主题：Western Blot（蛋白质印迹法）
概述：
蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
目的：
获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
原理：
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
步骤：
1.提取组织或细胞蛋白；
2.测定蛋白质浓度；
3.电泳：
电泳条件为：恒压100V，待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止
（约120min）；
4.电转膜仪转膜：
转膜条件为：恒流250mA ，2h（时间可根据目的蛋白分子量适当调整）；
5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭1h；
6.加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜；
7.收一抗，PBST洗膜3次，10min/次；
8.二抗孵育：
室温孵育1h，所用二抗的比例和种属见步骤9）表格。
9.洗膜：PBST洗膜2次，PBS洗膜一次，10min/次。
10.显色
流程图：
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤： n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。 1．培养细胞或药物处理。 2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。 3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep管。注意：冰上操作。 4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5．煮沸样品5 minutes。 6．离心12000g, 5 min，取上清。 7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。 注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法） 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
WJQ 2014.6 Western Blotting 1.以70%的ethanol擦拭glasses 2.Glasses（大、小）置于固定架中、调整水平、lock、置支撑架、lock 3.Add ddH2O to check glasses 是否有漏（Filter paper吸干水） 齿梳用70%EtOH喷洗，纸巾擦干（桌面铺上纸巾） 4.视Sample的大小决定Separating gel的浓度（一片约3-4ml所以配5ml） 5.Formula 10% saparating 加1ml 2-propand／片压平，从中间加，向两边移动 Seperating gel 凝固后（要充分一些≥1h）倒掉2-propand，用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干 6.protein sample 95~100℃煮沸3~5min，冰置 7.取一定数量（20~60ul)protein, loading,同时需loading Marker作对照 8.Run at 60~80v(浓缩胶)，then换成100~120v（分离胶）
9.准备正好大小的滤纸和膜（NC或PDVF膜）用转印buffer浸透 10.分开玻璃板，取出gel，将浓缩胶弃掉，用蒸馏水漂洗gel 准备三明治： 11.恒流260mA 70min 冰浴 12.结束后，取出膜用G250漂洗5秒钟，蒸馏水脱色，看是否有气泡 13.Blocking （10ml blocking buffer：5% milk 用1xTBST配制） RT shake 1h 14.Discard blocking buffer，add 10ml 一抗 4℃作用1h（亦可RT shake1h） PBS（或5% milk）10ml加10ul一抗（稀释1000倍） 15.Discard一抗，ddH2O wash，Add TBST wash 10min 3 times（shake） 16.Add 10ml二抗RT shake 1h 10 ml blocking buffer加2ul二抗（稀释5000倍） 17.Discard 二抗 TBST wash 10min 3 times（shake） 18.2ml／membrane的ECL substrate（1mlA+1mlB)染色1-2min 19.将membrane以袋子夹，贴上Marker 20.压片10s 30s 1min 2min 一、蛋白质的样品制备： 1.取贴壁培养的细胞，弃培养基； 2.用预冷的PBS洗2遍，吸净PBS； 3.每按照300uL/10-cm dish加入预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用细 胞刮收集细胞到干净EP管中；(裂解液用量根据细胞数调整) 4.快速振荡10-20s，冰上放置10 分钟，重复2-3次； 5.12000×g，4℃离心10分钟，将上清转移到新的干净EP管中，即为蛋白样
【实验目的】 了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。 如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。 2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系
统和125I标记系统。 【实验操作】 ⒈.蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。 分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。 ⒉.电转移 ⑴准备PVDF膜
万方数据
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蛋白质免疫印迹技术的实验研究 作者：张燕婉， 叶珏， 时那， 孟宪敏， 王来元， ZHANG Yan-wan， YE Jue， SHI Na， MENG Xian-min， WANG Lai-yuan 作者单位：中国医学科学院,阜外心血管病医院中心实验室,北京,100037 刊名： 实验技术与管理 英文刊名：EXPERIMENTAL TECHNOLOGY AND MANAGEMENT 年，卷(期)：2008,25(10) 被引用次数：21次 参考文献(9条) 1.郭尧君蛋白质电泳实验技术 2006 2.Nieman T Detection based on solution-phase chemiluminescence systems 1989 3.李晓军,秦浚川,武建国蛋白印迹技术研究进展[期刊论文]-临床检验杂志 2004(3) 4.Towbin H;Staehelin T;Gordon Electrophoretic franker of proreins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets.Procedure and some appHcations 1979(76) 5.Hauri H P;Bucher K Immunoblotting with monodonal antibodities:Importance of the blocking solution 1986(159) 6.高红,王贵新,王维林,张可仞用蛋白印迹技术初步评价肝母细胞瘤血管内皮生长因子表达的意义[期刊论文]-中华小儿外科杂志 2006(2) 7.Towbin H;Gordon J Immunoblotting and dot immunobinding:current status and outlook 1984(72) 8.Tovey ER;Baldo BA Characterisation of allergens by protein blotting 1987(08) 9.沈关心;龚非力抗体技术实验指南 2006 本文读者也读过(1条) 1.段勇.黄韬.袁育林.刘华.李娅.金克炜.DUAN Yong.HUANG Tao.YUAN Yulin.LIU Hua.LI Ya.JIN Kewei蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达[期刊论文]-检验医学2009,24(1) 引证文献(7条) 1.秦双立,徐玥蛋白质印迹法在氟中毒研究中的应用[期刊论文]-山东化工 2015(13) 2.马瑛,马明,沈辉,骆新荣,高庆华不孕奶牛宫颈黏液相关ASA免疫印迹分析[期刊论文]-中国奶牛 2013(06) 3.程娜娜,韩榕He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管蛋白的影响[期刊论文]-激光生物学报 2013(04) 4.刘娇,华碧春,黄智锋蛋白表达检测技术在中药肝损伤机制研究中的应用进展[期刊论文]-浙江中医药大学学报2013(04) 5.韩继美胶体金免疫层析法对AFP、CEA和FN的快速检测[学位论文]硕士 2009 6.黄斌芳c-Jun基因启动子区的遗传变异与肺癌易感性的研究[学位论文]硕士 2012 7.程娜娜He-Ne激光和增强UV-B辐射对拟南芥叶片微管结合蛋白MAP65-1的影响[学位论文]硕士 2014 引用本文格式：张燕婉.叶珏.时那.孟宪敏.王来元.ZHANG Yan-wan.YE Jue.SHI Na.MENG Xian-min.WANG Lai-yuan 蛋白质免疫印迹技术的实验研究[期刊论文]-实验技术与管理 2008(10)
蛋白印迹——Western blot 实验流程及注意事项 各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。 实验步骤 1.配制分离胶5ml（配方见图1）； 2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不 要产生气泡）； 3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了， 影响电泳效果。注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）； 4.大约1第二天一早配制堆积胶）， 5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子； 6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）； 7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液； 8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋 白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量； 9.在电泳槽中加入电泳缓冲液； 10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根 据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。）；
577 ※专题论述食品科学 2007, Vol. 28, No. 08能还需加强，这些都有待进一步研究。使用该系统会提高企业的生产成本，对企业的生产经营管理提出了更高的要求。提高生产管理水平，提高操作人员素质，保证数据的真实有效性。 参考文献： ［１］杨天和， 褚保金． “从农田到餐桌”食品安全全程控制技术体系研究［Ｊ］． 食品科学， ２００５， ２６（３）： ２６４－２６８． ［２］林凌， 周德翼， 黄启强． 基于互联网的食品质量安全可追踪系统设计［Ｊ］． 合肥工业大学学报： 自然科学版， ２００５， ２８（５）： ５４６－５４９．［３］林凌， 周德翼． 构筑食品质量安全可追踪系统研究［Ｊ］． 商业研究，２００５， ２１： ４１－４４．［４］张向前， 徐幸莲， 周光宏． 可追溯系统在牛肉产业链中的应用［Ｊ］．畜牧与兽医， ２００６， ３８（６）： ３０－３２．［５］ ＤＡＶＩＳ Ｊ Ｒ， ＤＩＫＥＭＡＮ Ｍ Ｅ． Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｂｅｅｆ ｃａｒａｓｓ ｔｒａｃｅａｂｉｌｉｔｙｉｎ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｂｅｅｆ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２ （ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）： ４７－４８．［６］ ＰＥＴＥＲＳＥＮ Ｂ， ＫＮＵＲＡ ＤＥＳＺＣＺＫＡ， ＰＯＮＳＧＥＮ ＳＣＨＭＩＤＴ Ｅ， ｅｔａｌ． Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｓｅｄ ｆｏｏｄ ｓａｆｅｔｙ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｌｉｖｅ－ｓｔｏｃｋ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００２， ７６： ２０７－２１３．［７］ 邹晓文． 法国的牛肉全程跟踪管理［Ｊ］． 河南畜牧兽医， ２００３， ２４（１）： 收稿日期：２００７－０６－１７ 作者简介：秦红（１９６０－），女，副教授，研究方向为动物食品质量与安全。 蛋白质印迹技术研究进展及应用前景 秦 红１，韩剑众 ２（１．常熟理工学院，江苏 常熟 ２１５５００；２． 浙江工商大学食品质量与安全系，浙江 杭州 ３１００３５）摘 要：分子印迹技术是集高分子合成、分子识别及仿生生物工程等众多学科发展起来的新型技术，是生物、食品、环境等众多领域研究的热点。本文主要介绍了蛋白质印迹技术的识别机理和国内外研究进展，探讨了蛋白质印迹技术体系中存在的主要问题及应用前景。关键词：分子印迹技术；蛋白质；研究进展 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ Ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＱＩＮ Ｈｏｎｇ１，ＨＡＮ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｎｇ２ （１．Ｃｈａｎｇｓｈｕ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｓｈｕ ２１５５００， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｇｏｎｇｓｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３５， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ （ＭＩＴ） ｉｓ ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｂｌｅｎｄ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｉｏｎｉｃ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ ｆｉｅｌｄｓ． Ｉｔ ｉｓ ａ ｈｏｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｓｓｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｙ， ｆｏｏｄａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｈｏｍｅ ａｎｄ ａｂｒｏａｄ， ａｎｄ ｄｉｓｃｕｓｓｅｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｏｆ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ；ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ 中图分类号：Ｑ８１６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００７）０８－０５７７－０４４５． ［８］澳大利亚建立畜产品原产地跟踪标签制度［ＥＢ／ＯＬ］． ｈｔｔｐ： ／／ ｎｅｗｓ． ｘｉｎｈｕａｎｏｔ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓｃｅｎｔｅｒ／２００２－０７／０８／ｃｏｎｔｅｎｔ＿４７３９１４．ｈｔｍ．［９］ ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｋ， ＳＴＩＴＴ Ｊ， ＫＥＬＬＡＲ Ｊ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｃｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｃａｔｔｌｅａｎｄ ｓｍａｌｌ ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎａｄａ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，２００１， ２０（２）： ５１０－５２２． ［１０］杨信廷， 钱建平， 孙传恒， 等． 面向安全追溯体系的农产品电子档案管理系统［Ｊ］． 中国农学通报， ２００６， ２２（６）： ４４１－４４４． ［１１］陆昌华， 王立方， 谢菊芳， 等． 工厂化猪肉安全生产溯源数字系统的设计［Ｊ］． 江苏农业学报， ２００４， ２０（４）： ２５９－２６３． ［１２］白云峰， 陆昌华， 李秉柏． 肉鸡安全生产质量监控可追溯系统的设计［Ｊ］． 江苏农业学报， ２００５， ２１（４）： ３２６－３３０． ［１３］昝林森， 郑同超， 申光磊， 等． 牛肉安全生产加工全过程质量跟踪与追溯系统研发［Ｊ］． 中国农业科学， ２００６， ３９（１０）： ２０８３－２０８８．［１４］陈联诚， 王二卫， 陈连岳． 工厂化蔬菜生产管理系统的设研制［Ｊ］． 农业工程学报， ２０００， １６（２）： １３５－１３７． ［１５］陈青云， 李鸿． 黄瓜温室栽培管理专家系统的研究［Ｊ］． 农业工程学报， ２００１， １７（６）： １４２－１４６． ［１６］李志红， 沈佐锐， 杨铭华． 北京市蔬菜生产管理信息系统ＢＪ－ＣＡＢＢＡＧＩＳ的研制［Ｊ］． 中国农业大学学报， １９９９， ４（３）： ４８－５２．［１７］于辉， 安玉发． 在食品供应链中实施可追溯体系的理论探讨［Ｊ］． 农业质量标准， ２００５（３）： ３９－４１．
蛋白印迹法（Western-blot） 一、基本原理 细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。 本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。 Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS—PAGE）法分离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和?-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。
分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱. Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。 二、器材 电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml） 三、试剂配制： 1）、1.5M Tris—Hcl, pH8.8：18.16g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100 ml，4℃保存。 2）、1.0M Tris—Hcl, pH6.8：12.12g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100 ml，4℃保存。 3)、10％SDS：10g SDS溶于90 ml ddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水
蛋白质印迹分析实验原理与操作步骤 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或 多克隆抗体进行识别。 关键词:印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹Westernｂlottinｇimmunoblotｔiｎg免疫印迹法蛋白质 印迹法 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法,这就是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质得免疫化学技术方法。待测蛋白既可以就是粗提物也可以经过一定得分离与纯化,另外这项技术得应用需要利用待测蛋白得单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示,可溶性抗原,也就就是待测蛋白首先要根据其性质,如分子量,分子大小,电荷以及其等电点等采用不同得电泳方法进行分离;通过电流将凝胶中得蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上;利用抗体(一抗)与抗原发生特异性结合得原理,以抗体作为探针钓取目得蛋白。值得注意得就是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白,如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜得非特异性结合。 经电泳分离后得蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用得两种电转移方法分别为: １。半干法: 凝胶与固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿得滤纸之间,通电时间为1０分钟~３０分钟。 2.湿法:凝胶与固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中,转移时间可从45分钟延长到过夜进行、由于湿法得使用弹性更大并且没有明显浪费更多得时间与原料,因此我们在这里只描述湿法得基本操作过程。 对于目得蛋白得识别需要采用能够识别一抗得第二抗体。该抗体往往就是购买得成品,已经被结合或标记了特定得试剂,如辣根过氧化物酶。这种标记就是利用辣根过氧化物酶所催化得一个比色反应,该反应得产物有特定得颜色且固定在固相载体上,容易鉴别。因此可通过对二抗得识别而识别一抗,进而判断出目标蛋白所在得位置。其她得识别系统包括碱性磷酸酶系统与125I标记系统、 1。实验器材 ＳDＳ／PAGE实验相关材料;电转移装置;供电设备;PＶDＦ膜(Millipore Imｍoｂion－Ｐ# IPVH0０010);Ｗhａtmａn 3MM 纸;其她工具:镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。
Western blot实验报告 摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文 结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白 Western blot test report Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer Results: see below Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 1 试剂与仪器 1.1 试剂（所有试剂均供两组用） 1.1.1 8%电泳分离胶的配制 H2O 6.9ml
蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴
原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色
蛋白质印迹（Western blot）实验方案 溶液和试剂 裂解缓冲液 这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液 150 mM NaCl 1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液） 150 mM NaCl 1.0% NP-40 或0.1% Triton X-100 0.5% 脱氧胆酸钠 0.1% SDS（十二烷基硫酸钠） 50 mM Tris-HCl pH 8.0 蛋白酶抑制剂 Tris-HCl 缓冲液 20 mM Tris-HCl pH 7.5 蛋白酶抑制剂 电泳、转膜、封闭缓冲液 Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液 4% SDS 10% 2-巯基乙醇 20% 甘油 0.004% 溴酚蓝 0.125 M Tris-HCl 测定 pH 并调节至 pH 6.8。 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 0.1% SDS 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。 转膜缓冲液（湿转） 25 mM Tris 碱 190 mM 甘氨酸 20% 甲醇 测定 pH，pH 应为约8.3。必要时进行调节。 对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。 转膜缓冲液（半干转）
48 mM Tris 39 mM 甘氨酸 20% 甲醇 0.04% SDS 封闭缓冲液 5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白） 加入 TBST 缓冲液中。混匀并过滤。过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。 实验步骤 样品裂解 1. 制备细胞培养物裂解物 .将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。 .吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。 .用预冷的塑料细胞刮棒刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬浮液转移至预冷的微量离心管中。 .在4 ℃下持续搅拌 30 分钟。 .在4 ℃预冷的离心机中以16,000 × g 的转速离心20 分钟。 .轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中，弃去沉淀。 2. 制备组织裂解物 .用干净的工具切取目标组织，此操作最好在冰上进行，并且应尽快完成，以防止样品被蛋白酶降解。 .将组织置于圆底微量离心管或Eppendorf 管中，并浸入液氮中进行“速冻”。将样品保存在-80 ℃下以备后续使用，或放置在冰上直接进行匀浆。对于约5 mg 的 组织，向离心管中快速加入约300 μL 裂解缓冲液，然后用电动匀浆器进行匀浆， 用另外300 μL 裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4 ℃下持续搅拌（例如，在回 旋振荡器上）2 小时。 . 4 ℃下在微型离心机中以16,000 × g 离心20 分钟。轻轻地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。弃去沉淀。 样品制备 .取出小部分(50 μL) 裂解物，用于蛋白分析。确定每种细胞裂解物的蛋白浓度。.向剩余体积的细胞裂解物中加入等体积的2× Laemmli 样品缓冲液。我们推荐采用以下方法来还原样品和使样品变性，除非在线抗体数据表指明应使用非还原和非变性条件。
蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 已有2975 次阅读2008-6-19 10:43 |个人分类:生活点滴 蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 抽滤 抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。 点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。 另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。 当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面： 去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。 样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。 含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。而粘性样品要用缓冲液稀释。 Western印迹 Western印迹含一系列步骤，包括： ?? 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。 ?? 将胶上的蛋白转移到膜上。 ?? 鉴定膜上特定蛋白。 下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。 用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物 印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维（1-D）SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。 二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。 分子量标准 在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。 聚丙烯酰胺浓度 凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推
蛋白质印迹分析实验原理和操作步骤 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多 克隆抗体进行识别。 关键词：印迹蛋白质步骤蛋白质印迹分析蛋白质印迹Westernblottingimmunoblotting免疫印迹法蛋白质印迹 法 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。 2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。 1. 实验器材
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤 一、组织的研磨 准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。 ②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织 呈干粉状。 ③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋， 于-80℃保存。 注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。 2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。 二、裂解提蛋白 准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1 若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂） 步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。 ②盖好盖子，在冰上裂解30~40min. ③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃ 保存。 注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。 三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒） 准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床 步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA 工作液。 ④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μl BCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。 ⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度 可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。 注意：1.标准曲线一般做两组，取最好的标准曲线计算。 2.蛋白浓度=（蛋白含量/总体积）×稀释倍数[μg/μl] 3.保证样品液中的蛋白含量相同（500μg/100μl）,则取10μl样品液中含有50μg蛋白。 4.样品液稀释液要再沸水浴中煮10min（可用微波炉加热），放凉至室温后于-20℃保存。 四、SDS-PAGE蛋白质电泳 (一)、配胶 准备：凝胶液各成分、电泳板、制胶架、梳子 步骤:①选择适合电泳板（0.75mm:1.0mm:1.5mm），用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗，将玻璃板夹入玻璃板夹，注意底部对齐，夹好后卡到制胶架上。 ②首先配制分离胶（一般用12%的SDS-PAGE分离胶），按分离胶配方配制，配胶时最后加APS和TEMED，迅速混匀，注意减少气泡的产生。 ③将配好的分离胶迅速加入玻璃板之间至梳子下约1cm处（绿色线处），不要有气泡。灌好胶后用蒸馏水覆盖胶层，加满蒸馏水至玻璃板顶端，以利于丙烯酰胺的聚合。室温静置约30min至胶层与水层检出现明显界限。若室温过低可将其置于37℃烘箱中。 ④配制浓缩胶（5%的Arcymalide浓缩胶），混匀，注意减少气泡产生。 ⑤带分离胶聚合后，倒掉上层水，将混匀的浓缩胶沿玻璃板壁小心加在分离胶上至较短玻璃板顶端，插好梳子，不能有气泡，室温静置20~30min至凝胶聚合。 注意：1.夹好玻璃玻璃板后用水检查其是否漏水。 2.12%分离胶配方：