第四军医大学
硕士学位论文
毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺研究
姓名：唐浩
申请学位级别：硕士
专业：细胞生物学
指导教师：陈志南;米力
@
缩略语表
缩略语英文全称中文全称
A absorbance 吸光值
Ab antibody 抗体
AK auto Ab anti-keratin auto antibody 抗角蛋白自身抗体 AOX alcohol oxidase 醇氧化酶
bp base pair 碱基对
CHO Chinese Hamster Ovary 中国仓鼠卵巢
CV column volume 柱体积
DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸
DO dissolved oxygen 溶解氧
Elisa enzyme linked immunosorbent
assay
酶标记免疫吸附试验
Fab antigen-binding fragment 抗原结合片段 FDA food and drug administration 食品与药品管理局 FF fast flow 快速流
GA glucoamylase 葡萄糖淀粉酶 HBsAg hepatitis B surface antigen 乙型肝炎表面抗原 HC heavy chain 重链
HIC hydrophobic interaction
chromatography
疏水作用层析
HPLC high performance liquid
chromatography
高效液相色谱
HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 IEC ion exchange chromatography 离子交换层析 Kd kilodalton 千道尔顿
L liter 升
LC light chain 轻链
MAb monoclonal antibody 单克隆抗体
独创性声明
秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。
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论文作者签名： 导师签名： 日期：
毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺研究
硕士研究生唐浩
导师陈志南教授
辅导教师米力高级实验师
第四军医大学基础部细胞生物学教研室/细胞工程研究中心
西安 710032
中文摘要
抗体药物已成为当今生物技术药物的支柱产业，截至2006年，FDA已批准26个体内用抗体药物，其中治疗剂21个。抗体药物在全球的年销售额从1997年的3.10亿美元上升到2005年的150亿美元；其在生物制药产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2005年的1/3。目前，抗体药物已进入基因工程抗体时代，在全球已报道的10万多种抗体中，基因工程抗体有1000多种。基因工程抗体的快速发展，对于人类重大疾病的诊断、预防与治疗提供了新方法、新途径。但是阻碍基因工程抗体产业化发展的瓶颈是其表达和纯化。目前用于制备基因工程抗体的表达系统主要有原核表达系统（包括分泌表达系统和包涵体表达复性系统）和真核表达系统。其中毕赤酵母表达系统不但具有许多真核表达系统的优点（如翻译后修饰等），而且比其他真核表达系统具有操作简便成本低廉的优点，因此广泛应用于基因工程抗体的表达。本文以毕赤酵母表达的抗人角蛋白Fab抗体片段为目标产品，旨在建立毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺。
相应研究分为三部分：1）．酵母表达条件优化。在摇瓶中，采用正交试验研究甘油添加量、温度、pH三因素三水平对培养阶段酵母生长的影响；研
究诱导时机、甲醇添加量、温度、pH四因素四水平对诱导表达阶段蛋白表达
的影响。在摇瓶阶段取得较高的细胞密度和蛋白表达量。2）．分批-补料发酵工艺优化。在5L发酵罐规模，分别研究不同甘油补加速率对培养阶段酵母生长的影响；研究不同甲醇补加速率对诱导表达阶段蛋白表达的影响；研究不同硫酸铵补加浓度对酵母生长和蛋白表达的影响。通过5L发酵罐放大培养获取较高的细胞密度和蛋白表达量。3）．建立和优化分离纯化工艺。采用生物信息学预测蛋白性质，利用蛋白之间的性质差别，选择合适的层析方法，优化层析过程参数，获取高纯度、高回收率、生物功能良好的基因工程抗体。
本课题确定了以下发酵和纯化工艺：1)．酵母表达条件：确定1%甘油添加量，29℃，pH6.5为最佳的培养条件，培养结束后4小时开始诱导表达，以1%甲醇添加量，29℃，pH6.25为最佳的诱导表达条件，在摇瓶中细胞密度达OD
600
=15.3，活性95%，抗体表达量达9mg/L，为发酵罐放大培养奠定了基础。2)．分批-补料工艺：确定溶解氧含量（dissolved oxygen, DO）的拐点上升作为最佳的补料时机。以9ml/(L/h)流速补加甘油同时补加硫酸铵至终浓度0.5g/L；以6ml/(L/h)流速补加甲醇同时补加硫酸铵至终浓度1g/L蛋白
表达量可以达到较高的，发酵结束时OD
600
≥250，活性90%，Fab表达量达150mg/L。与摇瓶相比细胞密度提高17倍，Fab表达量提高16倍。3)．分离纯化工艺：首先，根据本中心实际以及生物信息学分析确定的蛋白质间疏水性差别确立疏水层析分离。在四种疏水介质中选择疏水性差别最大的介质
PPG-600M。其次，确定纯化分离参数：平衡缓冲液为20mM PB+1M（NH
4）
2
SO
4
，
pH7.2；洗脱缓冲液为20mM PB+1M（NH
4）
2
SO
4
，pH7.2；洗脱方法为30%（2CVs）
洗脱液梯度洗脱-60%（2CVs）洗脱液梯度洗脱-100%（2CVs）洗脱液梯度洗脱；再生溶液为6M 尿素；柱床高度12.5cm；平衡和再生流速为10ml/min，洗脱流速为5ml/min。经上述分离纯化工艺获得的抗人角蛋白Fab抗体片段纯度
≥90%、回收率≥85%，生物功能良好。同时在5L规模证明该工艺具有进一步放大的潜能。
根据以上结果,我们确定了毕赤酵母表达抗人角蛋白Fab抗体片段的最佳培养与诱导表达条件，确定了甘油、甲醇、硫酸铵的补加策略，优化了酵母分批-补料发酵工艺。5L罐发酵结束后，细胞密度和蛋白表达量较摇瓶阶段提高17倍和16倍。成功分离纯化抗人角蛋白Fab抗体片段，解决了该基因工程抗体药物研发的关键问题。初步建立了毕赤酵母表达基因工程抗体高效发酵及纯化工艺。
关键词：毕赤酵母，基因工程抗体，发酵，纯化，抗人角蛋白Fab
Study of high efficient ferment technique and purification of genetically engineered antibody produced by Pichia pastoris
Master candidate Hao Tang
Supervisor Professor Zhi-nan Chen
Instructor Senior Technician Li Mi
Cell Engineering Research Center & Department of Cell Biology,
Fourth Military Medical University
Xi’an 710032
Abstract
Now antibody drug has become pillar industries of biotechnology drugs. By 2006, FDA approved 26 antibody drugs which can be used in vivo, including 21 therapeutic agents. In the world, the annual sales of antibody drugs in 1997 have increased from 310 million to 150 billion U.S. dollars in 2005. The percentage in biopharmaceutical industry has increased from one-fifth in 2000 to one-third in 2005.
Genetically engineered antibody has been the current of antibody drug. In the world there were 100,000 antibodies which have been reported, including 1,000 genetically engineered antibodies. With the rapid development of genetically engineered antibody, the new methods and ways of diagnosis, prevention and treatment of major disease have been acquired. But the bottleneck of industrial development is the expression and purification of genetically engineered antibody. There are two expression systems of genetically engineered antibody: prokaryotic
expression system, including secreted and inclusion, and eukaryotic expression system. Pichia pastoris has been applied for expression of genetically engineered antibody widely, because it not only has many eukaryotic expression system merits (post-translational modification, etc), but also is a simple, low-cost expression system. Based on anti-keratin antibody Fab fragment of target products, this study aimed at the establishment of efficient fermentation and purification process of genetically engineered antibody which produced by Pichia pastoris.
The contents of this research have been conducted in the following three aspects：1).Optimization of anti-keratin Fab expression condition. Glycerine concentration, temperature and pH of three levels were investigated by orthogonal design to determine their influence’s on cell growth. Induce opportunity, methanol concentration, temperature and pH of four levels were investigated by orthogonal design to determine their influence’s on Fab production. 2). Optimization of fed-batch condition. The best condition which can lead to high cell density and Fab production were determined by screening different fed-batch strategies of glycerine, methanol and ammonium sulfate in 5L fermentor. 3)．Establish and optimization of separation and purification condition. Firstly the protein characteristics were predicted by bioinformatics, and a suitable chromatography and media were determined. Then multiply parameters including equilibration, elution, and regeneration conditions, column scale, bed height, and flow rate, were compared and screened. Lastly, technology parameters which maintain high purity, high recovery and good bioactivity were determined.
The results have been conducted in the following three aspects：1). In shake flask, best cultivation condition for Pichia pastoris were 1% glycerine, 29℃,
pH6.5 with cell density of OD600=15.3, cell activity=95% and the best anti-keratin Fab expression condition were 1% methanol, 29℃, pH6.25 with antibody productor of 9mg/L. 2). The best timepoint for feeding was the bump of rapid upstroke of DO. In 5L fermentor, glycerine was add to fermentation broth with the flow-rate 9ml/(L/h) and ammonium sulfate at final concentration of 0.5g/L in cultivation period and methanol was add to fermentation broth with the flow-rate 6ml/(L/h) and ammonium sulfate at final concentration of 0.5g/L in induction period. Pichia pastoris cell density reached OD600≥250，cell activity=95% and anti-keratin Fab production reached 150mg/L. Compared with the shake flask cell density increased 17 times, Fab expression increased 16- times. 3). PPG-600M HIC was the most appropriate method investigated for the purification of Fab determined by bioinformatics analysis and screen experiment. The sodium phosphate buffer was more advantageous over Tris buffer for binding. For elution 20mM sodium phosphate (pH7.2) and 30%(2CVs)-60%(2CVs)-100%(2CVs) were chosen. The 6M urea was more effective cleaning agents than others. The best column bed height was 12.5cm. 10ml/min flow-rate was chosen for equilibration and 5ml/min for elution. The appropriate chromatography conditions were established and 85% recovery and purity larger than 90% and good bioactivity was achieved. The processes developed for the Fab fragment have been shown to be scalable further.
In conclusion, firstly, the appropriate cultivation and induction conditions for preparation of anti- keratin Fab were optimized and laid a solid foundation for scale up fermentation. Secondly, the best feeding strategy of glycerine, methanol and ammonium sulfate was determined, and fed-batch technology was optimized.
The cell density and Fab production was improved by 17 times and 16 times, respectively than that of shake flack. Thirdly, the appropriate chromatography conditions for anti-keratin Fab preparation were established and high recovery, purity and bioactivity were achieved. A high performance preparation technique platform for engineered antibody from Pichia pastoris has been established.
Key Words：Pichia pastoris, genetically engineered antibody，fermentation, purification, anti-keratin Fab
前言
抗体药物已成为当今生物技术药物的支柱产业，截至2006年，FDA批准的和在各期临床研究的生物药物中，抗体药物位居前列。抗体药物在全球的年销售额从1997年的3.10亿美元上升到2004年的103亿美元，2005年已达150亿美元，并预测2010年将超过300亿美元；其在生物制药产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2005年的1/3。目前，抗体药物已进入基因工程抗体时代，在全球已报道的10万多种抗体中，基因工程抗体有1000多种。抗体工程产品的快速发展，对于人类重大疾病，尤其是心脑肺血管疾病、恶性肿瘤、自身免疫病的诊断、预防与治疗提供了新方法、新途径。
但是阻碍基因工程抗体产业化发展的瓶颈是其表达和纯化。目前用于制备基因工程药物的表达系统包括原核表达系统（包括分泌表达系统和包涵体表达复性系统），真核表达系统。其中巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris，P．pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统，该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点，而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。而且与动物细胞相比，P．pastoris 培养基成分确定，无热源或毒素，不易污染，成本较低，适宜于规模生产药用蛋白。
本课题在已有工作基础上，以毕赤酵母表达抗人角蛋白Fab抗体片段为目标产品，研究优化酵母表达抗人角蛋白Fab抗体片段发酵工艺，建立高效、快速、可放大的纯化工艺，旨在建立毕赤酵母表达基因工程抗体制备的技术平台。
文献回顾
1．基因工程抗体与毕赤酵母表达系统
一、基因工程抗体
抗体药物已成为当今生物技术药物的支柱产业，截至2006年，经FDA 批准26个体内用抗体药物中，治疗剂21个。其临床适应症：肿瘤14个（53.8%），自身免疫病5个（19.2%），器官移植3个（11.5%），感染性疾病2个（7.7%），心血管疾病1个（3.8%），其它疾病1个（3.8%）。按照抗体进入临床应用的类型分析：鼠源30.8%，嵌合抗体23.1%，人源化42.3%，全人抗体3.8%。
抗体药物呈现强劲增长势头，2006年有5种抗体药物销售额超过20亿美元，进入生物技术药物前10位，其年增长率达40%-70%，成为拉动生物制药快速发展的主力军。抗体药物在全球的年销售额从1997年的3.10亿美元上升到2004年的103亿美元，2005年已达150亿美元，并预测2010年将超过300亿美元；其在生物制药产业中所占份额也从2000年的1/5上升到2005年的1/3，抗体药物具有巨大的经济和社会价值。抗体工程产品集成了20世纪50年代以来生命科学发展最前沿的成果和生物工程最关键的技术，是生物制药实现产业化的重要标志。
目前，抗体药物已进入基因工程抗体时代，在全球已报道的10万多种抗体中，基因工程抗体有1000多种。抗体工程产品的快速发展，对于人类重大疾病，尤其是心脑肺血管疾病、恶性肿瘤、自身免疫病的诊断、预防与治疗提供了新方法、新途径。可以预见基因工程抗体在生命科学领域将发挥越来越重要的作用[1]。
基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性，借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造[2]。对完整抗体改造类型包括嵌合抗体和改形抗体两种，对抗体片段的改造类型包括Fv、最小识别单位、Fab或嵌合Fab片段、单链抗体、单区抗体和双功能抗体等。其中，Fab片段由重链(H链) V区及CH1与一条完整的轻链(L链) 组成，二者通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体，是完整抗体的1/3，仅一个抗原结合位点。如果CH1与L链的C 区是人源的就称为嵌合Fab。其优点在于：理化性质较稳定，且分子量小，穿透力强，免疫原性低，可与多种药物及放射性同位素耦联，多用作导向药物的载体。
人体内天然存在的抗角蛋白自身抗体(anti-keratin auto antibody，AK auto Ab)是维持机体免疫状态平衡的重要成员。一些病理情况下(如银屑病、接触性皮炎等)，AK auto Ab的存在有利于限制病情的进展，促进损伤的修复，对机体具有有益的保护作用[3]。动物实验和体外研究都提示[4]，当机体内AK auto Ab水平低下时，人为地补充抗角蛋白抗体有可能成为该类疾病新的治疗措施。王刚、樊建勇等利用噬菌体抗体库技术，从半合成噬菌体抗体库中克隆、筛选到人源性抗角蛋白抗体并成功地进行了表达。ELISA和Western blot 等方法检测显示，该抗角蛋白抗体具有较强的角蛋白结合活性和抗原特异性[5,6]。鉴于酵母表达系统表达的产物类似于天然蛋白，保持了很好的生物学活性，表达条件易于控制及易于工业化生产等优势，故樊建勇等选用毕赤酵母细胞表达系统进行了抗角蛋白Fab抗体的分泌表达[5,7]，结果显示该抗体具有较强的角蛋白结合活性和抗原特异性，深入研究显示，该抗体药物有望应用于临床治疗相关疾病，因此建立规模制备该抗体的工艺成为该抗体药物研发的关键。
二、毕赤酵母表达系统
目前用于制备基因工程药物的表达系统包括原核和真核表达系统。原核表达系统主要是大肠杆菌表达系统，它具有表达水平高、操作简单、周期短、易于大规模高密度培养、成本低等优点，往往成为表达抗体片段以及表达产物翻译后修饰的有无不影响功能和活性的蛋白类药物的首选表达系统。而对于全抗体和糖蛋白类生物药物来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成、糖基化的有无以及糖基化的类型常常影响表达产物的合成分泌、生物活性、体内稳定性以及免疫原性等特性[8,9]由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等
可用于进行糖基化的结构和机制，所表达的产物是非糖基化的，且常常以包涵体的形式存在。
与其它原核细胞表达系统相比，目的基因在哺乳动物细胞中表达的蛋白与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式相似且能正确组装成多亚基蛋白，并且哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L以上[10]。在表达这一类蛋白药物时人们往往首选CHO细胞表达系统。但是与大肠杆菌相比，哺乳动物细胞的表达水平低、获得高表达细胞株所需的时间长、细胞大规模培养的成本高等导致哺乳动物细胞生产的蛋白质类药物的成本较高。
与以上表达系统相比，酵母作为单细胞真核生物，它既具备了原核生物生长快速、培养基廉价和实验手段简单可行的特点，还克服了原核表达系统的一系列缺陷，如：缺乏真核生物的蛋白翻译后修饰和加工、表达产物多以包涵体形式存在，复性困难且效率很低(<20％)、背景杂蛋白多，不易于纯化等；具备典型的真核生物分子生物学特性，可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰等。而且，酵母可以通过高密度发酵(细胞干重可达120 g／L以上)获得大量产物，且分泌产物与天然蛋白相似，临床应用较安全[11]。，迄今为止，已有400多种外源蛋白在此体系中成功表达[12]。
最先使用的是酿酒酵母, 1981年Hitzeman等用酿酒酵母成功地表达了人干扰素,但该系统具有一定的局限性,缺乏强有力的启动子,分泌效率差,质粒不稳定等。因此,人们在此基础上又寻找了新的酵母表达系统—甲醇营养型表达系统[13]。甲醇营养型酵母是单细胞低等真核生物,主要包括念珠酵母Candida, 球拟酵母（Torulopsis）, 汉森酵母（Hanseaula）和毕赤酵母（Pichia）四类[13]。现常用作表达的宿主菌主要是毕赤（Pichia）酵母。
巴斯德毕赤酵母是一种可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长的酵母菌，它们细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶。如醇氧化酶、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的第一个酶，它催化甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢。有AOX1和AOX2两个基因编码AOX。AOX1基因严格受甲醇诱导和调控；AOX2基因与AOX1基因序列相似，有92％的同源性，其编码蛋白有97％的同源性。AOX1基因的编码产物在氧化过程中起主要作用。在甲醇培养的细胞中，该酶可占总蛋白的30％以上，而在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时，则不能检测到AOX的活性[11]。毕赤酵母表达系统使用的醇氧化酶基因(AOX1)启动子为强诱导型启动子，可有效地调控外源基因的高效表达；采用整合型载体，可将外源基因整合到酵母染色体上，从而获得遗传稳定的菌株；其表达量高，有许多蛋白的表达水平可达每升数克以上，如破伤风毒素C片段表达量高达12g／L[14]，明胶表达量达到14.8g／L[15]。Wateram 在P.pastoris中克隆到3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)基因的启动子，由于该组成型启动子不需要甲醇诱导，且在葡萄糖培养基组成型表达的活力与AOX1启动子不相上下，所以在食品工业应用前景广阔。其局限性是不能控制外源基因的表达，仅适用于表达产物对菌体不产毒副作用的外源基因[16]。P.pastoris的FLD1基因编码谷胱甘肽依赖型的甲醛脱氢酶，其启动子受甲醇或含有甲胺(无毒)的葡萄糖所诱导。表达水平
与受AOX1启动子调控下表达水平相当[17]。
毕赤酵母的表达产物既可以胞内表达。又可以外泌到培养基中。由于毕赤酵母自身只是低水平地分泌少量内生蛋白，而且培养基也没有外加的蛋白。所以分泌型外源蛋白占培养基蛋白总量的80%-90%。这就为后续的纯化工作带来便利。
虽然许多蛋白质在P．Pastoris中可高效表达，如明胶表达量高达14.8 g/L[15]，但仍有一些蛋白质表达量相对较低，如β-cryptogein表达量约为1-5 mg/L[18]。同一表达系统，对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。主要有两方面的因素影响外源蛋白在毕赤酵母中的表达：一方面是外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用；另一方面，表达条件对表达量高低的影响也极其显著[19]。
（1）外源基因的内在特性
①5'-不翻译区(UTR)的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5’非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译。UTR太长或太短会造成核糖体40S亚单位识别的障碍。A0X1基因5'-UTR长为114nt，并富含A+U，因此对于最佳蛋白的表达量，维持外源基因mRNA5-UTR尽可能和AOX1的mRNA5'-UTR相似是必需的，最好保持二者一致。这种方法使人血清白蛋表达量提高了50倍[20]。
②A+T含量过高的基因在P．Pastoris中表达有时会造成转录提前终止。共有序列ATTATTT-TATAAA就是一个转录提前终止信号，还有一些未确定的转录提前终止信号存在于AT富含区。控制A+T 含量在30％-55％。使破伤风毒素C片段得到高效表达[21]。
③低频率利用的密码子：通过对110个酵母基因使用密码子的统计分析，确证了密码子的嗜好性与基因表达量密切相关[22]。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。在所有的61个密码子中有19～25个
是酵母所偏爱的[23，24]。高表达的基因几乎毫无例外地使用这25个偏爱密码子。P．Pastoris表达植酸酶时，把酵母中使用频率为零的精氨酸密码子突变为使用频率较高的密码子，表达水平提高了37倍[25]。
④外源基因的长度，直接影响其转化率，当外源基因大于1 kb时，转化率大于50％；外源基因小于0.5 kb时，转化率猛降至小于0.1％[26]。 （2）表达条件
①甘油含量。毕赤酵母的培养常采用两阶段培养法。第一阶段为积累生物量的间歇生长期。间歇期通常以甘油为碳源，以积累菌体为目的，当菌体浓度增加到一定值，同时甘油消耗完毕后，开始进入流加甲醇的第二阶段。因此甘油在第一阶段中对细胞生长起着重要的作用。但是并不是甘油越多越有利，高密度发酵过程中，补加的甘油过量时，由于溶氧的供应不足，甚至为零，容易导致甘油的厌氧发酵而产生乙醇、乳酸等，导致pH的变化，对基因工程菌的外源目的蛋白表达极为不利[27]。
②甲醇含量。一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养体积的O.5％，但在表达GA时，甲醇含量为O.75％ 时表达量最高，超过或低于该浓度都会导致表达量的下降[28]。而Mut+代谢甲醇的能力强，有研究者每天添加甲醇到3％，无不良影响。
③温度。温度对毕赤酵母的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的结果[29]。温度对毕赤酵母发酵产物的活性、发酵液的物理性质(溶解氧量、基质的分解吸收速率等)及生物合成方向等都有影响。从酶动力学角度看，温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但温度过高，又会使酶易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的产量。据报道，毕赤酵母的培养温度为28℃-30℃，28℃是酵母生长的最适温度，30℃是外源蛋白表达的最适温度。诱导期间，
如果温度超过32℃，对蛋白表达不利，甚至会导致酵母死亡。
④pH。培养基的pH不论对毕赤酵母生长还是对蛋白的分泌表达都是相当重要的。pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。在pH值3.0-7.0的范围内均可生长，但当pH低于2.2时毕赤酵母停止生长，当控制pH恒定(5.0)时表达量最高[28]。邱荣德的报道[30]认为，如果用两步法来诱导外源蛋白的表达，则诱导时的起始pH值可能是毕赤酵母高效表达重组蛋白的关键之一， 通过改变诱导时的pH值，可使表达量提高50％以上。因此pH的测量和控制在发酵过程中显得非常重要。
毕赤酵母高密度发酵过程中pH的调控是通过在线补加氨水和盐酸来平衡酸碱性的。其中，氨水既是酸碱的调节剂，又为毕赤酵母发酵提供氮源。尤其在基因工程抗体分泌表达过程中，有些蛋白对pH值比较敏感，容易受到蛋白水解酶的水解，因此，必须选择合适的pH值，既可以高效表达目的蛋白又能抑制蛋白酶的水解，保持目的蛋白的稳定性。尽管毕赤酵母生长的pH值范围比较宽，但是具体到不同的毕赤酵母，就各有不同的最适生长pH值。
发酵培养基的pH对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下几个方面[29]：ⅰ.影响酶的活性，当pH值抑制毕赤酵母中某些酶的活性时，会阻碍毕赤酵母的新陈代谢；ⅱ.影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；ⅲ.影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响毕赤酵母对这些物质的利用。
⑤DO。发酵基质中溶氧量(DO)对于毕赤酵母生长是非常重要的，在发酵过程中，保证氧的供给，是提高发酵产量的重要因素[29]。
高密度发酵过程中，有报道认为如果用发酵罐进行培养，外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶高出10-100倍，主要原因是普通摇瓶发酵的通气不理想，影响了毕赤酵母的高密度生长及表达。毕赤酵母是好氧微生物，它的生
长代谢过程需要氧气的参与，DO浓度对毕赤酵母的生长和产物生成的影响很大，DO的浓度过高或过低都会影响酵母的代谢，使后期的生长变得极为缓慢。毕赤酵母在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵时间的延长，毕赤酵母密度迅速增加，DO浓度随之下降，毕赤酵母生长减慢。在高密度发酵的后期，由于毕赤酵母密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果抑制了毕赤酵母的生长繁殖。因此保持一定的溶氧浓度，可以降低底物和有害废物的抑制作用，实现高密度发酵。研究表明，在毕赤酵母高密度发酵的过程中，如溶氧低于20％，将会使其生长和代谢受到影响。但如果溶氧过高(超过60％)，就会发生氧中毒。可见，溶氧过高或过低都对外源蛋白的表达有很大影响。因此，使溶氧保持在有利于外源蛋白高效表达的范围对于高密度发酵来说是非常重要的。增加通气量的措施有培养基体积不超过摇瓶体积10％-30％、把摇瓶斜置于摇床上、提高摇床转速等，当然生物反应器的溶氧控制更加充分，更加有利于高密度发酵。
⑥培养基，在高密度发酵条件下，培养基的组成直接影响了细胞的生长和外源基因的表达乃至毕赤酵母的遗传稳定性。在毕赤酵母高密度培养时，大多数采用Invitrogen公司提供的培养基，如BMGY／BMMY、BMG／BMM、MGY ／MMY等。其中BMGY／BMMY、BMG／BMM培养基中包括磷酸缓冲液，常用来表达分泌蛋白，适用于外源蛋白活性受pH影响较大的情况，可以维持在一定pH范围内获得最佳的蛋白表达量。培养基中的酵母膏和蛋白胨，可作为富营养物，使菌体更好地生长，从而导致总的蛋白量增加。
⑦诱导前OD值。理论上，OD值越高，生物量越大，则总的表达量也越大。但OD值过高，培养基中氧和营养供给越受限制。
⑧表达的外源蛋白对蛋白酶的敏感与否也影响蛋白的产量。通常是调整
pH 改变酶活性[20]；培养基中添加1％ 酪氨酸蛋白水解物[31，32]；使用蛋白酶缺陷受体菌SMDl168，有报道使用SMD1168比使用GSll5表达量提高2倍[33]。
事实上高细胞密度不一定有利于外源蛋白的产生，这有赖于所要表达的外源蛋白的性质，如溶解性、稳定性、毒性等。影响外源蛋白在P．Pastoris 中表达的因素是多方面的。许多因素对蛋白表达量的影响是巨大的，有时仅仅改进其中一个或几个方面不一定有明显效果，必须全面考虑各种因素。
在已有工作和本中心现有条件的基础上，本研究拟对毕赤酵母表达的抗角蛋白Fab抗体工艺进行深入研究，首先确定最佳的表达条件，为优化发酵工艺奠定基础。
2．毕赤酵母规模培养的模式
毕赤酵母的规模培养中，就操作方式而言，可分为批式 (batch)，分批-补料或流加式(fed-batch)、连续(continuous)等几种操作方式[34]。
分批操作是指将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞产物的培养基的操作方式。该方式的优点是操作简单，时间短，可直接放大。但随着营养物的消耗和副产物的积累，细胞所处的生长环境不能从始至终保持最优状态，从而导致细胞的状态出现较大的波动。
分批-补料或流加操作方式是指将细胞和培养基装入生物反应器后，随着细胞的增长对营养物质的消耗，不断补充或分批补加新的营养成分，使细胞连续生长代谢，最终将细胞与产物一并收获。该操作的特点是能够调节培养环境中营养物质的浓度以防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物形成，这是和分批操作的主要区别。
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
xx酵母表达实验手册 （作参考） 部分试剂中英文名称： 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制： 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：
配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注： 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。 完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）： 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵 及酶学性质分析 姓名：李善军 学号：2015304120225 院系：华中农业大学生科院
摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。 关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析
本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。 毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。 1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵 1.1种子液培养 1.1.1种子培养基 YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%） YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2% 1.1.2培养温度与菌龄 挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。 1.2发酵罐培养 1.2.1菌体培养 清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor （α-factor ）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ 系列选用的是Zeocin 抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG 便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang ：pPICZ 系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K 还是pPICZ 系列？pPIC9K 属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ 系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin 筛选（PIC9K 操作麻烦一点，大肠用amp 抗性，而毕赤酵母先用His 缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD ）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie ：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD ，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET 系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA 片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA 片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor 可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N 端不能出现任何多余的aa （比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor 序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题； ④无论pPICZ 还是pPICZα都有TGA （终止密码子），但是pPICZ 系列没有ATG （起始密码子），有人认为酵母启动
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展 夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏2 1.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039； 2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071； 3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000 ［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78 ［文献标识码］A ［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04 Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer?mentation XIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2* 1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850; 3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China *Corresponding author,E-mail:liuzhm@https://www.doczj.com/doc/899136851.html, ［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently. High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ?est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ?um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questions existing in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentation course 综述 doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.026 20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类 疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母 大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模 的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L [4]，破伤风片段C 产量高达12g/L [5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L [6]等，而最低的报道只有1mg/L ，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-density fermentation ）也成为一个关键技术环节。 1 毕赤酵母工程菌的选择和改良 1.1 工程菌的选择 目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut +和mut s ，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制 性培养基上生长缓慢（methanol utilization slow ， mut s 或mut -），它们只能利用弱的aox2基因启动合成 收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail ）liuzhm@https://www.doczj.com/doc/899136851.html,
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
微生物发酵罐发酵（毕赤酵母） 灭菌前： 室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）； 室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定 灭菌： 1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至 80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在 0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。 2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。 （注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。） 灭菌后: A.消耗甘油阶段 1.灭菌后冷却30℃时： 2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐； 3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。 4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。 【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。】 5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。重组蛋白质不产生。 B.甘油补料阶段 1.将12ml/L PTM1加入50%VVM的甘油中，将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。 2.甘油补料将进行约4h或更长。在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞，但是不会有重组蛋白质的产生。 【4％甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。】 重要:如果溶氧低于20％，应该停止甘油或甲醇的补料并且不做任何提高溶氧的