix后会由绿变蓝（step 2），表明溶液混合很充分且PH值正确 ?所有的离心分离步骤均在室温（15–25°C）下完成 开始前准备的东西： ?加入30ml乙醇（96%~100%）到Buffer BW中，室温（15–25°C）保存，使用之前摇匀?加入27ml乙醇（96%~100%）到Buffer BD中，2~8℃保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响Buffer BD的性能，但是还是要避免将沉淀吸到回收柱中。 ?加入310μl RNase-free water到冻干的carrier RNA（310 μg）中，配成1 μg/μl的溶液。当一次处理48个样本，将溶解的carrier RNA加入到Buffer BL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖标签。如果处理的样本较少，则将溶解的carrier RNA分装，并储存于-20℃，分装的carrier RNA能保存1年。如果少于48个样本要在2周之内完成处理，则参照表1的体积比取一定体积的Buffer BL与carrier RNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrier RNA。如果Buffer BL有沉淀，则需加热（最高不超过70℃）并温和搅拌使其溶解。 表1 Buffer BL与carrier RNA的体积比 ?室温平衡样本和Buffers 基因诊断的概念 一、基本概念： 1．人类的绝大多数疾病都与基因有关，基因变异引起疾病两种类型： ①内源基因变异：由于先天遗传和后天内外环境因素的影响，人类的基因结构及表达的各个环节都可发生异常，从而导致疾病。分基因结构突变和表达异常。 ②外源基因的入侵：各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖引起各种疾病。基因改变引起各种表型改变，从而引起疾病，从基因水平探测分析病因和疾病的发病机制，并采用针对性的手段矫正疾病是近年基础和临床的方向。 ２．基因诊断：利用现代生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 二、基因诊断的特点： 1．以基因做检查材料和检查目标针对性强； 2．分子杂交选用特定基因序列作探针，故特异性强； 3．分子杂交和PCR具有放大效应，故有较大的灵敏度； 4．适用性强，诊断范围广。 基因诊断的常用技术 一、核酸分子杂交： 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹杂交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。 （一）核酸分子杂交的基本过程： ①DNA或RNA的制备：将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。 ②制备探针； ③杂交； ④检测。 1．DNA或RNA的制备：将待测样品用一定方法提取DNA或RNA。 2．基因探针的概念： ①基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。 ②探针的来源： DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNA 探针（cDNA probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段，称为寡核苷酸探针。 ③探针的制备： 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组DNA打断，或用限制性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠杆菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。 为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。 寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。 ④探针的标记： 第十八章遗传病的诊断 遗传病诊断是一项复杂的工作，需要多学科的密切配合。遗传病的诊断包括常规诊断和特殊诊断。常规诊断指与一般疾病相同的诊断方法，特殊诊断是指采用遗传学方法，包括染色体检查，家系分析等，是遗传病确诊的关键。目前，临床上遗传病诊断包括：临症诊断、症状前诊断（presymptomatic diagnosis）、出生前诊断和植入前诊断。 第一节临症诊断 临症诊断（symptomatic diagnosis）是根据患者的各种临床表现进行分析，确诊并判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。 一、病史、症状和体征 （一）病史 遗传病大多有家族聚集倾向，因此病史的采集非常重要。在采集病史时要准确、详尽。另外还要收集病人的家族史、婚姻史和生育史等相关信息。遗传病史的采集比其他疾病更重要，因为遗传病的家族聚集性和其传递的规律性决定了病史采集可能会获得更有用的信息，对后续的分析工作可能会有很大的帮助。病史采集的关键是材料的真实性和完整性。病史采集，主要是通过采集对象的描述和有关个体的病案查询工作来完成。实践中还应注意不同个体描述是否可以相互印证，以确定资料的可信度。对于发病原因、过程、时间、地点、治疗情况等也应详细记录。 （二）症状与体症 遗传病除了具有其他疾病相同的体征外，还有特异性征候群，这些都为初步诊断提供线索。大多遗传病在婴儿和儿童期有相应的体征 和症状，如Down综合征患儿的特殊面容和智力低下等，当然还需要通过染色体检查进一步确诊。 二、家系分析 根据对患者及家族成员发病情况的调查结果绘制系谱，确定单基因病或多基因病，遗传方式等。系谱分析时应注意：系谱的完整性和准确性；单基因遗传病的分析非常有用，常染色体显性遗传病、常染色体隐性遗传病，X连锁显性遗传病，X连锁隐性遗传病，Y连锁遗传病。单基因遗传分析中要注意外显不全，延迟显性，显、隐性的相对性，新的突变产生，遗传印记，动态突变，以及遗传异质性等问题，避免判断上的错误和发病风险的错误估计。 线粒体遗传病通过母系遗传，主要特点是晚发，进行性。多基因病是一大类常见的疾病，有家族聚集倾向，但不遵循孟德尔分离规律。以往被认为是多基因病的一些疾病，一部分被证明是遗传异质性所致，即受单个主基因决定，如癫痫，先天性心脏病和先天性巨结肠等。 三、细胞遗传学检查 细胞遗传学检查染色体检查或核型分析，是辅助诊断和对染色体病确诊的主要方法。随着显带技术的应用，特别是高分辨染色体显带技术的发展，能够更准确地发现和确定更多的染色体数目和结构异常，并发现新的微小畸变综合征。利用染色体显带技术，可以对许多疾病在染色体水平找到原发性改变，如肿瘤，发育缺陷、心血管疾病等，把疾病相关基因确定在一个较小的范围内。 染色体原位杂交是应用标记的DNA片段（探针）与玻片标本上的细胞、染色体，以及间期的DNA或RNA杂交，研究核酸片段的位置、相互关系的技术。一般用生物素、地高辛等标记探针，原位杂交后，用荧光染料标记的生物素亲和蛋白、抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和杂交信号放大，使探针杂交的区域发出荧光，这种原位杂交称 实验一试剂盒方法提取基因组DNA和质粒DNA 黄华如 （生命科学学院，生技091，29号） 摘要：实验用试剂盒方法提取nchpzh008植物DNA组，本组可以在电泳图谱中清晰看到DNA条带，而在用不同引物组合来对DNA进行PCR，在聚丙烯凝胶电泳图谱中可以看到，引物组合me4em3、me5em2、me5em3对植物DNA使比较好的，这些引物组合可以用在不同物种的遗传特性分析。利用柱式试剂盒提取PUC18和500bp质粒DNA，其中1-3组提取PUC18，4-6组提取500bp质粒DNA。结果是提取PUC18质粒DNA的同学没能将质粒提取出来，而提取500bp的全部都可以提出来。说明了PUC18质粒没有成功转化大肠杆菌，而500bp则转进了大肠杆菌。 关键词：试剂盒；DNA基因组；PCR技术；质粒DNA 植物细胞通常有三套基因组，即染色体基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组，其对应的DNA分别称为基因组DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。植物细胞的总DNA中95%以上是基因组DNA，而且在常规提取条件下，mtDNA和ctDNA因裸露存在，没有蛋白质的保护，会由于提取缓冲液中酸、碱的水解而丢失。 质粒是存在于细菌细胞中的染色体外小分子DNA，一般呈双链闭合环状，能自我复制和垂直遗传，并赋予宿主细胞一些新表性，但质粒的存在对细胞本身的存在并不是必需的。质粒本身或经过一定改造后的质粒常被用作基因载体，将外源基因带入受体细胞中复制和扩增，甚至表达。质粒有严谨型和松弛型之分，基因工程研究中所用的质粒主要是松弛型质粒，或是经过遗传修饰的人工质粒。 DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下，不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、单宁等物质与DNA会结合成粘稠的胶状物，获得的DNA常出现产量低，质量差、易降解，影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。用试剂盒方法提取DNA组是一种比较方便和高效的方法。 1 材料与方法 1.1 试供材料 nchpfszh004、nchpfzh01101、nchpfzh01102、农场和平1号、nchpzh021、nchpzh008、大肠杆菌 1.2 试剂配制 氯仿、异丙醇、Tris、Hcl、EDTA、75%乙醇、灭菌水、TBE缓冲液、硼酸、PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、琼脂糖等 1.3 实验设备及用具 高速冷冻离心机、液氮罐、恒温水浴锅、紫外分光光度计、制冰机、冰箱、移液枪、PH 计、冰盒、恒温培养箱、恒温振荡摇床、高压灭菌锅、恒温水浴锅等。 1.4 试剂盒方法提取DNA组步骤 1)65℃预热柱式植物DNAout溶液A，使其沉淀融化，充分混匀，取0.75ml加入到5ml 第三代试管婴儿 P G S P G D基因筛查诊断 技术 内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128） 第三代试管婴儿PGS/PGD基因筛查诊断技术 第三代试管婴儿PGS/PGD基因筛查诊断技术的出现，为众多有家族遗传病史的患者带来了希望，第三代试管婴儿先进的基因筛查诊断技术不仅可以对家族遗传病筛查，也可以为大龄夫妇诊断染色体是否有异常，。第三代试管婴儿技术的好处在于，能为各种原因引起的染色体异常提供精确的检测，从根源上防止了宝宝先天性疾病的发生，现在第三代试管婴儿技术已经得到较广泛的应用，但是值得一提的是，第三代试管婴儿技术最先进的是美国，例如在美国梦美（HRC）生 殖医疗中心，可以筛查出125种遗传病，这是其他国家的水平所达不到的。 为了解决这一社会难题，一直工作在不孕不育和试管婴儿领域的专家们，在原有的第一代常规试管婴儿(IVF-ET)和第二代单精子注射技术(ICSI)的基础上拓展了试管婴儿的应用领域：第三代试管婴儿胚胎植入前遗传学筛查诊断(PGS/PGD)应运而生。看到这里，您是否有“千呼万唤始出来”的感觉，但它并不是“犹抱琵琶半遮面”。PGS/PGD基因筛查诊断在保证宝宝出生后健康方面上成效是巨大的。美国梦美（HRC）能对125种遗传学疾病做出最准确的判断。 试管婴儿助孕技术简单地说就是把精子和卵子取出体外，在体外使精卵结合形成受精卵，把受精卵培养至第五天对胚胎进行PGS/PGD遗传学疾病筛查诊断，该数据会帮助医生选择染色体数目和结构正常的胚胎移植到母体内，淘汰遗传学非正常胚胎。然后将健康的胚胎移植到女性子宫内着床、妊娠，并发育成胎儿，怀孕十月，最后成功分娩。那么，试管婴儿PGS/PGD遗传病筛查诊断是怎么做到鉴定胚胎的健康与否的呢? 美国梦美（HRC）专家说，一个健康的卵细胞含有46个染色体，排列成23对，但在卵细胞受精之前，先要进行一次减数分裂，每对染色体一分为二，其中最新高中生物(人教版)同步习题：1-2基因诊断与基因治疗(选修2)及答案解析
QIAGEN DNA甲基化试剂盒说明中文版
基因诊断常用技术与应用
第18章遗传疾病的诊断
实验1试剂盒方法提取基因组DNA组和质粒DNA
第三代试管婴儿PGSPGD基因筛查诊断技术
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