凝胶法测内毒素
1)实验原理:
本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。
制备供试品需根据灵敏度λ确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：
MVD=c L/λ
其中医用级透明质酸的内毒素限度为0.5EU/mg
2)实验方法
使用的是湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂盒——灵敏度为λ=0.125-0.25EU/ml.选择λ=0.25EU/ml，孵育时间25分钟的使用方法
1，制备供试液
将所检医用级透明质酸样品配成c=1mg/ml的溶液S0待用，根据灵敏度λ=0.25EU/ml，L=0.5EU/mg,求得最大稀释倍数MVB=cL/λ为2。用水将S0稀释至2倍得供试液
2，制备内毒素溶液：取内毒素检测用水（ETW）及工作标准内毒素（CSE）各一支，开启，
按分析报告书标示价加入0.8ml的ETW复溶CSE,然后在漩涡混合器上混合2-3分钟，得到5EU/mL的CES溶液（E5）
3,检查方法：从试剂盒内取出TAL8支，开启，按下述方法设置检查项目及加样：
如果选择灵敏度λ=0.125EU/mL，应加0.01 mLE5，孵育30+1分钟
加样完毕，轻轻摇匀反应试管中的混合液，把试管置37+0.50C的恒温器中孵育25+1分钟，取出按凝胶法判断反应结果阴性（--）或阳性（+），记录反应结果。
当NC管阴性，PC管管阳性时，试验有效。此时如果S两管为阴性，表明S的内毒素含量少于0.25EU/mL；如果S两管为阳性，表明S的内毒素含量多于0.25EU/mL,已超过该供试品的内毒素限值；
4.结果分析：
将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转1800.若管内形成的凝胶，并且不变形，不从管壁滑落者为阳性；
未形成凝胶或形成的凝胶，变形并从管壁滑落者为阴性（保温和拿取试管过程中应避免受到震动造成假阴性结果）
3.实验结果
试验操作人试验时间
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
显色基质鲎试剂盒使用说明(终点显色法，含偶氮化试剂) 货号：T7571 保存：阴凉处，最佳2-8℃，避光贮存。 产品内容： 细菌内毒素工作品，5支 鲎试剂， 1.7ml/支，5支 显色基质，1.7ml/支，5支 偶氮化试剂1，10ml/支，5支 偶氮化试剂2，10ml/支，5支 偶氮化试剂3，10ml/支，5支 HCl(反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶 细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，3瓶 用途： 显色基质鲎试剂(Chromogenic End-point TachypleusAmebocyte Lysate，CE TAL)用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。 原理： 鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。在一定时间内，pNA 的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。 同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax=545nm），避免了供试
品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。 检测限： 按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1EU/ml和0.01EU/ml-0.1EU/ml两个区间(反应时间T1和T2见出厂检验报告)。 用法： 1.材料和设备 1.1试剂 鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1、偶氮化试剂2、偶氮化试剂3、HC l (反应终止剂)、细菌内毒素检查用水。 1.2器材 无热原试管、无热原吸头、旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架、恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。 注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。 玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。 2.供试品的贮存与预处理 备注：若供试品为血液类，请参照我厂配套血液相关处理试剂使用说明书。 2.1供试品的pH值应在6-8之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N氢氧化 钠或0.1N盐酸调节。 2.2若供试品中可能存在鲎实验的干扰物质，处理参见【供试品的干扰试验】。 2.3若供试品中可能含有β－葡聚糖（β－葡聚糖会产生G因子旁路反应，干扰内毒素 检测），需选用特异性鲎试剂（我公司提供）。 2.4若供试品为一些抗菌素如头孢类抗菌素和磺胺制剂会对偶氮染色剂产生偶联反应
细菌内毒素检查方法综述 【关键词】细菌内毒素检查法；,,,机理；,,,预实验；,,,特殊值 细菌内毒素检查是静脉、鞘内给药药物以及放射性药物等质量检查的一个重要方面。以前，细菌内毒素检查用家兔热原法进行，自从1980年《美国药典》第20版收载了细菌内毒素实验以来，《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》《中国药典》等相继收载了该方法。1995年《美国药典》第23版已收载了471种药品进行细菌内毒素检查，而《中国药典》1995年版也收载了12种药品进行细菌内毒素检查［1］，2000版更收载有47种药品利用此方法进行热原检查。细菌内毒素检查法已逐渐代替家兔热原检查法，显示出其在检查热原方面的重要性。本文对细菌内毒素检查法作一综述。 1 方法、机理及影响因素 1.1 应用的方法目前，美国药品食品管理局（FDA）承认3种鲎试剂检测细菌内毒素含量的方法，即凝胶（gelclot）法、生色（chromogenic）法和动态浊度（keniticturbidimetry）法［2］。近年来较新的方法有水箭电泳免疫法（测残余蛋白）、酶联免疫吸附法（测残余酶）。后者所需鲎试剂仅相当于凝胶法的1/100，且灵敏度更高，抗干扰能力更好。《中国药典》1995年版只采用凝胶法。凝胶法是将等体积的供试品溶液和新配制的鲎试剂（TAL）溶液在试管中混匀，一般各0.1 ml，（37±1）℃反应（60±2）min。如果被检测的溶液不含干扰凝集反应的因素，且其含有内素素浓度等于或大于所用鲎试剂的灵敏度（λ）时，就会在试管中显示阳性反应，即形成凝胶；否则呈阴性反应，即呈澄明溶液或轻度混浊，视内毒素的浓度而定［1］。该反应极其灵敏，凝胶形成速率与内毒素浓度成正比，并受温度、反应物中Ca2 /Mg2 离子浓度和pH等因素的影响［3］。同样，《中国药典》2000年版也只采用凝胶法。淘金者https://www.doczj.com/doc/8b14629005.html, 1.2 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理见图1。 图1 凝胶法鲎试剂与内毒素反应的机理（略） 2 影响细菌内毒素检查的因素 2.1 检品的干扰pH值、离子浓度以及某些干扰成分，都会影响到检查结果的准确性，得到所谓“假阳性”或“假阴性”结果。只有证实检品对凝集反应无干扰之后，检查的结果才是可信的。判断检品是否有干扰要做检品的干扰实验。
细菌内毒素检测方法验证方案 起草人 起草日期 审核人 审核日期 批准人 批准日期 西安力邦制药有限公司
目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容------------------------------------------------------------------------- 1.实验材料及用具------------------------------------------------------- 2 实验准备---------------------------------------------------------------- 3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验-------------------------------------------------------------- 3.3.供试品细菌内毒素检查-------------------------------------------- 4.验证结论--------------------------------------------------------------附： 表1.鲎试剂灵敏度复核记录 表2.干扰试验记录 表3.细菌内毒素检查记录
鲎试剂实验方法 鲎试剂按实验方法可分为：凝胶法、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂。 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。凝胶法是通过观察有无凝胶形成作为反应的终点。此法操作比较简单，经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。 凝胶法鲎试剂常见规格为0.1ml/支或0.2ml/支的单个测试或0.5ml/支至5.2ml/瓶的真空封口西林瓶装的多个测试。使用时一般应加细菌内毒素检查用水复溶后使用。厦门市鲎试剂实验厂有限公司的真空封口试管凝胶法鲎试剂是把鲎试剂直接灌装在试管中，在真空中压盖封口的新产品。使用时直接用样品溶解鲎试剂，不会割伤手，更加简单方便安全。 特异性鲎试剂，即弃G因子鲎试剂，是厦门市鲎试剂实验厂有限公司国内首创的产品，它专一对内毒素起反应，避免了G因子旁路的干扰，使检测结果更加可靠，在药检和临床检验方面是不可或缺的理想检测试剂。目前厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的各种内毒素检测鲎试剂均为特异性鲎试剂，都能对抗葡聚糖的干扰，只对内毒素起反应。因此不列为独立品种。 动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂、终点显色法鲎试剂，这四种方法都是定量检测内毒素的。这几种定量法鲎试剂统称光度法鲎试剂。 根据检测原理，终点浊度法和动态浊度法都属于浊度法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。终点浊度法未见商品化产品。动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。 动态浊度法的特点为：1. 能准确定量。2.检测范围宽，可达4个数量级。3.灵敏度高达0.005EU/ml。4. 操作简便，系统自动检测分析，一步即成。5. 经济实用，试剂样品需要量少，可降至50μL。6. 和微生物检测系统Elx808（配套IU）及专用软件TALgent使用，一次可同时检测多达96个样品。 终点显色法和动态显色法都是属于显色基质法。显色基质法系利用鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物显色释放出的呈色团的多少而测定内毒素含量的方法，根据产物颜色判断内毒素浓度，又称为比色法。显色基质法由于不依赖凝固蛋白形成凝胶，抗干扰能力强，特别适用于生物制品（蛋白、疫苗等）和临床样品（黄疸、血液、尿液）的细菌内毒素检测。 终点显色法是目前反应时间最短的鲎试验法，只需要16分钟就能得出结果。而且可以偶氮化染色剂，避开某些有色检品自身颜色对鲎试验的干扰。终点显色法不需要特殊的检测仪器就能准确定量。 动态显色法鲎试剂兼有动态浊度法和终点显色法鲎试剂的优点，抗干扰能力强，使用简单方便，检测范围宽，灵敏度高达0.005EU/ml, 是目前世界上最好的鲎试剂。但是价格较高。 如果您仅需要检测样品的内毒素限量，可以选择凝胶法鲎试剂，通过确定内毒素限值及最大有效稀释倍数，做样品的干扰试验从而确定使用的鲎试剂的灵敏度。如果您需要定量测定样品中内毒素含量则应选择显色基质鲎试剂盒或动态浊度法鲎试剂。日常检测量不大时，可以选择终点显色法鲎试剂，用普通的分光光
细菌内毒素检查标准操作规程
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。 λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。 1.4 在使用新一批号的鲎试剂前，必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。 1.5 药典中已有规定的品种或有其它内毒素检验标准的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰实验的验证；其它未建立内毒素检查的品种需 先进行干扰实验，确定不干扰浓度后再进行内毒素检查。 1.6 细菌内毒素检查过程中的阴性对照、阳性对照和供试品对照必须同时进行，否则实验结果无效。 2 实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。
显色基质鲎试剂盒使用说明书(终点显色法，含偶氮化试剂) 【用途】显色基质鲎试剂( Chromogenic End-point Tachypleus Amebocyte Lysate , CE TAL )用于体外细菌内毒素的定量检测，禁止以任何途径进入机体。 【原理】鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下（温 度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C 因子，引起一系列酶促反应， 激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为 多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax = 405nm）。在一定时间内，pNA的生成量与细菌内毒素浓度成正相关，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。同时，对硝基苯胺（pNA）也可用偶氮化试剂染成玫瑰红色（λmax = 545nm），避免了供试品本身的颜色对405nm处吸收峰的干扰。 【检测限】按反应时间不同可检测0.1EU/ml-1 EU/ml和0.01EU/ml -0.1EU/ml两个区间( 反应时间T 1 和T 2 见出厂检验报告) 。 【试剂盒组成】 细菌内毒素工作品，2支 鲎试剂， 1.7ml/支，2支 显色基质，1.7ml/支，2支 偶氮化试剂1，10ml/支，2支 偶氮化试剂2，10ml/支，2支 偶氮化试剂3，10ml/支，2支 HCl (反应终止剂)，50ml/瓶，1瓶 细菌内毒素检查用水，50ml/瓶，2瓶 【贮存】阴凉处, 最佳2-8℃,避光贮存。 【用法】 1 .材料和设备 1.1 试剂 鲎试剂、细菌内毒素工作品、显色基质、偶氮化试剂1 、偶氮化试剂2 、偶氮化试剂3、HC l ( 反应终止剂) 、细菌内毒素检查用水。 1.2器材 旋涡混合仪、移液器、多道移液器、封口膜、试管架。 恒温水浴箱（37±1℃）、分光光度计。 注意：接触试剂及供试品的所有器皿必须是无热原的(我公司提供无热原耗材)。 玻璃器皿可经250℃干烤至少60分钟去除热原。 2. 供试品的贮存与预处理 备注：若供试品为血液类，请参照配套血液相关处理试剂使用说明书。 2.1供试品的pH值应在6 - 8之间，若超出此范围，需用无热原缓冲液、0.1N氢氧化钠或0.1N 盐酸调节。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。
6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。
动态显色法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书 货号：T7570 规格：48T/盒1.7ml 保存：阴凉处，最佳2-8oC，避光保存。 产品说明： 鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品,鲎试剂中含有Ｃ因子、Ｂ因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在适宜的条件下(温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的显色基质，使其分解为多肽和黄色的对硝基苯胺（pNA，λmax=405）。反应液的吸光度(OD值)增加,OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。换言之，OD值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。 试验所需材料和器材： 内毒素工作标准品、鲎试剂、显色基质、细菌内毒素检查用水、除热原试管、除热原吸头、除热原96孔微板（或可拆式板条）、旋涡混合器、移液器、试管架、带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent或Gen5。 注意事项： ①该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。 ②接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。试验过程应防止微生物的污染。 该说明书中的除热原指内毒素浓度小于0.005EU/ml。 ③供试品的pH值应在6.0–8.0之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1M氢氧化钠或0.1M 盐酸调节。 ④当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。 操作步骤：
1、动态光度测定仪器的设定，以鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU为例： 预热仪器，设置温育温度为37oC。 设置模板及程序。 设定读板波长为405nm，设定动力学参数：读板120分钟，每30秒读一次。 2、内毒素标准溶液配制（浓度10，1，0.1，0.01EU/ml） 2.1、取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5ml-1.2ml 之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。 2.2、将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成所需浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器 上剧烈振摇1分钟。 稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，放置4小时以上的内毒素溶液应丢弃。 (参见《内毒素工作标准品使用说明书》)。 3、阴性对照为细菌内毒素检查用水。 4、鲎试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于显色基质中，轻轻摇晃溶解显色基质，再将溶解的 显色基质全部加入到鲎试剂中，轻轻摇晃使鲎试剂完全溶解。注意不要用旋涡混合器剧烈振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内使用。 若采用多道移液器，将溶解的鲎试剂转移到除热原加样槽，并轻轻摇匀。 5、实验操作 取除热原微板，在各孔中分别加入100μl细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。 将微板放置于鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU中，37oC预热10分钟。 预热结束，用移液器或多道移液器每孔加入100μl鲎试剂（避免产生气泡!)，中速振摇10秒混匀，于37oC温育120分钟，并且在405nm波长处，每30秒读一次OD值。 6、数据处理 设定启动OD为0.2，软件自动给出其启动时间(T)。 建立标准曲线：lgT=b lgC+a，其中T为启动时间，C为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截
实用文档之"细菌内毒素检查验 证方案" 文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5
11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表
4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器
去内毒素质粒提取Protocol 内毒性也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性（如大肠杆菌，E.coli）胞膜上一种成分。细菌外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成。一个E.coli包含约2百万个LPS分子，每个LPS 分子又由疏水性的脂质A、复杂的多糖链以及带负电荷的磷酸基团组成。因此每个内毒素既包含疏水区域也包含了亲水和带电区域，从而赋予其与其它分子相互作用的独特性质。 图1. 内毒素结构图。 细菌在其活跃生长时表面的内毒素成分较少，而一旦其死亡则会释放大量内毒素。在质粒提取的裂解过程中，内毒素会从细菌的外膜释放到裂解液中。内毒素的存在会严重的影响质粒转染细胞的效率，此外会激活造血细胞（如B细胞、巨噬细胞等）的非特异免疫反应，造成实验的假阳性，所以转染级质粒的提取纯化必须去除内毒素。 内毒素如何测定？ 历史上，内毒素测定主要是基于内毒素与鲎（一种海洋节支动物，也称马蹄型蟹）血液中的变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时可发生凝血反应。鲎试剂与细菌内毒素产生凝胶反应的机理是：鲎的血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。现在已经发展出更加灵敏的光度计测试方法，该方法主要基于鲎试剂以及一种人工合成的可产生颜色反应的底物。 LPS污染通常用内毒素单位（Endotoxin Units, EU）表示，通常情况下，1ng LPS对应于1到10个EU。
Protocol 常用的试剂盒选择包括Qiagen、Sigma都挺好用的。或者omega、天根等。在选择取出内毒素的质粒提取试剂盒的时候有一个小窍门，就是有的盒子上写着“Endofree”字样，这种试剂盒是专门用来提取用于细胞转染实验的质粒的。一般这种质粒提取试剂盒采用独特的硅胶膜吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的溶液P4和过滤柱CS，可以有效的去除内毒素、蛋白等杂质。没有这个字样的试剂盒，对于常规的分子克隆实验，如，PCR，酶切，克隆等完全够用了。 如果不是特别的试验，建议采用手工方法，丁香园战友推荐以下的protocol提的质粒免疫动物没有问题，曾用于制备DNA疫苗，可进行大量的去内毒素质粒提取。 1）挑取一个新鲜菌落接种于含5ml LB及相应抗生素的试管，37℃培养8-12小时。 2）用上述新鲜培养物小提质粒鉴定后，剩余的菌液接种于含相应抗生素的400ml LB培养基中，37℃培养12-16小时。 3）用500ml离心筒收集菌液，5000rpm离心10分钟，弃上清。 4）用40ml预冷的STE重悬菌体，转移至2支30ml离心管中，6000rpm 5分钟，弃上清。 5）用3ml预冷的溶液I重悬菌体，再加入6ml新鲜配制的溶液II，轻轻颠倒混匀；再加入4.5ml预冷的溶液III，轻轻颠倒混匀。 6）4℃12000rpm离心10分钟，将上清转移至另外的30ml管中。 7）加等体积的异丙醇，颠倒混匀，置于－20℃20分钟以上。 8）4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，37℃蒸发至沉淀边缘透明。 9）加入5ml TE使DNA溶解后，加入5mol/L的LiCl溶液5ml，轻轻混匀，-20℃放置5-10分钟。 10）4℃12000rpm离心15分钟，转移上清，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20分钟以上。 11)4℃12000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，倒置控干后，37℃蒸发至沉淀基本透明。 12）用2ml TE溶解沉淀，并加入50μl/管的RNase（5mg/ml），37℃消化过夜。
纪律作风整顿
细菌内毒素检查验证方案
文件编号：VP-QC-2015-06
起 草 人： 审 核 人： 批 准 人： 批准日期：
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1 概述
纪律作风整顿
目录
1 2 验证目的及范围
1 3 验证小组人员组成及职责
1 4 验证依据
2 5 验证前准备
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纪律作风整顿
2 6 验证的实施
2 7 偏差处理
5 8 验证数据及评估
9 验证报告及评审
10 再验证及周期
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纪律作风整顿
5 11 验证文件及归档
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纪律作风整顿
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒
素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度
法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行 制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。
2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、 干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评 价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责：
3.1 验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。
3.2 验证小组组成及职责列表
组成 QC
质量部 生产部
职责
1. 负责起草验证方案的起草 2. 负责本方案的培训 3. 仪器仪表校验确认 4. 负责验证的实施 5. 负责数据的收集和整理 6. 负责数据分析 7. 负责完成验证报告
1. 负责验证方案、验证报告的审核与批准 2. 负责验证现场的监督审查
1. 负责保障设备、器具的完好 2. 负责动力系统的保障
4 验证依据
《中华人民共和国药典》2015 版 1143 细菌内毒素检查法
5.验证前准备
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凝胶法鲎试剂使用说明书 一、检测步骤 1、标准品稀释：开启后加入检查用水（W）1.2ml，置漩涡混合器上混合5min，得到 浓度为10EU/ml的内毒素溶液，标记为（E10），其余各梯度稀释方法如下： 0.3ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml 1.5ml E10 －－－→E1－－－→E0.5－－－→E0.25－－－→E0.125－－－→E0.06－－－→E0.03 2.7mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 1.5mlW 此步骤为新开启标准品者操作，各梯度做好标记，其余操作人员可直接使用。 2、取鲎试剂8支，折断安瓿瓶颈，其中2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2 支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管，做好标记。 3、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水，每支供试品检查 管另加入0.1ml供试品；阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ（即0.1ml 的E0.125）内 毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml含2λ（即0.1ul 的E1）内毒素的供试品。 4、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37℃的恒温金属浴中60min，然后取出观察结果。 在孵育期间避免任何震动！ 二、结果判断 1、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°，若管内形成凝胶，不变形，不滑落者 为阳性，记录为（+）；反之为阴性，记录为（—）。取出试管应尽量避免受到震动 造成假阴性结果！ 2、阴性对照管必须为阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须为阳性，否则实验结 果无效。 3、若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或检查用水货实验器具受到污染；若阳性对照管 为阴性，表明鲎试剂或标准内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及标准内毒素的效价 标示不准，或实验条件不满足；若供试品阳性对照管为阴性，表明反应体系内有抑 制反应的干扰因素存在。
GMP管理文件 一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。 二、目的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。 三、适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。 四、责任者：质检人员。 五、正文： 1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于ml的灭菌
注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于ml。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在～的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD： MVD＝Cl/λ C为供品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于ml，当L 以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀
关于鲎试剂在细菌内毒素检查法中使用的探讨 鲎试验因其简单﹑快速﹑灵敏﹑准确的特点，被世界各国广泛采用，中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法，大范围地替代了热源检查法。为了确保其检查结果的准确性，本文对鲎试剂的使用进行了探讨，以规范鲎试剂的正确使用。 【关键词】鲎试剂;细菌内毒素检查法 【Abstract】TAL reagent test because of its simple, fast and accurate characteristics was widely adopted around the world. Chinese Pharmacopoeia, European and the United States Pharmacopoeia set it as the statutory bacterial endotoxins test, replaces the pyrogen test on a large scale. In order to ensure the accuracy of test results, the main discussion of this paper is the use of tachypleus tridentatus leach(TAL),to regulate the proper use of TAL. 【Key words】TAL;bacterial endotoxins test 1 鲎试剂的分类 鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物，经低温冷冻干燥而成的生物试剂，专用于细菌内毒素检测。 1.1 按原料来源分一种是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate)，缩写为LAL，由美国生产;另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate)，缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。 1.2 按实验方法分细菌内毒素检查法包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为：凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。 凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。 动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。 1.3 按使用特点分 1.3.1 普通鲎试剂灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。 1.3.2 高灵敏度鲎试剂灵敏度0.06～0.015 EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。 1.3.3 特异性鲎试剂灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂产生干扰的样品[2]。 1.3.4 定量法鲎试剂最低检测限0.03～0.005 EU/ml，适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。 2 鲎试剂在细菌内毒素检查法中的正确使用 内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[3]，而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以，一定要严格执行鲎试剂的质量标准，规范使用鲎试剂。 2.1 保证所使用鲎试剂的质量鲎试剂的质量主要表现在其灵敏度、自凝时间与成胶状态三个方面：灵敏度稳定;自凝时间不低于24h[4];具有一定的缓冲能力与合适的pH;反应后即形成坚实凝胶，将成胶安瓿翻转180°而不会被破坏。而质量稍差的鲎试剂存放一定时间后(如半年)其灵敏度可能发生变化，而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化[5]。因此，需选择具有国家颁发的批准文号,质量稳定的鲎试剂。
透析液及其回收率的测定 革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒（显色法）即碱处理法 规范操作 1.目的 测定透析用水、透析液等样本内毒素含量，保证透析安全。同时对样品加入一定浓度的内毒素标准品进行回收率试验测定，保证试验结果的准确性。 2.授权操作人 经培训合格的微生物实验室检验人员。 3.实验原理 内毒素检测原理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）能激活反应主剂中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起酶的级联反应，根据其引起的吸光度变化对革兰阴性脂多糖（内毒素）浓度进行定量测定。 样品回收率试验测定原理：仪器配套的一次性器具软件分别计算出样品溶液及含标准内毒素的样品溶液的内毒素含量Co和Ct，软件再自动按下式计算该试验条件下回收率R%。 R%=(Ct－Co)/λ×100% 其中Co为样品溶液内毒素实际测定值； Ct为含标准内毒素样品溶液的内毒素实际测定值； λ为样品溶液中加入的标准内毒素的浓度。 4．产品性能指标 4.1灵敏度0.01EU/ml 4.2精密度批间CV≤10%。 4.3准确性回收率75-125%。 4.4标准曲线范围0.1EU-10EU/ml。 4.5相关系数r绝对值≥0.980。 5.实验组成 5.1实验仪器及器具： MB-80微生物快速动态检测系统，配套软件：一次性器具检测系统3.7X 洁净工作台旋涡混合器 加样器（5-50μl，20~200μl，100~1000μl）
5.2实验耗材： 无热原吸头(100μL、200μL、1000μL) 无热原平底试管(塑料)无热源转移管 无热原1.5mL离心管或一次性真空采血管（4ml或5ml） 5.3实验试剂： 内毒素标准品（冻干品），3EU/支 内毒素检查用水 试剂盒组成：反应主剂、主剂溶解液、处理液A、处理液B、质控品和质控品溶解液。其中透析液测定只需要反应主剂与主剂溶解液两种组分即可。 6．工作环境 相对湿度：20%~80%； 温度控制：10~30℃； 电源电压：220V±10%，50Hz±2%。 7.样本采集及处理 7.1检测样本:R/O水、透析液、A原液、B原液等 7.2采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原转移管。 7.3样品采集标准 7.3.1供试液的制备[1]： 浓缩液，直接取样成供试液； 对干粉，称取样品5克，用细菌内毒素检查用水按使用说明配成浓缩液成供试 液。 取供试液按使用说明的比例混合，以细菌内毒素检查用水稀释后进行检测。 7.3.2用水标准[2] 应在透析装置和供水回路的连接处收集试样，取样点应在供水回路的末端或在混合室的入口处。 7.3.3《血液透析器复用操作规范》透析复用用水 采样位置：应在血液透析器与复用系统连接处或尽可能接近此处进行水质检 测。 检测时间：最初应每周检测一次，连续两次检测结果符合要求后，内毒素检 测应每3个月至少一次。