出凝血23.1血管性假性血友病因子抗原（VWF:Ag）含量测定（ELISA 法）（第四版） 出凝血23.2原理： 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理定量测定凝血因子VIII相关抗原(VWF:Ag)水平。包被抗人VWF:Ag抗体与待测血浆中VWF:Ag 结合，加入酶标抗体后形成复合物，后者与底物作用呈现颜色反应。490nm处测得的A值与待测血浆VWF:Ag含量成正相关。 出凝血23.3标本处理： 患者处于休息状态下，采空腹静脉血（急诊病人除外）。采血者应技术熟练，“一针见血”，以防止组织损伤，使外源性凝血因子进入标本。最好不与其它实验一起采集而使血液停留在针管的时间延长。采完血后，将血液沿管壁缓缓注入试管，避免产生气泡；然后迅速将血液和抗凝剂轻轻颠倒混匀，避免用力震荡。 全血要在1小时内分离血浆。分离乏血小板血浆时，要在室温下3000rpm离心10分钟，室温下可存放4小时。全部试验不能在4小时内完成，应将乏血小板血浆分装在0.5～1.0ml的小试管中快速冷冻，储存于-20℃冰箱中。-20℃可保存3个月。冷冻过的标本可再次冷冻，不影响本实验结果的准确性。冷冻血浆融化时，应将盛冷冻血浆的容器置于37℃水浴中，并轻轻摇动，使其迅速融化。 出凝血23.４试剂：购于上海太阳生物技术公司。内含可拆式包被反应条：8孔×12；酶标抗体1瓶；标准血浆6支；底物OPD片剂6
片； 10×稀释液1瓶；20×洗涤液1瓶；底物缓冲液1瓶；终止液：1瓶 出凝血23.5 仪器： BIOTEK EL312e型全自动酶标分析仪 LRH-150型生化培养箱 出凝血23.6 方法： 1）试剂重建：浓稀释液用前置于37℃水浴15分钟,然后用蒸馏水作10倍稀释；浓洗涤液用前置于37℃水浴15分钟,然后用蒸馏水作20倍稀释；每支标准血浆用2ml稀释液准确复溶（稀释了20倍，设定此时VWF:Ag含量为200%），取200ul 用稀释液做5次倍比稀释，得到200%、100%、50%、25%、 12.5%、6.25%六个标准点；将待测血浆用稀释液作40倍稀释 （25ul待测血浆+975ul稀释液）。 2）加样：每孔加不同浓度标准血浆或待测稀释血浆100ul，空白对照孔加稀释液100ul，37℃孵育75分钟。 3）洗涤：弃取反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复3次后拍干。 4）加酶标抗体：每孔加酶标抗体100ul，37℃孵育45分钟。 5）洗涤：弃取反应孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置3秒钟，甩干，反复3次后拍干。 6）显色：临用前每片OPD用5ml底物缓冲液溶解。每孔加底物液100ul，37℃孵育10分钟。
血友病的主要治疗方法有哪些 新鲜全血、血浆或新鲜冰冻血浆(FFP)可用于凝血因子的替代法治疗。但需输注的量大，且有导致高血容量的危险，甚至在大量输注后血浆凝血因子仍不能达到足够水平。此外，输入的大量红细胞和晶体将导致原有的凝血因子稀释而加重出血倾向，因此在第一个血容量( L)输注时就应开始用浓缩因子制剂作替代性治疗，后者以较小的容量而达到足够的血浆水平。替代治疗的剂量选择，取决于血友病类型、出血的严重程度和所希望达到的血浆因子水平 (%)。因正常血浆中FⅧ或FⅨ平均水平为100% ，起止血作用的最小有效水平在血友病甲为25 ～30 % 血友病乙为 20～25 % 一般需将血浆因子水平提高到 30%以上。 1、局部止血治疗 包括局部压迫、放置冰袋、局部用血浆、止血粉、凝血酶或明胶海绵贴敷等。 2、替代疗法 (1)输血浆：为轻型血友病的首选有效疗法。新鲜血浆和新鲜冰冻血浆含有所有的凝血因子。故对严重出血，必须用因子Ⅸ浓缩剂。 (2)冷沉淀物：所含因子Ⅷ较新鲜血浆高5~10倍。须冷冻干燥存于-20°C下，室温下放1小时活性即丧失50%，故应于1小时之内输完。 (3)中纯度因子Ⅷ制剂已被广泛用于临床(国内普遍使用的药物)。 (4)凝血酶原复合物浓缩剂。 (5)重组人凝血因子。(国内刚刚开始采用，日后普及的趋势。高科技人工合成的，打破以前从人血中提纯的手段，没有病菌污染，使用更安全。) 3、去氨基-D-精氨酸血管加压素 4、肾上腺皮质激素 改善毛细血管通透性，对控制血尿、加速急性关节积血的吸收及对有Ⅷ因子抗体的患者有一定疗效，可与输血浆及浓缩剂合用。 5、抗纤溶药物：常用6-氨基已酸，有血尿及脑出血者禁用。 6、达那唑。 7、避免创伤或较重的体力活动 尽量避免注射和手术。 (如必须手术，一定要咨询血友病医生，将凝血因子含量暂时提
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断 人（Human）血管性血友病因子（vWF） ELISA检测试剂盒 使用说明书 检测原理 试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被血管性血友病因子（vWF）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管性血友病因子（vWF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 样品收集、处理及保存方法 1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。 2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。 3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。 4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。 5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。自备物品 1.酶标仪（450nm） 2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3.37℃恒温箱 操作注意事项 1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。 2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。 3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。 4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。 5.所有液体组分使用前充分摇匀。 上海笃玛生物科技有限公司
《血友病治疗中国指南（2020年版）》要点 血友病是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，可分为血友病A和血友病B两种。前者为凝血因子（F）缺乏，后者为凝血因子（F）缺乏，分别由相应的凝血因子基因突变所致。近两年来，各种长效凝血因子产品和非因子类产品相继问世，部分产品已经在我国上市。因此，有必要对于过去的共识/指南进行更新。 一、治疗原则 血友病患者应该在血友病中心接受综合关怀团队的诊疗与随访。急性出血时应及早到附近的专业医疗机构接受治疗或者在家庭进行自我注射。早期治疗可以减少疼痛、功能障碍以及远期残疾，并显著减少因并发症导致的住院。家庭治疗必须由血友病中心的专业人员密切监管，且只有在患者及其家属得到充分的教育和培训后才能开始进行。 血友病患者应避免肌肉注射和外伤。原则上禁服阿斯匹林或其他非甾体类解热镇痛药以及所有可能影响血小板功能的药物。若有出血应及时给予足量的替代治疗，进行手术或者其他创伤性操作时，应进行充分的替代治疗。二、替代治疗的药物选择和给药方法 血友病A的替代治疗首选基因重组F制剂或病毒灭活的血源性F制剂，无上述条件时可选用冷沉淀或新鲜冰冻血浆等。每输注1IU/kg体重的F可使体内F活性（FC）提高2％。F在体内的半衰期约8～12h，要使体内F保持在一定水平需每8～12h输注1次。 血友病B的替代治疗首选基因重组F制剂或病毒灭活的血源性凝血酶原复合
物（PCC），无上述条件时可选用新鲜冰冻血浆等。每输注1IU/kg体重的F 可使体内F活性（FC）提高1％，F在体内的半衰期约为 18～24h，要使体内 F保持在一定水平需每天输注1次。 三、替代治疗的实施 （一）按需治疗和围手术期替代治疗 按需治疗是指有明显出血时给予的替代治疗，目的在于及时止血。及时充分的按需治疗不仅可以及时止血止痛，更可阻止危及生命的严重出血的发展。围手术期替代治疗是指手术前、手术中和手术后进行的替代治疗，目的在于保证血友病患者手术的顺利实施和手术后的顺利康复。具体替代治疗方案见表1和表2。 （二）预防治疗 预防治疗是指为了防止出血而定期给予的规律性替代治疗，是以维持正常关节和肌肉功能为目标的治疗，通常分为以下三种： （1）初级预防治疗： （2）次级预防治疗： （3）三级预防治疗： 我们建议在发生第一次关节出血或者严重肌肉出血或颅内出血或其他危及生命的出血即应开始预防治疗关于预防治疗，国际上没有统一的标准方案。最低剂量为英国1976年在血友病A中使用12IU/kg，每周1次。 基于我国实际情况，目前仍普遍采用的是以下低剂量方案：血友病A：F制剂10IU/kg体重每周2～3次；血友病 B：F制剂 20IU/kg 体重每周1 次。非因子类产品的上市彻底改变了血友病 A 替代治疗模式。
血管性血友病因子裂解酶抗原及活性与年龄及性别 的关系分析1 董宁征，季顺东，阮长耿 苏州大学附属第一医院，江苏苏州（215006） E-mail：changgengruan@https://www.doczj.com/doc/8011150614.html, 摘要：目的：通过检测健康体检者血浆中ADAMTS13的抗原及活性，比较不同性别和年龄组间ADAMT13的抗原及活性的差别，分析ADAMTS13与年龄及性别的关系，为ADAMTS13相关疾病的判断提供依据。方法：用Frests-VWF73试剂盒检测血浆中ADAMTS13的活性；用夹心酶联免疫反应试剂盒（ELISA）检测ADAMTS13抗原含量。结果：各年龄组ADMATS13 的活性均值无显著差异；而ADAMTS13抗原量随年龄的改变而改变，21-40岁年龄组最高，为109.7 ± 23.3 % ，在60岁以上组及低龄组（16-20岁）显著降低；ADAMTS13的抗原及活性水平在男女性别间无显著差异。 关键词：血管性血友病因子裂解酶; 抗原; 活性；年龄；性别 血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13) 是一种调控血管性血友病因子（vWF）结构与功能的金属蛋白酶，其作用于vWFA2区 842位酪氨酸与843 位蛋氨酸之间的肽键，将VWF 单体裂解为相对分子量为170 × 103和140 × 103的两个片段[1]。 ADAMTS13活性的变化与多种生理病理状态下相关，ADAMTS13活性的缺乏，系血栓性血小板减少性紫癜（TTP）发病的主要机制，也是诊断TTP的重要标准。ADAMTS13抗原及活性在不同年龄正常人群的分布情况，及其与性别的关系，国内外研究资料甚少，国外仅有文献报道ADAMTS13活性与年龄的关系[2]。本文旨在研究ADAMTS13与年龄及性别的关系，为临床疾病的判断提供依据。 1. 对象及方法 1.1 研究对象 健康体检者共 87 例，年龄l6～78岁，平均年龄(45.3±21.4)岁；男性44例，年龄16～78岁，平均(45.0±21.6)岁；女性43例，年龄l7～75岁，平均年龄(42.6±21.2) 岁，均无血栓性疾病史。正常人混合血浆取自40例献血员。 1.2方法 1.2.1 血样标本采集和保存: 取静脉血, 使用0.129mol/L的枸橼酸钠抗凝，采集后均3000rpm离心5分钟，分离血浆，分装后冻存-30℃备用。 1.2.2 ADAMTS13 活性的测定[3] 应用Frets-VWF73试剂盒（购自日本Peptide Institute）检测ADAMTS13的活性。根据试剂盒使用说明进行操作，使用前依次加入37μl DMSO和117μl水溶解荧光标记的ADAMTS13底物Frets-VWF73，用反应缓冲液（5 mM Bis-Tris, 25mM CaCl2, 0.05%Tween-20, 1本课题得到国家自然科学基金资助项目（30470732）教育部博士点基金（k5122501）苏州大学附属第一医院血液学“135工程”重点学科开放课题基金（135XY0406）的资助。
血管性假血友病(VWD) 什么是什么是血管血管血管性假血友病性假血友病性假血友病(VWD)(VWD)(VWD)？？ 血管性假血友病(VWD)是遗传性出血性疾病的最常见类型。该病患者的血液中帮助控制出血的一种名叫冯维勒布兰德因子(VWF)的蛋白质出了问题。 当一个血管受伤出血，冯维勒布兰德因子(VWF)帮助血液中名叫血小板的细胞结合起来形成血块来止血。血管性假血友病(VWD)患者没有足够的冯维勒布兰德因子(VWF)，或者它不能正常起作用。因此凝血和止血时间变长。 血管性假血友病通常没有其它出血性疾病严重。许多血管性假血友病患者可能不知道自己有这种病，因为他们的出血症状很轻。对绝大多数患者而言，此病对他们的生命影响很小或没有损害，除非严重受伤或需要手术。然而，所有形式的血管性假血友病都可能有出血问题。 据估计全世界大约千分之一的人口有血管性假血友病，但是因为许多人的症状非常轻，所以只有少数人知道他们有这种病，而大多数患者没有诊断。 血管性假血友病血管性假血友病的类型的类型的类型 血管性假血友病有三种主要类型。在每种类型中，此病可能分为轻度，中度，或重度。每种类型中出血症状可能差别相当大，部分依赖于冯维勒布兰德因子(VWF)的活性。 知道一名患者的血管性假血友病是什么类型很重要，因为各种类型的治疗是不同的。 第一种类型 第一种类型最常见。第一种类型患者的冯维勒布兰德因子(VWF)水平比正常人低。症状通常非常轻。然而，第一种类型的某些患者有可能严重出血。 第二种类型 第二种类型包含了冯维勒布兰德因子(VWF)结构上的一个缺陷。冯维勒布兰德因子(VWF)蛋白质不正常起作用，导致冯维勒布兰德因子(VWF)活性低于正常值。第二种类型有不同种类的缺陷。症状通常为中度。 第三种类型 第三种类型通常最严重。第三种类型患者的冯维勒布兰德因子(VWF)非常少或没有。症状要严重得多。第三种类型患者可能会肌肉和关节出血，有时没有损伤。 更多资料，请访问 https://www.doczj.com/doc/8011150614.html, ，中文资料请访问https://www.doczj.com/doc/8011150614.html,
简述血管性血友病 *导读：鼻衄、牙龈出血、皮肤瘀斑常见，偶有血尿、胃肠道出血及颅内出血，关节出血罕见。外伤或手术后出血严重，且不易止血。女性月经过多。…… 【概述】 血管性血友病是常染色体不完全显性遗传性疾病。由于血管性血友病因子(vWF)缺乏或异常，临床表现为出血、出血时间延长。 【诊断】 一、病史及症状 ⑴病史提问：注意发病的年龄、出血的诱因、出血程度及部位，出血的程度和频度是否随年龄的增长而趋于减轻。女性是否有月经过多或产后出血过多史。 ⑵临床症状：鼻衄、牙龈出血、皮肤瘀斑常见，偶有血尿、胃肠道出血及颅内出血，关节出血罕见。外伤或手术后出血严重，且不易止血。女性月经过多。 二、体检发现 皮肤粘膜可见瘀斑，创伤部位渗血，如有关节出血可见关节肿胀，压痛，活动障碍。 三、辅助检查 1. 血象：红细胞、白细胞、血小板计数及形态正常。
2. 出血时间延长或阿斯匹林耐量试验阳性。 3. 活化的部分凝血活酶时间延长或正常。 4. 血小板粘附率降低或正常(64.2%±8.3%)。 5. 因子VIII凝血活性测定降低或正常。 ６.vWF抗原(vWF：Ag)减低或正常。 ７.血管脆性试验阳性。 四、鉴别诊断 应与血小板无力症、巨大血小板病、血友病等凝血因子缺乏性疾病鉴别。 【治疗措施】 1. 忌服影响血小板功能的药物：阿斯匹林、潘生丁、消炎痛等。 2. 替代治疗：输注冷沉淀物。用法、剂量参照血友病甲的治疗方法。 3. 6-氨基己酸：75mg/kg，口服，1次/6h，共7～10d。或4～6g，静滴30min，3～4次/d。 4. DDAVP(1-去氨-8-D-精氨酸血管紧张素)：0.3mg/kg，溶于50ml 盐水，静脉注射15min，3～4次/d。II B型血管性血友病禁用。 5. 局部出血：压迫止血为主。
血管性血友病 血管性血友病 血管性血友病(vonWillebranddisease，vWD)分为两种：遗传性血管性血友病(cvWD)和获得性血管性血友病(avWD)。遗传性血管性血友病是一种常染色体遗传性疾病，多为显性遗传。以自幼发生的出血倾向、出血时间延长、血小板黏附性降低、瑞斯托霉素诱导的血小板聚集缺陷，及血浆vWFAg缺乏或结构异常为特点。在遗传性出血性疾病中，其发病率可能仅次于血友病，约为4～10/10万，但在我国本病的发生率较低。获得性血管性血友病可在多种疾病的基础上发生，少数患者可无基础疾病。 【病因与发病机制】 vWF主要存在于内皮细胞、巨核细胞及血小板，生理功能：①与FⅧ：C以非共价键结合成vWF-FⅧ：C复合物，即FⅧ。vWF增加FⅧ：C稳定性、防止其降解，并促进其生成及释放;②vWF在血小板与血管壁的结合中起着重要的桥梁作用。血小板活化时，vWF的一端与血小板糖蛋白Ⅰb结合，另一端则与受损伤血管壁的纤维结合蛋白及胶原结合，使血小板能牢固地黏附于血管内皮；③vWF 可与血小板糖蛋白Ⅱb／Ⅲa结合，诱导血小板聚集。 vWF基因位于12号染色体短臂末端，当其缺陷时，vWF生成减少或功能异常，伴随FⅧ：C中度减低，血小板黏附、聚集功能障碍。 获得性血管性血友病涉及多种发病机制。最常见的是产生具有抗vWF活性的抑制物，主要为IgG；其次为肿瘤细胞吸附vWF，使血浆vWF减少；另外，抑制物可与vWF的非活性部位结合形成复合物，加速其在单核-巨噬细胞系统的破坏。 【临床表现】 出血倾向是本病的突出表现。与血友病比较，其出血在临床上有以下特征：①出血以皮肤黏膜为主，如鼻出血、牙龈出血、瘀斑等，外伤或小手术（如拔牙）后的出血也较常见；②男女均可发病，女性青春期患者可有月经过多及分娩后大出血；③出血可随年龄增长而减轻，此可能与随着年龄增长而vWF活性增高有关； ④自发性关节、肌肉出血相对少见，由此致残者亦少。 【实验室检查】 （一）出血时间 BT延长是vWD最常见的实验室异常，阿司匹林耐量试验多呈阳性。口服阿司匹林0.6g后2小时及4小时测BT，比服药前延长2分钟以上为阳性。 （二）血小板黏附试验 多数患者血小板黏附功能减低。 （三）瑞斯托霉素血小板聚集试验(RIPA) 患者血小板对瑞斯托霉素的诱导不产生聚集，为vWD的特异性诊断试验之一。 （四）vWF抗原(vWFAg)测定 在多数vWD患者降低。 （五）FⅧ：C活性测定 多数患者FⅧ：C活性中度降低。 【诊断与分型】 （一）诊断要点
人血管性血友病因子/瑞斯托霉素辅因子(VWF) 酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书 产品编号：E0833h
自备物品 1、酶标仪（建议仪器使用前提前预热） 2、微量加液器及吸头，EP管 3、蒸馏水或去离子水，滤纸 标本的采集及保存 1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4g离心20分钟，取上清即可 检测，或将上清置于-20保存，但应避免反复冻融。 2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000 或-80 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20保存，但应避免反复冻融。 4、样本处理：血清或血浆标本推荐稀释10倍，如：稀释10倍，取100uL血清或血浆加入 900uL样品稀释液。标本使用0.1 M 的PBS稀释（PH=7.0-7.2）。 注：以上标本均应密封保存，4不应超过1个月，-80 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。 4、每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100温育1小时。 5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。 6、每孔加底物溶液90避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当 标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。 7、每孔加终止溶液50 '(。 注： 1、试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。 2、加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不 同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间（包括标准品及所有样品）最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。
基因治疗 摘要：基因治疗是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗，为现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术。基因治疗作为疾病治疗的新手段，它已有一些成功的应用，并且科学突破将继续推动基因治疗向主流医疗发展。科学家们采取了合乎逻辑的步骤，试图直接将基因植入人体细胞中，其中具体关注一些由单基因缺陷引起的疾病，如囊肿性纤维化，血友病，肌肉萎缩症和镰状细胞性贫血。 关键词：基因治疗；基因应用；治疗前景；治疗伦理 引言：基因治疗法兴起于上个世纪九十年代，基因疗法就是用健康的基因来填补和替代基因疾病中某些缺失和病变的基因，目前基因的疗法是先从患者身上取出一些细胞，然后利用对人体无害的逆转录病毒做载体，把正常的基因接到病毒上，再用这些病毒感染取出的人体细胞，让他们把正常的基因插入细胞的染色体中，使人体细胞获得正常的基因，其中也涉及到了许多技术，也有很大的发展前景。 一.基因治疗的原理 基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。 二.基因治疗的途径 基因治疗主要以两种途径达到治疗目的。其一是正常基因来纠正突变基因,也就是在原位修复缺陷基因的直接疗法，此乃理想的基因治疗策略，由于多种困难，目前尚未实现；其二是用正常基因不替代致病基因的间接疗法，此法较前者难度小，也是目前众多主张采用的策略，并已付诸临床实践。而就基因转移的受体细胞不同，基因治疗又有两种途径，即生殖细胞基因治疗和体细胞基因治疗。 (1)生殖细胞基因治疗：生殖细胞基因治疗是将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞、卵细胞中早期胚胎）使其发育成正常个体，显然，这是理想的方法。实际上，这种靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展，基因的这种转移一般只能用显微注射，然而效率不高，并且只适用排卵周期短而次数多的动物，这难适用于人类。而在人类实行基因转移到生殖细胞，并世代遗传，又涉及伦理学问题。因此，就人类而言，多不考虑生殖细胞的基因治疗途径。 (2)体细胞基因治疗：体细胞基因治疗是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗目的。这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性,对特定座位基因转移，还有很大困难,体细胞基因治疗采用将基因转移到基因组上非特定座位，即随机整合。只要该基因能有效地表达出其产物，便可达到治疗的目的。这不是修复基因结构异常而是补偿异常基因的功能缺陷，这种策略易于获得成功。基因治疗中作为受体细胞的体细胞，多采取离体的体细胞，先在体外接受导入的外源基因，在有效表达后，再输回到体内，这也就是间接基因治疗法。 三.基因治疗的一些步骤
美国FDA发布6大指南，高调护航基因疗法 过去的2017年堪称基因疗法元年，FDA先后批准了3款重磅基因治疗产品。 近日，美国FDA局长宣布，FDA将继续大力推进基因疗法的开发，并发布6大新指南，作为全面监管框架的基石，确保新产品符合FDA的安全性和有效性金标准。 厚积薄发的基因疗法 1963年美国分子生物学家、诺贝尔生理学/医学奖获得者乔舒亚·莱德伯格（Joshua Lederberg）首次提出了基因交换和基因优化的概念。经过半个多世纪的积累与沉寂，基因疗法以螺旋式的前进、遇挫甚至倒退、再前进的方式，最终走出困境，登上历史舞台，成为这个时代最耀眼的“明星”之一。 2017年，FDA先后批准了以下3款重磅基因治疗产品： 1.首款CAR-T细胞产品Kymriah（tisagenlecleucel） 获批时间：2017年8月 适用范围：治疗25岁以下复发性或难治性B-细胞急性淋巴细胞白血病患者。2018年进一步获批用于治疗患有复发或难治性大B细胞淋巴瘤（LBCL）的成年患者。 2. 第二款CAR-T细胞产品Yescarta（axicabtagene ciloleucel） 获批时间：2017年10月 适用范围：治疗至少接受过2种其他治疗方案后无缓解或复发的特定类型大B细胞淋巴瘤成人患者。 3. 首款“靶向遗传学眼疾突变”的基因疗法产品Luxturna（voretigene neparvovec-rzyl） 获批时间：2017年12月 适用范围：使用AAV（腺相关病毒技术）将健康的RPE65基因引入患者体内，让患者生成正常功能的蛋白（RPE65酶）来改善视力，不但能治疗莱伯氏先天性黑蒙症还能治疗其他由RPE65基因突变引起的眼疾，包括遗传性视网膜营养不良等。 不同于市场上绝大多数药物，基因疗法的目的在于，纠正引发疾病的致病基因。它的出现让很多原本治疗无望的重大疾病有了治愈的希望，包括癌症、血友病、遗传性视网膜病变、脊髓性肌萎缩症等。目前有超过3000个基因疗法正在进行临床试验，其中包括120多个关键的2/3期或3期临床研究。 FDA发布的6大基因疗法新指南如下： 指南一：《治疗血友病的基因疗法产品的新指南草案（draft guidance on gene therapy products that are targeted to the treatment of hemophilia）》 目前正在开发的血友病基因治疗产品作为单次治疗，可以使患者长期生成体内缺失或异常的凝血因子，减少或消除对凝血因子替代品的需要。 该指南旨在提供关于临床试验设计和临床前考虑因素的建议，以支持这些基因治疗产品的开
中华血液学杂志2013-10-15分享 血友病B是一种X染色体连锁隐性遗传病，因编码基因的改变而导致凝血因子Ⅸ（F Ⅸ）的缺乏。在男性中发病率约为1/25 000 ，依据血浆FⅨ活性（FⅨ∶C）分为重型（F Ⅸ∶C<1%）、中间型（F Ⅸ∶C 1%~5%）和轻型（F Ⅸ∶C >5% ，≤40%）。 目前该病主要治疗手段为替代治疗（输注血浆提取物或重组FⅨ制剂），但反复输注外源性FⅨ可引起FⅨ抑制物形成、血制品输注相关疾病且医疗费用昂贵。 基因治疗则为血友病的长期缓解乃至治愈带来了希望。靶组织或细胞选择范围广泛、F Ⅸ基因片段小、低水平表达即可明显改善出血、具有良好的动物模型等优势，使得血友病B 成为基因治疗领域进展最为迅速的疾病之一。 一.载体系统 1.腺相关病毒载体：腺相关病毒载体（AAV）是目前血友病B基因治疗最有前景的载体。AAV是一种可感染人细胞、具有天然复制缺陷的单链DNA 病毒，与已知人类疾病无关。AAV较之其他病毒载体具有免疫原性弱、转染效率高、可转染非分裂细胞、表达稳定且持续时间长等优点，缺点为容量小、基因表达滞后。 AAV包括AAV1、2、5、6、7、8、9 等多种血清型。AAV2 是应用最早、最广泛的血清型，可有效转染多种细胞，但人类是AAV2的天然宿主，人群中AAV2血清抗体阳性者较为常见。其他几种血清型则有不同的转染趋向性：AAV1具有明显的骨骼肌趋向性，AAV6具有心肌趋向性，AAV8具有明显的肝趋向性。针对不同的靶组织可以考虑选择趋向性不同的AAV。 总体而言，AAV7、8、9 产生的免疫反应较AAV1、2、5 轻。Wang 等分别应用AAV1、2、5、7、8、9 对FⅨ基因敲除小鼠和患血友病B犬进行基因治疗，然后对血浆中FⅨ∶C、抗FⅨ特异性IgG1 和IFN-γ进行检测，以比较其转染效率和免疫反应。 结果显示以肌肉组织作为靶组织时，AAV7、8、9 转染效率高于AAV1、2、5，未发现针对导入的FⅨ基因的B细胞反应，针对病毒衣壳蛋白的T细胞反应程度亦较弱。自身互补AAV 载体（self-complementaryAAV, scAAV）的发明则弥补了传统单链AAV 载体（singlestrandedAAV, ssAAV）表达滞后的缺点。 ssAAV表达滞后的原因在于其进入靶细胞并脱壳后，首先要合成互补DNA链才能进一步表达。scAAV则是将载体基因设计成1 个单链反向重复序列，当载体进入靶细胞后即可折叠形成1 条互补双链，从而绕开影响基因表达速度的步骤。
血友病的发病机制及检测治疗 血友病最早在欧洲王室内发现，曾被称作贵族病。现如今我国的发病人数约8~10万。这种病的发病机理到底是什么，以及我们应该如何治疗呢？ 血友病是由于遗传性凝血因子VIII（FVIII）和IX（FIX）基因缺陷，造成血浆FVIII和FIX含量不足或功能缺陷，引起的一组终生出血的凝血障碍性疾病，包括血友病A（FVIII 缺乏）和血友病B（FIX缺乏），属X性联隐性遗传性疾病。 FVIII基因定位于Xq28，全长186kb，由26个外显子和25个内含子组成。已发现约300多种基因突变，基因型与表型密切相关。点突变，小的基因缺失引起轻度FVIII缺乏。终止密码子，大的基因缺失，插入，移位，无义突变往往引起严重的FVIII缺乏和临床表型。已证实FVIII 22内含子倒位突变引起FVIII严重缺乏是45%的重型血友病A的分子发病机制。最近在1%的重型血友病A中还发现FVIII内含子1倒位突变。 控制因子Ⅷ凝血成分合成的基因位于X染色体。属于伴X染色体隐性遗传病。即，如患病男性(基因型：XbY)与正常女性(基因型：XBXB)婚配，子女中男性(基因型：XBY)均正常，女性(基因型：XBXb)为携带者；正常男性(基因型：XBY)与携带者女性(基因型；XBXb)婚配，子女中男性（基因型：XBY或XbY，其中XbY型为患者）半数为患者，女性（基因型：XBXB或XBXb，其中XBXb型为携带者）半数为携带者；患者男性（基因型：XbY）与携带者女性（基因型：XBXb）婚配，所生男孩（基因型：XBY或XbY，其中XbY型为血友病）半数有血友病，所生女孩（基因型：XBXb或XbXb，其中XbXb型为血友病,XBXb型为携带者）半数为血友病，半数为携带者。约30％无家族史，其发病可能因基因突变所致。 血友病症状 在我国，血友病的社会人群发病率为5～10/10万，婴儿发生率约1/5000。典型血友病患者常自幼年发病、自发或轻度外伤后出现凝血功能障碍，出血不能自发停止；从而在外伤、手术时常出血不止，严重者在较剧烈活动后也可自发性出血，特别是出血关节、肌肉等出血，导致严重的关节肿胀及肌肉缺血坏死，长期发作可以影响骨关节的生长发育，导致关节畸形及肌肉萎缩，以致四肢（主要为下肢）活动困难，严重者不能行走。 血友病的出血特点为： （1）出血不止：多为轻度外伤、小手术后；（2）与生俱来，伴随终身；（3）常表现为
血友病诊疗指南 概述 血友病（hemophilia）是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病。可分为血友病A （hemophilia A，HA）和血友病B（hemophilia B，HB）两种。前者为凝血因子Ⅷ（FⅧ）缺乏，后者为凝血因子Ⅸ（FⅨ）缺乏，均由相应的凝血因子基因突变引起。 病因和流行病学 编码FⅧ和FⅨ的基因均位于X染色体，女性常是携带者（46；XX），而男性是患者（46；XY），女性患者极为罕见（通常是由2个FⅧ或者FⅨ基因同时发生缺陷，或者是X染色体非随机失活所致）。在FⅧ和FⅨ基因中点突变、缺失、插入和重排/倒位均可见，点突变是最常见的基因缺陷，约在90％的患者中存在。HA中45％的重型患者为重现性的基因倒位突变；而HB患者中无重现性突变。 血友病的发病率没有种族或地区差异。在男性人群中，血友病A的发病率约为1/5000，血友病B的发病率约为1/25 000。所有血友病患者中，血友病A占80％～85％，血友病B 占15％～20％。女性血友病患者极其罕见。由于经济等各方面的原因，血友病的患病率在不同国家甚至同一国家的不同时期都存在很大的差异。我国1986—1989年期间在全国24个省的37个地区进行的调查结果显示，我国血友病的患病率为2.73/100 000人口。 临床表现 HA和HB的临床表现相似。主要表现为关节、肌肉和深部组织出血，也可表现为胃肠道、中枢神经系统等内部脏器出血等。若反复出血，不及时治疗可导致关节畸形和（或）假肿瘤形成，严重者可危及生命。外伤或手术后延迟性出血是本病的特点。根据患者凝血因子活性水平，可将血友病分成轻型、中间型和重型（表36-1）。 表36-1 血友病A和血友病B的临床分型 临床分型因子活性水平 出血症状 （IU/dl）
中央民族大学生命与环境科学学院分子生物学论文 2013年4月27日 姓名：曾宇翔 学号：1044002 专业：10生物技术 指导教师：徐小静 基因治疗技术综述
基因治疗技术综述 曾宇翔 （中央民族大学生命与环境科学学院北京 100081） 摘要：基因治疗是一种新的治疗手段，具有广阔的发展前景。基因治疗有望成为治疗遗传病，癌症，心血管病及其他难治性疾病的有效手段，目前以取得一定进展。本文主要对基因治疗技术的现状、方法、问题和未来发展等几方面进行综述。 关键词：基因治疗；策略；方法；应用。 20世纪是科技空前发展的时代，同样也是“生物大发现”的时代，而21世纪是基因治疗技术发展的时代。自1989年人类史上首次基因治疗方案在北京实施以来，到目前为止，基因治疗技术已经在世界各国广泛开展。基因治疗作为一种安全的、新的疾病治疗手段，在一定程度上取得了重大进展。然而基因治疗啊依然存在诸如缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和寄主免疫等一系列问题。但我们相信随着科学家对基因的不断深入研究，基因治疗一定会给人类健康事业做出巨大的贡献。本文从以下几方面将国内外近年基因治疗技术的研究情况做一综述。 1 基因治疗概念 基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因，以纠正或补偿治病基因锁产生的缺陷，从而达到治疗疾病的目的的生物学高新技术。基因治疗有着狭义和广义的概念，狭义概念指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的；广义概念指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。实施基因治疗的所需步骤大致有：(1)目的基因的筛选和植被；（2）基因载体的选择；（3）靶细胞的选择；（4）细胞转染：（5）基因的表达检测。 2 基因治疗的方法 目前基因治疗有二种形式：一是体内疗法，把一个将抗的基因拷贝插入靶细胞以补偿缺陷基因；二是体外疗法，引进经过改造的基因赋予细胞新的特征。这两者都属于体细胞基因治疗，还有一种生殖细胞基因治疗，通过干细胞或者生殖细胞进行介导的治疗手段，由于涉及一系列伦理学问题，目前仍属禁区。 体内疗法将外源基因导入受体体内有关的器官组织和细胞内，以达到治疗疾病的目的。这是一种简便易行的方法，体细胞基因治疗通过载体直接传送，将治疗性转基因制作出来，然后包装入载体中，直接注射到病人体内，到达靶器官。但其缺点是基因转染率较低。
FⅨ因子在血友病中的研究进展 摘要：血友病B一直以来都是危害人类的一大遗传病，临床表现为儿童期有严重出血倾向，但到青春期后自发出血减轻。本型亦多采用输血浆或浓缩血浆制剂治疗，将第Ⅸ因子活性提高到25%以上即有疗效。但是血液制品污染问题和长期使用的抗性问题，使得血液治疗不理想。产前诊断是防止本病患儿出生的有效方法。近年，我国薜京伦等在Ⅸ因子缺乏症的基因治疗方面取得了进展，有望在临床取得长期稳定疗效。本文主要简述的是我国在血友病B 的生物基因治疗方面的研究情况与发展方向。 关键词：基因治疗血友病遗传 血友病B 是一个较晚发现的血友病类型。与经典的血友病A 比, 血友病B 发病率更低(1/50000 男性)。通常来讲症状也较轻一些。它是由于缺乏凝血因子FⅨ所导致的。 F Ⅸ基因位于人类染色体Xq27.1-q27.2, 疾病为X 连锁的隐性遗传病。FⅨ因子比FⅧ因子稳定, 所以通常是用鲜血和新鲜血浆可以达到有效的治疗效果, 并且用药的次数也较少。 完整hFⅨ基因长约48 kb, 由8个外显子及7 个内含子组成, cDNA 编码区长约1.4 kb。在生理情况下, hFⅨ在肝细胞中表达并分泌到血液中, 成熟的hFⅨ蛋白由415个氨基酸残基组成, 经过一系列翻译后修饰, 尤其是其中Glu 残基的羧基化,为凝血活性所必需.FⅨ分泌
后很容易进入血液系统并发挥作用。人体FⅨ的正常水平为5 μg/mL. 通常来说, 血浆FⅨ浓度达到正常1%就可以减轻症状, 达到5%就可以基本防止日常生活中的出血现象, 而达到25%则可以完全恢复正常活动。但是第一个血友病B 病人是死于AIDS的，所以输血提供血浆FⅨ不是万全之策，同时最大问题是血液制品污染问题和长期使用的抗性问题。近年来有报道利用转基因动物和生物乳腺反应器，由于面临转基因动物和生物乳腺反应器成本与安全性问题的困惑, 用细胞表达重组hFⅨ成为一种可行的选择. 因此，基因治疗和重组蛋白制剂可能是一个有希望的解决方案。 IX 因子基因的启动区有一系列肝细胞转录因子的结合位点, 这就决定了它只能在肝细胞被激活,目前的遗传病基因治疗通常是以cDNA 或微小基因形式提供有功能的外源基因, 随机整合到人类染色体的基因组上, 达到临床治疗的目的 20 世纪90 年代开始我们已经在离体细胞中表达hFⅨ[12,14]，随后, hFⅨ在多种表达体系和细胞都得到了有效表达, 并且发现使 用人源元件和含有人工假内含子的mini 基因表达框架可以提高hFⅨ的表达,反转录病毒载体目前最为有效的载体系统, 利用反转录可高效表达。将带有内源内含子的人凝血IX 因子cDNA( hFIX 小基因) 构建到不含腺病毒基因而只带有反向末端重复顺序( ITR) 和包装信号ψ等顺式元件的微小腺病毒( mini adenovirus) 载体GT2073 上, 得到载体GTi IX。将该载体与带有lacZ 报告基因的微小腺病毒载体pRP1001 分别转移入腺病毒包装细胞293Cre4 中, 随后再转染辅助
血友病的基因治疗概述 血友病分为遗传性血友病和获得性血友病。前者是一组先天性单基因遗传性凝血因子Ⅷ(FⅧ)、IX(FIX)或者Ⅺ(FⅪ)缺乏而导致的凝血功能障碍的出血性疾病，而后者一般同时缺乏2种或者多种凝血因子，常继发于肝炎、肝硬化、肝癌转移等肝脏疾病，某些血液病(如急慢性白血病)、淋巴瘤、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和尿毒症等。我们主要就就遗传性血友病(简称血友病)的基因治疗作一综述。 1血友病的机理及传统治疗方法 血友病特点为早年发病，轻微外伤或小手术后的持续反复甚至自发出血，多有家族史并多发于男性。根据凝血因子所缺乏的种类可以分为血友病A(FⅧ缺乏)、血友病B(FIX缺乏)和血友病C(FⅪ缺乏)，血友病A约占血友病的85％，血友病C在临床上比较罕见，血友病A、B均为X染色体隐性遗传，而血友病C则为常染色体不完全隐性遗传。血友病的基础研究(包括血友病相关凝血因子的SNP、STS、STR等多态性位点)已经比较成熟，其基因突变有着高度的异质性，包括基因缺失、异常基因片段的插入、基因片段的重排和点突变等。对于小片段的缺失、插入和点突变来说，血友病的严重程度取决于该突变所在结构域的功能，但也有极少数血友病患者编码区及其旁侧序列并未发生突变。在FⅧ等凝血因子的转运过程中，许多蛋白质也参与其活性、非活性形式转换的调控，编码这些蛋白质基因的突变也会引起血友病样症状的出现。 随着发病率较高的疾病得到越来越好的诊治，以前被人们认为发病率较低的血友病，因其严重威胁着血友病患者的生活质量而越来越受到重视。目前血友病的传统疗法主要有替代疗法(对症补充血浆制剂和凝血因子浓缩制剂)、重组凝血因子疗法[3]和预防疗法等。替代疗法中患者会产生相应凝血因子的抑制物而抵消 3O％甚至更多的凝血因子活性，且存在传播病毒的危险。针对传统的浓缩或高纯凝血因子所产生的抑制物，临床上有采用猪FⅧ浓缩制剂来解决，因为猪FⅧ与抑制物的亲和力比人FⅧ要高的多；另外，绕过内源性凝血途径利用FⅧ旁路制剂(凝血酶原复合物(PCC)和激活的凝血酶原复合物(APCC))也可以促凝；目前有
血友病B综述 血友病B的遗传基础： 血友病 B 是一种 X 染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病，患者多为男性，女性患者极为罕见，男性人群的发病率约为 1/25000。因患者凝血因子 IX（factor IX， FIX）基因突变导致 FIX 水平缺乏引起。FIX 基因位于X 染色体上，全长约33.5 kb，由8 个外显子和7 个内含子组成，mRNA 全长2802 bp。血友病B的致病机制： FIX 是一类具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子，主要由肝脏产生并以无活性的酶原形式分泌入血浆，它在血浆中浓度较低（2.5 ~ 5 mg/L），半衰期仅为24 h。全长FIX 蛋白共含有461 个氨基酸，其中包括一段28 个氨基酸的信号肽和一段18 个氨基酸的前肽。FIX 基因的8 个外显子共编码蛋白的 6 个主要结构域。其中外显子1 和2 分别编码信号肽和前肽；外显子 3 编码GLA 结构域；外显子 4 和5 编码表皮生长因子样结构域；外显子 6 编码活化结构域；外显子7 和8编码催化结构域，血友病 B 主要因患者FIX 基因突变导致的FIX 蛋白活性不足而引发，其中点突变是最常见的基因突变类型。 血友病B的症状： 根据血友病 B 患者体内FIX 水平的不同，可以将患者分为 3 类：当FIX 水平低于正常水平1% 时为重型，患者会频繁发生自发性出血；当FIX 水平在1% ~ 5% 之间时为中间型，患者有自发性出血倾向；当FIX 水平在5% ~ 40% 之间时，为轻型，罕有自发性出血发生。重型患者会频繁发生自发性出血，如关节内出血、软组织血肿、腹腔出血和脑出血等，最终导致严重的关节病、慢性疼痛，严重影响患者生活质量甚至寿命。 常规治疗方式： 目前，血友病 B 的主要疗法是静脉注射FIX 生物制品，但患者需要频繁地接受注射，且FIX 制品价格昂贵。 基因治疗研究进展： 早期研究发现当FIX 蛋白338 位由精氨酸变为丙氨酸（R338A）时，FIX 的体内外凝血活性可提高 2.5 ~ 3 倍。在一个意大利家族中也发现一类FIX功能获得性突变，FIX 蛋白的338 位由精氨酸变为亮氨酸（R338L，也被称为FIX Padua），该突变导致FIX 凝血活性增加 5 ~ 10 倍。这些功能获得性突变的研究对血友病B的基因治疗和药物开发都起到重要的作用。 早在2000 年，美国费城儿童医院的研究人员就用腺相关病毒（AA V）作为载体，向重型血友病 B 患者的骨骼肌细胞导入了正常人FIX 基因。相关临床前研究中骨骼肌表达的FIX 实现了对血友病 B 小鼠和犬的表型纠正并能维持相对较长的时间，但在此次临床试验中参加研究的 3 例血友病B 患者均未显示同样的治疗效果。注射位点处可检测到FIX 的表达，但产生的FIX 总量不足以起到治疗效果。 吸取之前基因治疗研究的经验，后续的研究均将靶器官设定为FIX 的主要表达器官——肝脏，并利用AA V 病毒作为载体实现肝细胞特异性地表达人FIX。2011年，圣裘德儿童研究医院发起的临床研究，