乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
12级临本二班吕梦月许力飞
王雅琦王明华马翔张宇王帅
实验目的：乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
实验原理：
分离：加蛋白质抑制剂：竞争性或非竞争性抑制蛋白酶活性；防止蛋白酶分解；除核酸：利用核酸和蛋白质在链霉素磷酸酶中溶解度不同除去核酸；去盐：超滤液筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过度介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤液膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。等电点测定法的原理：在等电点时蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子静电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互作用之间的作用减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
提纯：醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
鉴定：乙醇脱氢酶可将乙醇分解生成乙醛
定量：S D S-P A G E即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS 复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验试剂与器材：
器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、
管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖
G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6 、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。
乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
实验步骤：
分离：1.细胞破碎：将10g肝组织用剪刀剪碎，放入研钵中,加入0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液4ml研磨成糊状，再加2ml0.067mol/LPH7.4的磷酸盐缓冲液,搅匀，然后将所得的物质过滤，取滤液。2. 添加蛋白质抑制剂：在盛有研磨液的试管中加入5ml磷酰胺素，震荡40度水浴中保温30min。3.除核酸：逐滴加入1%~2%的链霉素硫酸盐，直至沉淀不再产生。进行过滤除去沉淀。4.盐析：逐滴加入硫酸铵溶液直至蛋白质不再沉淀。进行过滤取其沉淀部分，并加入适量磷酸盐缓冲液直至蛋白形成6ml糊状物。5.去盐：将上述溶液放入超滤装置中，使蛋白质和小分子物质分离开，将大分子物质分离开并加入一定量磷酸盐缓冲液直至糊状物形成6ml。6.等电点沉淀法：在上述溶液中加入一定量0.02mol/L盐酸边加入边搅拌，一边用PH剂测量使其PH值调至5.4，然后倒置离心机中6000r/min离心15分钟，倒掉上清液，再在此溶液中加入6ml去离子水，震荡使下部的沉淀重新溶解，并以0.1mol/mL 的氢氧化钠将其PH值调至8.6.重复进行两次。
提纯：醋酸纤维膜电泳：1电泳槽与薄膜的制备（1）醋酸纤维素薄膜的湿润与选择：用钝头镊子取一片薄膜，在薄膜无光泽面上，距边2cm处用铅笔各划一条直线此线为点样标志区。小心地平放在盛有缓冲液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15s—30s内迅速湿润，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳；若薄膜湿润缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点，则表示薄膜厚薄不均匀应舍去，以免影响电泳结果，将选好的薄膜用竹夹子轻压，使其完全浸泡于缓冲液中约30min后方可用于电泳。（2）电泳槽的准备：根据电泳槽的宽度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中，各倒等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上，各放两层滤纸条，使滤纸的长边与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部浸润后，用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱赶气泡，使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。2、点样用钝头镊子取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸间以吸去多余的缓冲液，无光泽面向上平放在点样板上，点样时用点样器沾少许经分离的肝脏研磨液，再将点样器轻轻印在点样区内，样品线长度一般为1.5cm，宽度一般不超过3mm.使经分离的肝脏研磨液完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线，用同样的方法对标准乙醇脱氢酶溶液进行点样。3、电泳用钝头镊子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。如图1-2-9所示，要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，如一电泳槽同时安放几张薄膜，则薄膜之间应隔几毫米，盖上电泳槽盖使薄膜平衡10min。用导线将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注意不要接错。在室温下电泳，打开电源开关，调旋钮调到每厘米电流强度为0.3mA（8块薄膜则为4.8mA）。通电10min—15min 后，将电流调节到每厘米膜宽电流强度为0.5mA（8片共8mA），电泳时间约50min—60min。电泳后调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源或自然风干。4、染色与漂洗用钝头镊子取出电泳后的薄膜，无光泽面向上，放在含有0.5％氨基黑10B染色液的培养皿中，浸染5min。取出后用自来水冲去多余染料，然后放到盛有漂洗液的培养皿中，每隔10min换漂洗液一次，连续数次，直至背景蓝色脱尽。取出后放在滤纸上，用电吹风的冷风将薄膜吹干。
凝胶层析法：1.凝胶准备称取5g交联葡聚糖G-25,倾入锥形瓶中,加蒸馏水约60ml溶胀,搅动后静置.待凝胶沉积后,用倾注法除去浮于表面的细粒,重复3次.将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜,以达平衡.2.装柱取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支,垂直装好.加入缓冲液,打开出口,将气泡赶出,关闭出口.然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高,将
平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内,再打开出口,使液体流出,继续不断地
加入交联葡聚糖G-25悬浮液,柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止.床面上覆盖3ml缓冲液,关闭出口,在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸,使层析柱稳定5～10min后,接储液瓶,打开
出口,用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡,最后关闭出口.3..上样,洗脱打开平衡好的层析柱出口,使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口.吸混合物样品0.5ml左右,在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品,切勿搅动床面.然后打开出口,使样品进入床内,直
至床面重新露出.同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小,而样品又完全进入床内),当少量洗脱液将流入床面时,加入多量的洗脱液,但注意切勿搅动床面凝胶,连接储液瓶进行洗脱.4.分部收集根据电泳方法进行的结果可得乙醇脱氢酶为第N条带，用自动部分收集器,以5滴/min,5min/管的速度进行收集.并且观察柱上的色带,待第N
柱液体流下时,再继续收集两管透明的洗脱液作为空白,关闭出口.即可收集到提纯后的乙醇脱氢酶。再进行醋酸纤维膜电泳进行一遍看看是否纯净，若不纯净则重复进行凝胶交换柱层析法进行提纯。
鉴定：将提纯后的乙醇脱氢酶中放入一定量酒精，并加入氧化亚铜并加热，观察是否有砖红色沉淀。
定量：1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意事项：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。
2. 配胶：根据待测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶和浓缩胶浓度，按下表配制：
3. 制备凝胶板：①分离胶制备：按表配制12%分离胶。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液。混匀后用注射器抽取3.2~3.5ml凝胶液，加至长、短玻璃板间的缝隙内(立即清洗注射器及针头)。再用滴管取少许蒸馏水，沿长玻璃板壁缓慢注入约3~4mm高，以进行水封。30~60min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。②浓缩胶的制备：按表配制3%浓缩胶(待分离胶聚合后再加AP/TEMED)，混匀后用注射器加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处(立即清洗注射器及针头)。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合。
待凝胶凝固后，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将Tris-Gly电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。4.样品处理及加样蛋白质标样及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5~1mg/ml，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用(处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合)。
一般加样体积为10~15 l。如样品较稀可适量增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部(双手操作，避免伤及凝胶)，待所有样品槽内都加完样品后即可开始电泳。 5. 电泳将直流稳压电泳仪开关打开，将电流调至10~20mA (稳流)开始电泳。待蓝色染料(溴
酚蓝)迁移至距凝胶底部约1cm时关闭电源。6. 染色及脱色取出玻璃板，先用注射器取水从两侧小心冲洗使之松动，再用取胶板轻轻将短玻璃板撬开移去(必要时同时用水冲洗)，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。
将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。
7. 相对分子量计算用直尺分别量取各蛋白质条带中心以及溴酚蓝条带中心距分离胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率 = 样品迁移距离(cm) / 染料迁移距离(cm)
以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。
实验结果：
由此次实验可推理的，将乙醇脱氢酶提纯纯净，则可得其可乙醇进行脱氢生成醛，且可得此物质的相对分子质量为141000.
实验讨论：
1. 并非所有蛋白质都能用此法测定其分子量。已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的，包括电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1本身带有大量正电荷，尽管结合有正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响：其分子量是21,000，但用本法测定的结果却是35,000。因此有必要至少用两种方法来测定未知样品的分子量，以便互相验证。
2. 有许多蛋白质是由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(如 -胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，本法测定的只是其亚基或单条肽链的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，以便与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。
3.此次实验为推理实验，则不知是否纯正，所以要进行检测，而检测的方法是醋酸纤维蛋白膜进行检测即可知道含有几种蛋白质，用标准液进行对比就可知道乙醇脱氢酶的排列顺序是什么，则就知道在凝胶交换柱层析法的分离顺序，如若分离不彻底即要反复进行。就可分离出较纯正的乙醇脱氢酶。然后进行检测其活性和相对分子质量。
注意事项：
1进行研磨操作时，研钵应放在不易滑动的物体上，研杵应保持垂直。研钵中盛放固体的量不得超过其容积的1／3。洗涤研钵时，应先用水冲洗，耐酸腐蚀的研钵可用稀盐酸洗涤。研钵上附着难洗涤的物质时，可向其中放入少量食盐，研磨后再进行洗涤。2.加入链霉素磷酸盐时要适量，不要大量一次加入。 3.装柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱.4.流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的.
附：本次实验思路
乙醇脱氢酶的分离提纯鉴定与定量
原料选取：饥饿24小时后的肝脏
↓
分离：细胞破碎（捣碎）→添加蛋白质抑制剂（丝氨酸蛋白质抑制剂）→除核酸（沉淀法1％-2％的链霉素硫酸盐）→盐析（硫酸铵）→去盐（超滤）→等电点沉淀法（PI=5.4-5.8）↓
提纯：检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净看乙醇脱氢酶的带的顺序、凝胶交换柱层析法提纯、检测电泳检测是否是纯净的蛋白质若不纯净再进行提纯
↓
鉴定：加入乙醇分解鉴定
↓
定量：SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量
实验清单
实验试剂与器材：器材：剪刀、研钵、铁架台、漏斗、烧杯、玻璃棒、滤纸、试管一支、管式的超滤装置、聚酰胺膜、醋酸纤维薄膜（2×8厘米）；常压电泳仪；点样器（市售或自制）；培养皿（染色及漂洗）（直径9cm—10cm）；普通滤纸；玻璃板；钝头镊子；白瓷反应板；试管（15～20ml）；水浴；分光光度计；离心机；比色杯（光径1cm）
试剂：磷酰胺素、1%~2%的链霉素硫酸盐、硫酸铵、0.02mol/L的盐酸、PH7.4的磷酸盐
缓冲液、0.1mol/mL的氢氧化钠、去离子水、巴比妥—巴比妥钠缓冲液（pH8.6，0.07mol/L，离子强度0.06）：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，、.交联葡聚糖
G-25(细粒)、0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)、0.4% K3Fe(CN)6 、乙醇脱氢酶的标准溶液、乙醇、染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸（AR）10ml混匀溶解后置具塞试剂瓶中贮存、漂洗液：取95%乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50 ml混匀置具塞试剂瓶贮存、透明液：临用前配制。
甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。、保存液：液体石蜡、定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。
酵母蔗糖酶的提取工艺 摘要 蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。 采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。 蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述
酒精计法检测验证报告报告编号：XZ/YZ20170003 编写： 审核： 时间：
酒精计法检测验证报告 1. 目的：本方案是酒精计法检测酒精考察，证明酒精棉签的挤出液里的酒精可以用精密酒 精计进行检测。 2. 原理：用精密酒精计读取酒精体积分数示值，按GB/T10345-2007白酒分析法附录B进 行温度校正，求得在20℃时乙醇含量的体积分数，即为酒精度。 3.实验依据：《消毒技术规范》2002版2.2.1.2.11乙醇含量的测定第二法比重法 GB/T10345-2007白酒分析法6.2酒精计法 4试验条件： 4.1室温：约20℃ 4.2检测方法：在洁净、干燥的100ml量筒中加入酒精样品溶液，静置数分钟后，待溶液中气泡消失后，放入洁净、擦干的酒精计，不应触量筒壁，同时插入温度计，平衡5min，水平观测，读取液面处与酒精计刻度弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录B换算成20℃时样品的酒精度。 4.3 样品：酒精棉签，批号：20171101、20171110、20171120，规格：30支/瓶 4.4检测器具： 精密酒精计：分度值为0.1%vol ，70-80%，两支量筒：100ml ，3个 温度计：2支 4.5检测人员：陶荣玲，复检人员：舒秀珍 5方法验证精密度 5.1配制方法：取酒精棉签，批号：20171101、20171110、20171120，规格：30支/瓶 各20瓶，分别取其挤出液100ml用酒精计检测，两个人检测结果绝对差值，不应超过平均值的0.5%。 5.2数据记录及处理见下表
表1 酒精计检测数据 表2 酒精计检测数据 表3 酒精计检测数据对比
第四章酶的提取与分离纯化 1、细胞破碎的目的、方法。 ?大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。 ?机械法 ?物理法 ?化学法 ?酶促破碎法（酶解） 2 选择细胞破碎方法的依据。 ?（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。 ?（2）细胞壁的强度与结构 ?（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。 ?（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。 ?（5）提取分离的难易 3. 酶抽提的目标及方法。 提取目标： ? a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 ? b. 保持生物活性。 提取原则 ? a. 相似相溶。 ? b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。 （1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 （2）密度梯度离心特点：： ?区带内的液相介质密度小于样品物质 ?颗粒的密度。 ?适宜分离密度相近而大小不同的固相 ?物质。 （3）等密度梯度离心特点： ?介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。 ?适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。 5. 酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。 种类： ⑴中性盐沉淀（盐析法） 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象： 1) 盐溶（salting in）： 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。 2) 盐析（salting out）： 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。 ⑵有机溶剂沉淀 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。
0711 乙醇量测定法 —、气相色谱法 本法系采用气相色谱法（通则0521) 测定各种含乙醇制剂中在20℃时乙醇 (C 2H 5 OH )的含量（％) (ml /ml ) 。除另有规定外，按下列方法测定。 第一法（毛细管柱法） 色谱条件与系统适用性试验采用（6% )氰丙基苯基- (94%)二甲基聚硅氧烷 为固定液的毛细管柱；起始温度为40℃，维持2分钟，以每分钟3℃的速率升温至65℃，再以每分钟25℃的速率升温至200℃，维持10分钟；进样口温度200℃；检测器(FID )温度220℃；采用顶空分流进样，分流比为1：1；顶空瓶平衡温度为85℃，平衡时间为20分钟。理论板数按乙醇峰计算应不低于10000，乙醇峰与正丙醇峰的分离度应大于2 .0。 校正因子测定精密量取恒温至20℃的无水乙醇5ml，平行两份；置100ml 量瓶中，精密加入恒温至20的正丙醇（内标物质）5ml，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液lml ，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀（必要时可进一步稀释），作为对照品溶液。精密量取3ml，置10ml顶空进样瓶中，密封，顶空进样，每份对照品溶液进样3次，测定峰面积，计算平均校正因子，所得校正因子的相对标准偏差不得大于2.0% 。 测定法精密量取恒温至20的供试品适量（相当于乙醇约5 ml ) ，置 100ml 量瓶中，精密加入恒温至20 ℃的正丙醇5 ml，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液lml ，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀(必要时可进一步稀释），作为供试品溶液。精密量取3 ml ，置10ml顶空进样瓶中，密封，顶空进样，测定峰面积，按内标法以峰面积计算，即得。 【附注】毛细管柱建议选择大口径、厚液膜色谱柱，规格为30m×0.53mm×3.00um。 第二法（填充柱法） 色谱条件与系统适用性试验用直径为0.18~0.25mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球作为载体，柱温为120~150℃。理论板数按正丙醇峰计算应不低700，乙醇峰与正丙醇峰的分离度应大于2.0。 校正因子测定精密量取恒温至20℃的无水乙醇4ml、5ml、6 ml，分别置
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
酶的分离纯化方法介绍 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。 关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀 生物细胞产生的酶有两类： 一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到； 另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。 因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。 由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。 酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。 酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍： 一、预处理及固液分离技术 1.细胞破碎（cell disruption） 高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。
实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 一、实验目的和要求： 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理： 1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC ） 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质————电荷基团————反离子 专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 装 订 线 溶液中的离子或离子化合物
阳离子交换剂基质—+ 《==可逆交换==》+ 阴离子交换剂基质+ —《==可逆交换==》— 由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用 3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 三、实验材料与试剂：
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
蛋白质和酶的分离与 纯化
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术
蔗糖酶的分离提纯 【实验目的】 1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。 【实验原理】 蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。 蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是： H OH OH H 蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。 研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。 【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂 (1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液； CH 2OH H OH H H OH CH 20H
(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器 (1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴； (4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表 【方法】 一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨 上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。 2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 二、蔗糖酶的分离提纯 1．蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶 称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入 1.5克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。 (2)提取及粗酶的制备 往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。 量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。2．乙醇分级 将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。 (1)32％乙醇饱和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
中国药典2000版一部附录 乙醇量测定法 附录Ⅸ M. 乙醇量测定法 一、气相色谱法 本法系用气相色谱法[附录Ⅵ Ｅ3.项下，照高效液相色谱法3.(1)测定各种制剂中 在20℃时乙醇(C2H5OH)的含量（%）（ml/ml）。除另有规定外，按下列方法测定。 色谱条件与系统适用性试验用直径为0.25～0.18mm的二乙烯苯－乙基乙烯苯型高 分子多孔小球作为载体,柱温为120～150℃；另精密量取无水乙醇4ml、5ml、6ml，分别 精密加入正丙醇（作为内标物质）5ml，加水稀释成100ml，混匀（必要时可进一步稀释），照气相色谱法（附录Ⅵ Ｅ）测定，应符合下列要求： (1)用正丙醇峰计算的理论板数应大于700； (2)乙醇和正丙醇两峰的分离度应大于2； (3)上述3份溶液各注样5次，所得15个校正因子的相对标准偏差不得大于2.0％。 标准溶液的制备精密量取恒温至20℃的无水乙醇和正丙醇各5ml，加水稀释成100 ml，混匀，即得。 供试溶液的制备精密量取恒温至20℃的供试品适量（相当于乙醇约 5ml）和正丙 醇5ml，加水稀释成100ml，混匀，即得。 上述两溶液必要时可进一步稀释。 测定法取标准溶液和供试品溶液适量，分别连续注样3次,并计算出校正因子和供 试品的乙醇含量，取3次计算的平均值作为结果。 【附注】 (1) 在不含内标物质的供试品溶液的色谱图中，与内标物质峰相应的位 置处不得出现杂质峰。 (2)标准溶液和供试品溶液各连续3次注样所得各次校正因子和乙醇含量与其相应的 平均值的相对偏差，均不得大于1.5％，否则应重新测定。 (3) 选用其他载体时，系统适用性试验必须符合本法规定。 二、蒸馏法 本法系用蒸馏后测定相对密度的方法测定各种制剂中在20℃时乙醇(C2H5OH)的含量（%）（ml/ml）。按照制剂的性质不同，分为下列三法。 第一法本法系供测定多数流浸膏、酊剂及甘油制剂中的乙醇含量。根据制剂中含 乙醇量的不同，又可分为两种情况。 1.含乙醇量低于30%者 取供试品，调节温度至20℃，精密量取25ml，置150～200ml蒸馏瓶中，加水约25ml，加玻璃珠数粒或沸石等物质，连接冷凝管，直火加热，缓缓蒸馏，速度以馏出液一滴接一 滴为准。馏出液导入25ml量瓶中，俟馏出液约达23ml时，停止蒸馏。将馏出液温度调节至20℃，加20℃的水至刻度，摇匀，在20℃时按相对密度测定（附录Ⅶ A）项下的方法测定 相对密度。在乙醇相对密度表内查出乙醇的含量（%）（ml/ml）,即为供试品中的乙醇含量（%）（ml/ml）。 2.含乙醇量高于30%者 取供试品，调节温度至20℃，精密量取25ml，置150～200ml蒸馏瓶中,加水约50ml，加玻璃珠数粒，如上法蒸馏。馏出液导入50ml量瓶中，俟馏出液约达48ml时，停止蒸馏。调节馏出液温度至20℃，加20℃的水至刻度，摇匀，在20℃时照上法测定相对密度。将查得所含乙醇的含量（%）（ml/ml）与2相乘，即得。
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
酒精度代表的就是酒精百分比含量。如100ml的33度酒精度的酒就含33ml的酒精，假设这100ml的酒重93.4克（酒精密度为0.8，水密度为1），那就含30.8克酒精。… 酒精的度数 酒的度数表示酒中含乙醇的体积百分比，通常是以20℃时的体积比表示的，如50度的酒，表示在100毫升的酒中，含有乙醇50毫升(20℃)。 酒精度单位：(V/V),百分之七的意思是100体积单位的酒中含有7体积单位的乙醇。例如100升酒中含有7升的乙醇。 一般是以容量来计算，故在酒精浓度后，会加上“V ol”以示与重量计算之区分。 酒精度表示法 表示酒精含量也可以用重量比，重量比和体积比可以互相换算。 标签上酒精含量的表示法有两种： 欧式百分比法〔酒精度百分比法〕：欧洲、日本等国，是以百分比或度来表示，如威士忌一般为40%V ol或43%V ol，白兰地为40%V ol，葡萄酒为12%~12.5%V ol。美式proof 法：美国、加拿大是用proof 来表示。proof 之值等于百分比之两倍，如80proof=40%。 酒精度的测定 一、密度瓶法 1.原理 以蒸馏法去除样品中的不挥性物质，用密度瓶法测出试样（酒精水溶液）20℃时的密度，查表求得在20℃时乙醇含量的体积分数，即为酒精度。 2.仪器 2.1 全玻璃蒸馏器：500mL。 2.2 恒温水浴：控温精度±0.1℃。 2.3 附温度计密度瓶：25mL或50mL。 3.试样液的制备 用一干燥、洁净的100mL容量瓶，准确量取样品（液温20℃）100mL于500mL 蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加几颗沸石或玻璃珠，连接蛇形冷却管，以取样用的原容量瓶作接收器（外加冰浴），开启冷却水（冷却水温度宜低于15℃），缓慢加热蒸馏（沸腾后的蒸馏时间应控制在30min －40min内完成），收集馏出液，当接近刻度时，取下容量瓶，盖塞，于20℃水浴中保温30min，再补加水至刻度，混匀，备用。 4.分析步聚 将密度瓶洗净，反复烘干、称量，直至恒重（m）。 取下带温度计的瓶塞，将煮沸冷却至15℃的水注满已恒重的密度瓶中，插上带温度计的瓶塞（瓶中不得有气泡），立即浸入20.0℃±0.1℃恒温水浴中，待内容物温度达20℃，并保持20min不变后，用滤纸快速吸去溢出侧管的液体，立即盖好侧支上的小罩，取出密度瓶，用滤纸擦干瓶外壁上的水液，立即称量（m1）。将水倒出，先用无水乙醇，再用乙醚冲洗密度瓶，吹干（或于烘箱中烘干），用试样液反复冲洗密度瓶3至5次，然后装满。重复上述操作，称量（m2）。 5.结果计算 试样液（20℃）的相对密度按下式计算。
酶的分离纯化 提取原则 a. 相似相溶。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 酶的提取方法 酶的分离方法 1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。 每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。 3、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
蛋白质和酶的分离纯化及鉴定 蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。 一、质分离纯化的一般原则 1. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布：体液、组织、细胞定位 2. 破碎方法： (1) 机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2) 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如：反复冻融、渗透压、超声破碎 (3) 化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween） (4) 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 4. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等） 二、常用的蛋白质的分离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。 （一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离
酒精中甲醇含量检测方法分析 酒精中甲醇含量检测方法分析 迪庆州质量技术监督综合检测中心云南迪庆州 674400 摘要：本文对各种检测酒精中甲醇含量的方法进行了具体分析，并指出了各种方法的优势和缺点，并在此基础上提出了一种新的研究方法。经过实验，样品酒精中的成分在薄层板上经过化学反应而分离，甲醇和高锰酸钾进行氧化反应之后就会生成甲醛，并改变液体的颜色，只需要用品红亚硫酸和三色硅等色敏检测元件来进行颜色检验，这样就能够确定酒精中的甲醇含量是否符合标准。 关键词：酒精甲醇检测方法 一、概述 酒精是酒的主要成分，也是酿酒的重要原料，尤其是近年来白酒的种类不断增加，甲醇含量的多少已经成为衡量白酒质量的一个重要标准。这是因为现在很多白酒都是直接用甲醇或者串香等材料配制而成的。国家对食用酒精中的甲醇含量有明确规定，即每100毫升中的酒精含量不能超过0.06克，否则就会危害人体健康。因为甲醇本身具有一定的毒性，长期饮用不符合标准的白酒容易使甲醇在体内积累，超过一定的程度之后就会出现积蓄性中毒现象。而且甲醇经过人体的新陈代谢会生成甲酸和甲醛。甲醛能够对视网膜中的氧化磷酸化作用进行破坏，导致失明。即便甲醛的含量很少，也能够引起人体的慢性中毒。人们虽然经常饮用白酒，但是因为甲醇的味道和酒精比较相似，只凭借口感是很难进行区分的，所以有很多不法之徒为了获取暴利，直接用工业酒精勾兑甲醇制成假酒，导致人体中毒。所以对酒精中的甲醇含量进行检测是非常有必要的。 二、酒精中甲醇含量检测的主要方法 （一）顶空法 顶空法可以分成静态法和动态法两种。使用静态法进行检测，首先需要将酒精样品放入密封的容器，然后进行加热，直到样品和上方的蒸汽实现平衡为止，最后选择合适的方法提取蒸汽，用来进行气相