高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法） HPLC日常维护- 进样阀问题可能原因解决方法 手动进样阀，转动不灵转子密封损坏更换或调整转子密封转子太紧调整转子的松紧度 手动进样阀，载样困难进样阀安装不当重新安装定量环阻塞清洗或更换定量环进样器污染清洗或更换进样器管路阻塞清洗或更换管路 自动进样阀，不能转动无压力（或电源）提供恰当的压力（电源）转子太紧调整转子的松紧度 进样阀安装不当重新安装 自动进样阀，其它问题 阻塞清洗或更换阻塞部件机械故障见随机维修手册控制器故障维修或更换控制器 出现问题可能原因解决方法 保留时间变 化柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱 等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液 柱污染每天冲洗柱 柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 柱快达到寿命采用保护柱 保留时间缩 短流速增加检查泵,重新设定流速 样品超载降低样品量 键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度增加柱恒温 保留时间延 长流速下降管路泄漏,换泵密封圈,排除泵内气泡 硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度降低柱恒温 出现肩峰或 分叉样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 进样器损坏更换进样器转子 鬼峰进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 样品中未知物处理样品 柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对 色谱)
高效液相色谱基础知识测试 一、填空题 1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 。高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。 2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。 3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱，最高工作压力为400 bar。 4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。 5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟，。 7、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。 二、选择题 1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ） A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( A )
A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是( A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器 5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是（B ）。(1)光源；(2)气路系统；(3)单色器系统；(4)进样系统；(5)分离系统；(6)吸收系统；(7)电导池；(8)检测系统；(9)记录系统。 A 1-3-6-8-9 B 2-4-5-8-9 C 2-4-5-7-9 D 2-4-6-7-9 7.在气相色谱定性分析中，实验室之间可以通用的定性参数是（ D ）。 A 调整保留时间 B 校正保留时间C保留时间D相对保留值 三、判断题：（正确-----√；错误----×） 1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标（√） 2. 灵敏度是检测器的主要性能指标（√） 3. 检出限与噪音无关（×） 4. 要提高柱的分离效能，可以考虑增加柱长，增加色谱柱选择性，调节流动相的组成等措施（√） 5. 溶解于流动相中的气体在色谱分离的过程中不会影响流动相的流速和检测器的稳定性（×） 6. 分析一个复杂混合物，恒溶剂洗脱是不能令人满意的。可在分离的过程中连续改变流动相的组成，即所谓梯度洗脱( √)
高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法项目 数量 1985年版1990年版1995年版2000年版 HPLC法 鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用
碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在 5
高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.
一、基本原理 高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。 高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。 二、高效液相色谱分析原理 （1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 （2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分 离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 三、工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 四、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1) 色谱柱的理论板数(N，用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2)，按n＝5.54(t R/W h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 (2) 分离度(R)
一、开机 1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相B瓶：为有机相。 2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min 内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。 该页面主要由以下几部分组成： ——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等； ——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等； ——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告； ——中下部为动态监测信号； ——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。 二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。 3、泵参数设定： 进入“Setup pump”画面，在“Flow” 处输入流量，如1ml/min；在“Solvent B”处输入有机相的比例如70.0，（A=100-B），也可在Insert 一行“Timetable”，编辑梯度；输入保留时间；在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。单击OK，进入下一画面。 4、DAD检测器参数设定： 进入“DAD signals”画面，输入样品波长及其带宽、参比波长及其带宽（参比波长带宽默认值为100nm）；选择Stoptime：as Pupm； 在“Spectrum”中输入采集光谱方式“store”：选All；如只进行正常检测，则可选None；范围Range：可选范围为190~950nm；步长Step可选2.0nm； 阀值：选择需要的灯； Peak width（Response time）即响应值应尽可能接近要测的窄峰峰宽，可选“2s”或4s； Slit-：狭窄缝，光谱分辨率高；宽时，噪音低。可选4nm
安捷伦1100液相色谱仪各项性能指标 悬赏分：5|解决时间：2010-10-16 22:13|提问者：4329211 最佳答案 朋友，直接致电agilent的800-820-3278免费电话就可以得到Agilent的满意答复了 系列Agilent 1100泵系统 ●电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统，精度高、流速范围广柱流速范围：1-20ul/min;10-100ul/min（可选件） 0.001-2.5m1/min(EFC关闭状态) ●高压制备泵系统，单元或双元高压制备泵 流速范围:0.001-100m1/min ●分析型泵系统 流速范围： 单元泵：0.001-10m1/min 二元泵：0.001-5m1/min 四元泵：0.001-10m1/min 品种齐全的Agilent 1100系列进样系统 ●标准手动进样器（分析型或制备型） ●标准自动进样器 样品瓶容量：可达100个(2mlx100) 进样量：0.1-100ul(0.1-1800ul)可选件 ●微盘式自动进样器 样品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml 进样量：0.1-100ul(标准件) 0.1-1500ul可选件 ●微量标准自动进样器/微盘式自动进样器 进样量：0.01-8ul（标准）;0.01-40ul（可选） ●恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器 温度范围：4-40℃可设定步进1℃ ● 220型微孔板式自动进样器－组合化学样品管理系统 样品瓶容量：各种规格试管多达12个微孔板（96孔板,384孔板） 进样量：0.1-5ul;0.1-20ul Agilent 1100系列检测器 ●可变波长扫描紫外检测器（VWD) 波长范围：190?600nm ●多波长检测器(MWD)
生效日期20140101 负责姓名职位签名/日期 起草何瑞清QC 审核梁天静QC主管 批准张小伶质量部经理 分发部门： 部门份数部门份数QC室1 1 目的 建立高效液相色谱法检验程序 2 范围 本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作 3 职责 3.1QC人员：严格按本程序操作 3.2QC主管：严格按本程序检查 4 内容 4.1 定义及概述 4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一 定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压 输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流 动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪 或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有 分离性能高，分析速度快的特点。 4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的 药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分
子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反 应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于 正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相 或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合 硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子 交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 4.1.3 仪器的组成和一般要求： 4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。 4.1.3.2 对仪器的一般要求： ——所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱 的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规 定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅 胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用， 辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶 也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色 谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色 谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为 紫外吸收检测器。 ——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符 合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。（紫外 分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸 收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不 置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池 所吸收度，在220～240nm范围内不得超过 0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在 251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以 上时不得超过0.05。）
当前位置：液相色谱仪->相关知识->定量分析 色谱法不仅是一种分离方法，而且通过被分离组分分别进入检测器，能精确测的各组分在样品中的含量。 定性分析：通常用与标准样比较保留时间进行定性，即保留时间相同可能是同样的组分；保留时间不同，肯定不是同样的组分。 液相色谱定量分析的基本原理 定量分析是在定性分析的基础上，需要纯物质作为标准样品。 液相色谱的定量是相对的定量方法，即：由已知的标准样品推算出被测样品的量。液相色谱法定量的依据： 被测组分的量(W)与响应值(A)（峰高或峰面积）成正比,W=f×A。 定量校正因子(f)：是定量计算公式的比例常数，其物理意义时单位响应值（峰面积）所代表的被测组分的量。 由已知标准样品的量和其响应值可以求得定量校正因子。 测定未知组分的响应值，通过定量校正因子即可求得该组分的量。 定量分析常用术语： 样品（sample）含有带测物，供色谱分析的溶液。分为标样和未知样。 标样（standard）浓度已知的纯品。 未知样（unknow）浓度待测的混合物。 样品量（sample weight）待测样品的原始称样量。 稀释度（dilution）未知样的稀释倍数。 组分（componance）欲做定量分析的色谱峰，即含量未知的被测物。 组分的量（amount）被测物质的含量（或浓度）。 积分（integerity）由计算机对色谱峰进行的峰面积测量的计算过程。 校正曲线（calibration curve）组分含量对响应值的线性曲线，由已知量的标准物建立，用于测定待测物的未知含量。 常用的定量方法 标准曲线法，分为外标法和内标法。 外标法在液相色谱中用的最多。 内标法准确但是麻烦，在标准方法中用的最多。 外标法 用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。 注入色谱柱的到其响应值（峰面积）。 在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=f×A，
10 高效液相色谱法基本知识 （见第7章） u HPLC 法分类与定义 正相高效液相色谱法（NP-HPLC ）——固定相极性大于流动相极性。常用色谱柱有硅 胶柱、氰基柱、氨基柱；流动相为烷烃加适量极性溶剂，如正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇等。 主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物，如维生素 A 、维生素D 、维 生素 K 1 的含量测定。 反相高效液相色谱法（RP-HPLC ）——流动相极性大于固定相极性。常用色谱柱为十 八烷基硅烷键合硅胶（ODS ）柱；流动相主要成分为甲醇-水或乙腈-水（添加适量酸或缓冲 盐），用于大多数非极性、弱极性药物的分离分析。 v 系统适用性试验内容与要求 理论板数（n ）＝16（t R /W ） 2 或 n ＝5.54（t R /W h /2） 2 ，计算 n 时应指明测定物质。当 测定结果有异议时，应以峰宽（W ）计算结果为准。 分离度（R ） W W t t R R 2 1 ) ( 2 1 2 + - = 或 ) ( 70 . 1 ) ( 2 2 / , 2 2 / , 1 1 2 h h R R W W t t R + - = ，一般要求待测组分与相邻共 存物之间的 R 应大于 1.5。当测定结果有异议时，应以峰宽（W ）计算结果为准。 重复性：用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。取同一溶液连续进样 5 次，其峰面积的相对标准偏差（RSD ）应不大于 2.0％。 拖尾因子（T ） 1 05 . 0 2d W h = ，峰高法定量时 T 应在 0.95～1.05 之间。 w 测定方法 内标法：按规定，取被测物对照品和内标物质一定量，混合，配制成校正因子测定用的 对照溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。根据对照溶液色谱图中对照品和内标物 质的峰面积或峰高，以及对照品和内标物的浓度，按下式计算校正因子（f ）： 对 对 内 内 C A C A f / / = 另取被测物适量，加一定量内标溶液，混合，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪， 记录色谱峰面积。根据供试品溶液色谱图中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度（ 样 C ）： ' ' / 内 内 样 样 C A A f C ′ = 外标法：按规定，精密称取对照品和供试品，分别配制成溶液，注入高效液相色谱仪， 记录各自色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度（ 样 C ）： 对 样 对 样 A A C C =
高效液相色谱法在分析检测上的应用 目录 1引言 (1) 引言 (1) 2高效液相色谱分析原理 (1) 2.1高效液相色谱分析的流程 (1) 2.2高效液相色谱的分离过程 (1) 2.3高效液相色谱的类型 (2) 2.3.1吸附色谱 (2) 2.3.2分配色谱 (2) 2.3.3离子交换色谱 (3) 2.3.4凝胶色谱 (3) 3高效液相色谱法在分析检测上的应用 (4) 3.1食品中山梨酸、苯甲酸的测定 (4) 3.1.1测定原理 (4) 3.1.2试剂和溶液 (4) 3.1.3.测定方法 (4) 3.2 高效液相色谱法测定青梅花、枝、叶中绿原酸类化合物 (5) 3.2.1 对照品溶液配制 (5) 3.2.3 青梅样品的测定 (6) 4结论 (6) 参考文献 (7)
1引言 高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100 μm的吸附剂（硅胶、氧化铝等）。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小（5 μm-10 μm）、传质快、柱效高。高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。 2高效液相色谱分析原理 2.1高效液相色谱分析的流程 由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 2.2高效液相色谱的分离过程 同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C 在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系
实例解析——高效液相色谱(HPLC) 一、原理 利用不同物质在两相中（液液、液固、离子交换、尺寸排阻）具有不同的分配系数，当二者相对运动时候，物质在两相中反复多次分配，从而使得物质得到完全分离 二、适用范围 高沸点、热不稳定的天然产物、生物大分子、高分子化合物、离子型样品、生化样品三、特点 高压、高效、高灵敏度 四、仪器组成 流动液贮存提供脱气，输液系统、进样系统、分离系统、检测系统，控制记录系统贮液瓶、高压泵、进样器、分离柱、检测器、记录仪 五、仪器选择 由实验条件确定是选用二元高压还是四元低压、一般来说，二元高压的准确度较高。四元低压是先将样品按比例混合再泵入，而二元高压是先泵入不同比例的溶剂再混合。确定采用的脱气系统，一般采用在线脱气。确定进样方式，人工手动六通阀进样，还是进样针自动进样，一个适用于少量样品，一个适用于大量样品。 选择检测器，如果是有较强的紫外吸收的可用紫外可见检测器(二极管阵列检测器)，如果是芳香族化合物，可选用荧光检测器，对于离子可采用电导检测器。 六、实验条件优化 配置待测物质的标准溶液 1、色谱柱的确定 分析样本确定是采用何种类型的色谱柱 (1)分配色谱，两项间分配系数 流动相选用极性的物质（甲醇、乙腈、水）则固定相选择非极性物质。一般用 C18 ODS柱。 (2)吸附色谱， (3)离子交换色谱 各种离子与树脂上交换集团的交换能力不同。固定相：离子交换树脂，流动相 为无机酸、无机碱。常用于分离离子或者可解离的化合物 (4)排阻色谱法 配置含待测物质的标准品溶液，采用不同C18柱分离，检测，对照不同色谱图像，可得到分离效能最高的色谱柱 2、最佳流动相梯度洗脱程序的确定 梯度洗脱：按照一定的程度，不断改变流动相中个溶剂组成的比例以改变流动相的 极性。将色谱柱上不同的组分洗脱出来。 配置不同的梯度洗脱方案，用标准溶液进行试验，并选取能达到最高分离效能的梯 度洗过方案作为最佳流动相梯度洗脱程序 3、流动相的确定 在分离效能相似条件下选择更经济、毒性小的流动相 4、流速确定 流速太大，待分离组分来不及与固定相充分作用，故其中的组分较易被洗脱下来，出峰时间变短，而且柱压比较高，会引起泵负荷的增加，进而导致色谱柱的使用命