中央民族大学生命与环境科学学院
生物化学综合性设计实验报告
2012年12月
一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA 的方法 One a simple and convenient Methods of Genome DNA Extraction of
mouse
一种简便快捷提取小白鼠肝脏DNA的方法
吕梦春
中央民族大学生命与环境科学学院北京100081）
摘要: 主要运用了盐洗法提取小白鼠肝脏的基因组DNA, 利用分光光度计测定其OD260与OD280的吸光值,计算比率估计核酸的纯度, 并利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段在凝胶中的位置, 鉴定DNA.实验结果显示，用盐析法提取的DNA纯度较高。是一种简单高效的提取动物肝脏的方法。
关键词:小白鼠;DNA提取; 琼脂糖凝胶电泳
One a simple and convenient Methods of
Genome DNA Extraction of mouse
Meng-chun Lv
（MINZU university of china,BEIJING,100081）
Abstract：The genome DNAs of mouse were extracted with . Then the ration of OD260 andOD280 was determined by ultraviolet spectrophotometer. The purity of the nucleic acid was calculated and the position of DNA segments in the gel was observed by agar sugar gel electrophoresis Finally, the methods was showed a simple, convenient, swift and economic method to genome DNA extraction.
Keywords: mouse; genome DNAs; agar sugar gel electrophoresis;
1.前言
20世纪50年代初, DNA被证明是所有生物最主要的遗传物质. 随着生物化学、分子生物学和遗传学的发展以及基因工程等生物技术的创立,有关DNA的实验技术也得到了飞速发展. 无论是基因工程, 还是蛋白质工程, 首先都需要从生物体中提取基因组DNA( genomic DNA), 所以DNA的分离提取在分子生物学以及相关学科的研究中是一个非常重要的步骤, 分离得到DNA样品质量的好坏直接关系到下一步实验的成败. 而基因组DNA提取和纯化方法的灵敏度、特异性直接影响DNA的质量. 因此, 许多学者一直在努力探索各种基因组DNA 的提取方法. 目前, 国内外已有多种提取DNA的方法, 如水煮法、酚抽提法、甲酰胺解聚法、盐酸胍裂解法、盐析法等. 在众多方法中,虽然有人对其进行过比较, 但究竟哪一种方法更适用于普遍意义上的DNA提取, 还未见报道. 本实验采用常用的盐洗法对小白鼠肝脏基因组DNA进行提取,是一种简便、快捷、实用的基因组DNA提取方法.
1.1实验目的
学习从生物中分离DNA（盐析法）的原理和方法；
掌握测定核酸DNA的原理和方法；
掌握核酸DNA的琼脂糖电泳的原理和方法；
1.2实验原理
1.2.1关于基因组DNA
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。
本次试验中，主要利用不同浓度的NaCl 溶液, 将DNP和RNP从样品中抽提出来. 将抽提得到的核蛋白用SDS处理, DNA即与蛋白质分开. 可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去,
而DNA则溶解在溶液中. 向溶液中加入适量的乙醇, DNA即析出. 为了防止DNA酶解, 提取时加入EDTA( 乙二胺四乙酸) 抑制DNase.加入了RNA酶，分解RNA。
1.2.2关于DNA纯度测定
紫外吸收是是实验室中最常用的测定DNA或RNA的方法，核酸样品的纯度可用紫外分光光度法进行测定、读出260nm与280nm的吸光度（A）即光密度（OD）值，从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0.样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法做定量测定。对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出其含量。
通常以A值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA,或40μg/ml单链DNA（或RNA），或20μg/ml寡核苷酸计算。这个方法既快速又相当准确，而且不会浪费样品。对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分理处区带后，经溴化乙锭染色在紫外灯下粗略地估计其含量。
1.2.3关于琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚苯烯酰胺低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
我们需注意：
1）准备干净的配胶板和电泳槽
注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象
2）选择电泳方法
一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
3）正确选择凝胶浓度
对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
4）适合的电泳缓冲液
常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
5）电泳的合适电压和温度
电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA 带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
6）DNA样品的纯度和状态
注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
7）DNA的上样
正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul 即可得到清晰均匀的条带。
8）Marker的选择
DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker 应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII
或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。
9）凝胶的染色和观察
实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN 公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。
2实验材料
2.1材料：0.2g 小白鼠的新鲜肝脏
2.2仪器：移液器（10uL，20uL，50 uL,100uL, 500uL,1000uL各一支），分析天平，剪刀，台式高速离心机，玻璃棒，恒温水浴锅，动物组织匀浆机，离心管（有盖，10mL，5mL，各五支），量筒（50mL一个），三角瓶（250mL）胶头滴管，电泳仪等
2.3试剂：
1）0.14mol/L NaCl-0.15mol/ L EDTA溶液：2.045g NaCl+9.300gEDTA二钠盐，定容到250mL,调PH到8.0；
2）25% SDS溶液：6.25g十二烷基硫酸钠+25mL25%乙醇；
3）5 mol/L NaCl 溶液：7.308gNaCl定容到25mL；
4）1.5mol/ L NaCl-0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液：2.07g NaCl+0.853g柠檬酸三钠,定容到25mL；
5）0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液：0.5 mL1.5mol/ L NaCl-0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液,定容到50mL；
6）氯仿-异戊醇混合液：48mL氯仿+2mL异戊醇；
7）乙醇：70%, 80%,95%，无水乙醇各25mL；
8）0.5xTBE缓冲液：5.4gTris碱+2.75g硼酸+2 mL0.5 molEDTA-Na (0.372gEDTA 二钠盐定容到20mL),定容到1L，调PH到8.0。
3实验方法
3.1 DNA的提取
( 1) 取0.2g动物（小白鼠）的新鲜肝脏, 用0.14mol/L NaCl- 0.15mol/ L EDTA溶液洗去血液, 剪碎, 加入1mL上述溶液, 用组织匀浆机充分研磨. 将糊状物离心15min（转速10000r/min,以下离心同）, 弃去上清液, 沉淀用上述溶液洗2-3次.
( 2) 向上述沉淀中加入250 uL的0.14mol/L NaCl -0.15mol/L EDTA溶液, 然后滴加25uL 25%，SDS溶液, 边加边搅拌. 然后, 置65℃水浴保温10min( 不停搅拌) , 溶液变得粘稠并略透明, 取出冷至室温.
( 3) 加入100uL 5mol/ L NaCl 溶液, 使NaCl的最终浓度超过1mol/L, 搅拌15min, 加入等量的氯仿-异戊醇混合液, 轻缓振摇10min, 离心10min. 去掉沉淀, 向上清液中徐徐加入2-3倍95%的乙醇( 沉淀DNA) , DNA沉淀析出, 用玻璃棒慢慢搅动, 将DNA丝状物缠在玻璃棒上.
( 4) 将DNA粗制品置于225uL 0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液中, 再加入25uL1.5mol/ LNaCl- 0.15mol/ L柠檬酸三钠溶液, 搅拌均匀. 加入一倍体积氯仿-异戊醇混合液, 振摇10min, 离心10min, 倾出上清液, 加入2倍体积95%的乙醇, 离心, DNA沉淀析出.
( 5) 将上步所得沉淀溶于225ul 0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液中, 然后徐徐加入2倍体积95%的乙醇, 边加边搅拌, 取出丝状DNA, 依次用70%, 80%, 95%及无水乙醇洗涤, 将其置于250uL 0.015mol/ L NaCl-0.0015mol/ L柠檬酸三钠溶液中,溶解，备用。
3.2 DNA纯度的测量
1）分光光度计预热30min；
2）取30uL的DNA待测液置于一个比色皿（编号1）中，加入2970uL的蒸馏水，混匀，向另一个比色皿（编号2）中加入等量的蒸馏水。
3）将波长设定为260nm,用编号2的蒸馏水调节吸光度值为零，测定编号2的吸光度值A 4）重复步骤3），测定编号2在280nm处的吸光度值A’。
3.3 DNA的琼脂糖凝胶电泳
1）连线：电泳仪的连接，正极（红色）---红色，负极——黑色；
2）凝胶槽的准备：采用胶布固定凝胶槽的两端，并应该使梳子的高度调到距槽底2、3mm.
3）凝胶槽的制备：首先称取0.4g的琼脂糖，加入50mL0.5X TBE缓冲液。轻轻摇晃后加热，使之沸腾，冷却再加热至沸腾，反复3次，然后在60℃左右时倒入到凝胶槽中，在实验过程中应该注意胶面的平整性，没有气泡。最后冷却之后拔去梳子。
4）加样：首先取出封胶条，并将试管号的胶板放在电泳槽中，然后加入buffer，使其高出胶面的1-3mm，最后采用进样器进行吸取样品少于15μL并加入到样品槽中。样品的排列如下表一：
表1电泳加样示意图
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准
0 10 0 0 0 0 0 0 DNA/μL
试样
0 0 5 10 15 12 18 0 DNA/μL
上样液/
0 2 1 2 3 2 4 0
μL
5）电泳：V=100V。1-1.5h,至溴酚蓝移出2/3。
6）紫外灯下观察，拍照记录
4实验结果
本次试验中，260nm 处，A=0.031；280nm 处，A’=0.017;A/A’=1.8235,说明本次实验从小白鼠中提取的DNA纯度较高。将其电泳结果如图1-1：
图1-1 小白鼠肝脏DNA电泳图
由上图可知，DNA Marker条带整齐，密集，荧光强，且比较清晰，编号3、4无明显DNA条带。编号5、6、7的DNA条带与Marker位置一致，略欠整齐，荧光强，说明提取的DNA效率较高，但是有拖尾现象，说明DNA中存在杂质。
3. 分析与讨论
3.1实验得到的DNA较纯的原因。
1）原理方面：在实验过程中，利用了DNA在浓氯化钠（1—2mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小，在稀氯化钠（0.14 mol/L）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得的核蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA或（RNA）即与蛋白质分开，可用氯仿—异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为了防止DNA或（RNA）酶解，提取时加入EDTA（乙二胺四乙酸）。
2）材料方面：动物组织中的DNA较之于植物容易释放，只要用匀浆机研磨充分，就可以得到较多的含蛋白质的DNA。而植物由于有细胞壁，纤维素等物质，不容易获取。并且植物中大多有色素，会影响实验。
3）操作方面：操作严谨，互相监督，操作中污染少
3.2 编号3、4无DNA条带的原因
加样时没加上，或者量太少；
3.3 Marker没有完整条带的原因。
1）与Marker的比例有关；
2）电泳时间不够；
3.4 本次实验的经验教训。
1、提取方面：
1)小白鼠在称取之前要用0.14mol/L NaCl- 0.15mol/ L EDTA洗净血液，否则会影响DNA 的纯度；研磨小白鼠肝脏时一定要充分；
2)实验中用95%的乙醇沉淀DNA时，乙醇的量一定要足够，约为样液的2-3倍。用玻璃棒将DNA丝状物时一定轻轻地要沿一个方向，否则DNA的量会减少；
3)配制的药品一定各含量要精准，在含有EDTA的溶液里要调其PH，使其PH约为8.0
2、电泳方面：
1）注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。
2）正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。
3）DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker 应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。4）电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象
5）在制备电泳胶时，一定要在凝胶60℃左右时倒入凝胶槽，否则会影响实验结果。
4.结论
实验证明，盐析法提取基因组DNA步骤简洁, 耗时短, DNA提取纯化过程所需时间在4- 6h,且方法简便易行, 快速经济, 避免了常规方法中酚等因素的危害, 保证了所提DNA的完整性和纯度, 同时, 简化了实验操作步骤, 缩短了提取过程, 所需试剂少, 且不需要频繁更换Eppendorf 管, 能避免交叉污染.
致谢
衷心感谢我的老师王斌，在实验过程中细心的指导。半年来，老师带领着我们做各种生物化学的入门实验，耐心的给我们讲解每个仪器的用法，在实验出现问题时，总是领着我们自主思考解决问题的办法，以及总结这次的经验，在老师的谆谆教诲下，不仅产生了对实验极大的兴趣，而且从中我学到了许多科研思维方法以及锲而不舍的专研精神，获益良多，恩师的教诲使我受用终身，在此特向王老师致以崇高的敬意和衷心的感谢。
此外，我还要感谢为我们实验器材奔波的刘老师和研究生学长学姐们，感谢你们实验
中的陪伴和宝贵的意见；感谢我的组员们在试验中极力的配合，忘不了我们在深夜中为探讨明天的实验的热情，忘不了实验成功时我们胜利的喜悦。通过这次实验，我不仅掌握了基本的实验技术和方法，更加锻炼了与人合作的能力，所以，感谢你们我的组员，你们是最棒的！
最后，要感谢我的家人对我的鼓励和关心，你们不求回报的付出是我前进的动力！
参考文献
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生物化学设计性实验的开设与探索（作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【关键词】生物化学设计性实验开设探索 现代医学教育的本质和目的是发展学生的主体性，学生不仅是教育的对象，而且是学习和发展的主体，高等教育过程是发掘和激发学生主体性，培养具有创新精神的高素质人才的过程。实验教学是学生吸收、理解并运用理论知识, 接受科学思维和创新意识培养的平台[1-2]。生物化学是高等医学基础教育的主干课程，以往的生物化学实验教学多以综合性、验证性实验为主。在实验中学生们被动地按照已经制定好的实验步骤和方法去操作，没有可以自我发挥的机会，很容易导致学生学习积极性不高，同时也束缚了学生自由思维的空间，不利于创新精神的培养[3]。为了进一步提高我院生物化学实验课程的教学水平，生物化学与分子生物学教研室积极进行教育教学改革，为2006级临床、麻醉、法医等专业的本科生开出了12学时的设计性实验，同时对教学效果进行了反馈和评价，现总结如下。 1 教学实施方案 1.1 设计性实验内容与要求要求学生在查阅资料的基础上，按
照给定的实验条件，应用所学知识自行设计实验方案进行血浆蛋白质的分离、定量、纯化与鉴定。 1.2 设计性实验实施讲座授课教师在开课前3～4周为学生讲授设计性实验的设计方法、实施原则、选题方案和实施步骤。然后将学生进行分组(4～5人组成1个小组)，给出设计性实验的题目，要求学生在查阅相关资料的基础上,应用所学知识拟定初步的实验设计方案并于开课前2周交给授课教师。设计方案内容包括实验题目、实验目的、实验原理、仪器设备、实验方法和预期结果。 1.3 初步设计方案的审核与论证授课教师收集、整理学生初步设计的方案，然后组织学生进行讨论，每组派代表分别介绍设计方案，由学生和老师共同讨论设计方案的科学性、合理性和可行性，鼓励学生大胆使用新方法,提出新观点和新思路,充分调动学生的积极性、主动性和创造性。讨论后提出改进意见，各组同学按照修改意见重新整理和完善设计方案。 1.4 实验的实施实验室根据学生的设计方案，准备相应的仪器设备和试剂，学生根据自己的设计方案开始实验。实验过程中，主要由学生操作，教师的任务是对学生在查阅资料、方案设计等各环节给予方法上的指导，为学生讲解注意事项和操作要点。即使学生的设计中有明显的错误,只要没有安全问题,就应该允许学生进行尝试,让学生通过反复实验发现和解决问题,进而不断完善实验方案,实现预期目标。如果遇到各种原因导致实验延迟或失败，学生均可利用开放实验室的机会申请重新进行实验。
生物化学实验 实验基本原理 1 有效数字计算（结合电子天平的应用等） 加减法： 进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。如：0.124+1.2345+12.34=13.6979，应取13.70。 乘除法： 进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。如：1.23×0.12=0.1476,应取0.15。 2 误差分析 误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。误差越小，测定值越准确，即准确度越高。误差可用绝对误差和相对误差表示。 绝对误差= 测定值- 真实值 相对误差= 绝对误差÷真实值×100% 一般用相对误差表示结果的准确度，但因真实值是并不知道的，因此实际工作中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。 3 偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握） 精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。 绝对偏差= 单次测定值- 算术平均值（不计正负号） 相对偏差= 绝对偏差÷算术平均值×100%
例如：分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：16.1%，15.8%，16.3%，16.2%，15.6%，用来表示精确度的偏差可计算如下： 分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差（不计正负） 16.1% 0.1% 15.8% 0.2% 16.3% 16.0% 0.3% 16.2% 0.2% 15.6% 0.4% 平均绝对偏差=（0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%）÷5 = 0.2% 平均相对偏差= 0.2÷16.0×100% = 1.25% 在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度： 两次分析结果的差值÷平均值×100% 4 实验结果的表述：实验结果可用列表法（“影响酶作用的因素”常用）和作图法（综合实验用）表示。 第1章分光光度技术 分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术。我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法。 一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理 1、讨论的波长范围：200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区。 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm；
一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： （1）机械（匀浆）法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 （2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时
二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖
生物化学实验报告册 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入
水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3．每项内容的基本要求 实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪
实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R f 值(比移)来表示 的： …a b R f = =原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距 在一定的条件下某种物质的只R f 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、器材 1.层析缸 2.毛细管 3.喷雾器 4.培养皿 5.层析滤纸(新华一号) 四、试剂 1、扩展剂 650mL 4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL 正丁醇和5mL 冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL 置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。 2、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5％)。各5mL 3、显色剂 50～100mL 0. 1％水合茚三酮正丁醇溶液。 五、操作 1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2.取层析滤纸(长22cm 、宽14 cm)一张。在纸的—端距边缘2～3cm 处用用铅 笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm 作一记号如图。 3.点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3 mm 。 4.扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm)。待溶剂上升15—20 cm 时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色 用喷雾器均匀喷上O.1％ 茚三酮 正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算各种氨基酸的只R f 值。 思考题 1、何谓纸层析法? 2、何谓片R f 值?影响R f 值的主要因素是什么? 3、怎样制备扩展剂? 层析点 原点
实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者：张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在260nm 左右，且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比（浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比），利用此性质，可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右)，测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收，对核酸测定有一定的干扰作用，最大吸收峰在280nm处，原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度，再测280nm处的吸光度，通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅pH试纸（pH1-14）烧杯 离心机 722型分光光度计锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇 无水乙醚酸性乙醇（5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀）RNA标准蛋白溶液（200μg/ml）
1.RNA的提取 （1）称取4g干酵母粉，放入200ml锥形瓶中，加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液混匀，在沸水浴中煮沸30min中并冷却； （2）冷却后，把液体倒入离心管中，在4000r/min的条件下离心15min； （3）离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，边加边搅拌，静置5min左右，再4000r/min的条件下离心5min； （4）离心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀，每次洗后在3000r/min的条件下离心5min； （5）离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次，每次用3000r/min离心5min； （6）离心结束后，收集沉淀与滤纸上，称重备用。 2.RNA样液的配制 （1）取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中，加入5mlNaOH溶液，搅拌，溶解，调成糊状。 （2）再加入蒸馏水40ml，搅拌混匀，调PH至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。 （3）再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 （1）取洁净的试管，依次标号为1-10、A、B、C后，按照下表分别往各试管中加所需液体，并用磁力搅拌器混匀。 （2）混匀后以0号试管为参比液，在260nm下测各试管的吸光度A，并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线，并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用，使用前一定要将两离心液（包括外壳）在天平上调平，对称放置在离 心机上，防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用，要先预热10分钟，往比色皿中到液体只需到三分之二即可， 防止液体溢出腐蚀仪器，爱护仪器。
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
蛋白质与核酸的定性与定量 一.实验目的 1.学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原理 和方法。 2.掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定。 3.学会利用定糖法对核酸的定性与定量测定 二.实验原理 1.区分蛋白质和核酸：蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+紫红色反应。这是蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深。核酸由单核苷酸所组成，无此反应。另外，核酸组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，所以核酸也具有强烈的紫外吸收，最大吸收值在260mn，利用这一性质亦可鉴别核酸样品和蛋白质样品。 2.蛋白质的纯化方法： （1）粗分离：中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。 （2）蛋白质类别及分子量的确定：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定样液中含有几种蛋白质，每种蛋白质的分子量大小。由于SDS 是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原来的电荷差异。改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都相同，长轴长度随其分子量的大小
成正比变化。 （3）蛋白质的精制：根据上一步骤得到的蛋白质的分子量，采用葡聚糖凝胶层析的方法。聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。 3.蛋白质的含量测定以及等电点、比旋度等性质 （1）蛋白质的含量测定：采用Folin-酚试剂法。蛋白质中有带酚基的酪氨酸，故能与试剂乙反应而呈蓝色，蓝色深浅与蛋白质溶度相关，在一定溶度范围内呈线性关系，因此可做比色测定。 （2）等电点与比旋度。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。蛋白质的比旋度可用旋光仪。
实验一糖类的性质实验 （一）糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 （一）α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。用前配制。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 1％淀粉溶液100 mL ％糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、％糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。 观察记录各管颜色。 （二）间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架，滴管 3、试剂 塞氏试剂：％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。 1％葡萄糖溶液100 mL 1％果糖溶液100 mL 1％蔗糖溶液100 mL 4、实验操作
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
广西民族大学水污染控制工程实验报告 2013年5月24日
e dt dO )( ——微生物能内源呼吸需氧速率，min)./(L m g 。 这两部分氧化过程所需要的氧量可由下式计算： v r VX b QL a O ''+= 式中：O ——混合液需氧量，d O kg /)2(； 'a ——活性污泥微生物降解1kg 有机物的需氧量，)(/)2(5BOD kg O kg ； Q ——污水流量，d m /3； r L ——被活性污泥微生物降解的有机物浓度，3 /m kg ； 'b ——活性污泥微生物自身氧化需氧量，]).(/[)2(d MLSS kg O kg ； V ——曝气池水容积，3m ； v X ——挥发性污泥浓度（MLVSS ），3/m kg 。 式（9-2）中的系数'a 、'b 是活性污泥法处理系统的重要设计与运行参数。对生活污水，'a 为0.42~0.53，'b 为 0.188~0.11。式（9-1）中e dt dO )(=-'b ，基本上为一常量；F dt dO )(=r N a '，r N 为有机负荷，这说明F dt dO )(不仅 与微生物性能有关，还与有机负荷、有机物总量有关。 当污水中的底物主要为可生物降解的有机物时，微生物的氧吸收量累计值为一条犹如BOD 测定的耗氧过程线（下图中曲线1）。溶解氧的吸收量（即消耗量）与污水中的有机物浓度有关。实验开始时，间歇反应器中有机物浓度较高，微生物吸收氧的速率也较快，以后随着反应器中有机物浓度的减少，氧吸收速率也逐渐减慢，直至最后等于内源呼吸速率（下图中的曲线2）。如污水中无底物，微生物直接进入内源呼吸，其氧吸收（累计）过程为一通过原点的直线（曲线3）。如果污水中某一种或几种组分对微生物的生长有毒害抑制作用，那么氧的吸收将会受到毒物的限制，而低于内源呼吸量（曲线4）。如果新投入微生物于废水中，则微生物需要一个驯化过程（曲线2）。
存车处 生物化学综合实验实验报告 项目名称：核酸的分离纯化及性质研究 指导教师：商亚芳 班级：食品科学与工程类13-04班 姓名：俞海清 学号：2013218687 日期：2015/07/02-07/03 小组成员：俞海清曾斯棋
核酸的分离纯化及其性质研究 摘要：提取植物组织DNA和动物肝脏的DNA，先要破碎细胞，然后通过离心获得沉淀。分理 出脱氧核糖蛋白（DNP）。利用阴离子除垢剂（SDS），将蛋白质和DNA 分离开来，用氯仿-异戊醇去蛋白质蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，之后用乙醇将DNA沉淀出来，得到粗蛋白质。为了获得高纯度的DNA，采用适量的RNase来降解残留的RNA，再利用乙醇来 提取DNA，重复多次来获得较纯的DNA。再利用DNA紫外吸收特性测定DNA的纯度时，发现提取出来的DNA纯度比较高。利用二苯胺法测定DNA的含量，发现DNA含量偏低。DNA产率很低。最后采用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA，测定DNA片段的分子质量。结果实验成功的在紫外线下观察出了标准DNA条带以及待测样品条带。 Abstract: In order to extract the plant’s DNA and the pluck’s DNA.we should break cells,then separate the https://www.doczj.com/doc/869482878.html,e the SDS to break protein and DNA.Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture can make protein denaturation .place it on the centrifugal machine to remove the protein .Then,take let the DNA dip into ethylalcohol.it can separate the DNA . In order to obtain high purity DNA, use the right amount of RNase to degradate residual RNA, recycled ethanol to extract DNA over and over https://www.doczj.com/doc/869482878.html,ing ultraviolet absorption characteristics determine th e purity o f DNA .we found that the purity of DNA is high.Diphenylamine is used to check the content of DNA, the discovery of DNA’s content is low. DNA’s yield is very low.Finally, agarose gel electrophores is used to separate DNA and check molecular weight of DNA fragments.Under the uv light,we found standard DNA bandin g and the banding whic h belong to pending text sample successfully. 关键词：DNA 分离二苯胺乙醇琼脂糖凝胶电泳氯仿-异戊烷 Key words：DNA separate diphenylamine ethylalcohol agarose gel electrophores Phenol – chloroforM – isoaMyl alcohol Mixture 前言： 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。核酸是由许多核苷酸 聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞 微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。无论是进行核酸结构，还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。在核 酸分离提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸的 磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 实验原理： 1.植物组织中核酸的分离与纯化原理：DNA存在于细胞核中，天然状态的DNA 大多数是以脱氧核糖核蛋白的形式存在，从细胞中提取DNA时，一般先获得脱氧核糖
【实验报告第一部分（预习报告内容） ：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：】 一、预习报告 实验原理：
根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。薄层层析是在玻 璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。 薄层层析（ ，）：是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。 本次实验： ● 具体原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不 一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。 ● 吸附剂（固定相）：硅胶（.）。为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基纤维 素钠（）作黏合剂。 ● 展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:10:10）。 ● 展层-显色剂：按照10:1比例（）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。 ● 活化（）：在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。可使硅胶的活性提高， 吸附能力加强。 ● 氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原， 此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。 ● 值： 点的距离 对应溶剂前沿到样品原距离 斑点中心到样品原点的 Rf 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（值）也是恒定的，因
生物化学设计性实验 组员: 牛血清白蛋白的提取与鉴定 【实验目的】掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法【实验原理】牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分(38／100ml)，分子量68KD。应用相同浓度硫酸铵盐析法降血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的粘度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 【实验步骤】
1.盐析取小牛血清0.5毫升+PBS0.5毫升+饱和硫 酸铵2.3毫升，充分混匀，静止20分钟，2500转／分离心10分钟。 2.透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上 清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入装有自来水的小烧杯中透析，要不断搅拌，每隔2分钟换一次水，共换15次。用纳氏试剂检查带外液体的铵根离子，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 3.电泳 1）点样 取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿 中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用 干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面 距一端1.5cm处作点样线，将牛血清样品与待测 的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄 膜的点样线处不同位置点样。 2）电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽 面向下，点样端置于阴极，平衡5分钟，开电源 160伏60分钟，关闭电源后用镊子将膜条取出。
3）染色 将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染料中，染2 分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液1、 2、3中各漂洗5分钟，直至背景漂洗干净为止， 用滤纸吸干薄膜。 4.鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电 泳结果，看位置是否是一致。 【实验仪器和试剂】 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色瓷盘、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、分光光度计。 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲溶液，用0.01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9％Nacl溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液、0.4N氢氧化钠溶液。 5.预测结果 位置一致，试验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。