免疫酶技术与免疫荧光技术的对比一：免疫酶技术就是用酶(如辣根过氧化物酶)标记已知抗体(或抗原)，然后与组织标本在一定条件下反应，如果组织中含有相应抗原(或抗体)，抗原抗体相互结合形成的复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以识别出标本抗原(抗体)分布的位置和性质，通过图像分析并可达到定量的目的。二：免疫荧光技术虽已广泛应用于免疫学的研究与诊断，但是荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法，对石蜡切片标本尤为适用，为免疫病理研究开辟了一条新途径，酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察，免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。
酶联免疫检测技术的应用 真菌毒素的检测：黄曲霉毒素 B 1 、M 1 以及T-2 毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素DON )，二乙酰草镰刀菌烯醇(DAS )，玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素A ( OA )。 农药的检测：主要有除草剂与杀虫剂两大类，例如杀暝松( FN )、甲氟磷酸异已酶( SOMAN )、草不绿( Alachor)、西维因( Carbaryl )、多菌灵及克菌丹( Captan )等。 其他类的检测：盐酸克伦特罗，河豚毒素，植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素，苯并( a)芘，抗生素，激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白( Gliaclin )，酱油蛋白( Soy protein )，花生蛋白(Peanut protein )，牛乳清蛋白( Borine Whey Protein )等。 随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高ELISA方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术的发展，将和ELISA 法互相结合，从而使食品卫生分析达到DNA分子结构水平，促使食品工业的健康发展。 1 放射免疫分析(RIA) 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen,Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody,Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。 最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D 和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。 2 酶免疫法(EIA) 酶免疫法(Enzyme Immunoassay,EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。 EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent
2019第九章酶免疫技术 一、A1 1、检测HIV感染的初筛试验常用 A、对流电泳法 B、酶免疫法 C、免疫荧光法 D、免疫印迹法 E、PCR法 2、检测HBsAg最常用的方法为 A、凝集试验 B、酶联免疫吸附试验 C、荧光免疫法 D、分子生物学法 E、火箭电泳 3、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 4、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 5、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 6、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相 E、固相异相 7、在ELISA技术中，将抗原或抗体固相化的过程称为 A、封闭
B、固定 C、包被 D、吸附 E、结合 8、辣根过氧化物酶的酶活性基团为 A、糖蛋白 B、亚铁血红素 C、活跃糖基 D、醛基 E、羟基 9、下列说法错误的是 A、TMB是ELISA中应用最广泛的底物 B、一般采用四甲基联苯胺作为AP的底物 C、AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统 D、AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP低 E、β－半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-R-D半乳糖苷 10、下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的 A、可测定产物生成量 B、可测定底物消耗量 C、需最适pH D、需最适温度 E、与底物浓度无关 11、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 12、ELISA板包被后，最常用的封闭物质是 A、人白蛋白 B、人球蛋白 C、牛血清白蛋白 D、牛血清球蛋白 E、鼠白蛋白 13、选择ELISA的标记用酶，下面哪一项特性是不需要的 A、具有可与抗原、抗体结合的基团 B、标记抗原后，酶活性保持稳定 C、当酶标抗原与抗体结合后酶活性可出现激活或抑制 D、酶催化底物反应后生成的信号易于测定、重复性好
免疫学反应原理 单扩散 琼脂糖凝胶平板→打孔→点加样本→孵育(过夜) →观察沉淀线 可以定性，也可以定量应用：检测抗原抗体。如免疫球蛋白测定 双扩散 琼脂糖凝胶平板→打孔(两两对应)→点加样本及对应抗原或抗体→孵育(过夜) →观察沉淀线 一般用于定性，也可观察抗原抗体有无交叉反应。如抗原抗体的鉴定 免疫沉淀 在试管中加入抗原及抗体，混匀后孵育，观察沉淀的出现 环状沉淀：毛细管内进行。如链球菌的血清学分型 对流电泳 操作类似于双扩散。但在两侧施加电场，以加快免疫反应的速度。 适用于抗原抗体检测。如乙肝表面抗原的检测 火箭电泳 类似于单扩散，但外加了电场，孔内所加抗原向一特定方向迁移，且迁移沉淀线的长度与抗原的浓度成正比，故可以定量。如甲胎蛋白的检测。 血球凝集试验 将抗体或抗原结合在动物红血球（羊、牛、兔等）上（致敏），当致敏的红血球与相应抗原或抗体相遇时，发生肉眼可见的凝集。也可制备反向血凝或血凝抑制试验。 血球在致敏前需要进行处理（鞣化），使之不易破坏，也更容易致敏。 如乙肝表面抗原的检测：成本低廉，检测灵敏度也高。 乳胶凝集 原理同血球凝集试验，但致敏的是乳胶颗粒，且试剂更易保存。如细菌抗原的快速检测试剂。 补体结合试验 在抗原抗体反应的体系中加入新鲜制备的补体（豚鼠）以及指示系统（红细胞），当有相应的抗原抗体存在并发生反应时，激活补体，红细胞溶解。若加入与人体的被测抗体相竞争的抗体时，被测抗体消耗掉大量抗原，而无能与指示系统中的抗体反应的抗原剩余，补体不被激活，红血球不被溶解：补体结合抑制试验。 如抗链O检测 金标记试验 以胶体金致敏抗原，当遇相应抗体时，与之结合并吸附在支持介质上，浓集后形成可见的红色。一般用于快速试验，卡片式的反应体系方便易用。但敏感性和特异性不足。 也有用胶体硒的。如表面抗原、抗HIV等 免疫斑点试验 原理与金标记法类似，但标记的是酶，在抗原抗体结合后，标记在上面的酶可催化随后加入的显色系统，以出现黑色斑点为阳性。 免疫印迹 先将微生物抗原电泳分离，再通过免疫转印技术将琼脂上的抗原转染到硝酸纤维膜上并固定（可裁成小条供多个检测用）。测定时加入人血清，血中抗体与膜上的抗原结合，再加入标记的抗体或生物素系统，最后是显色。与相应特异抗原结合的位置上的显色即代表了有对应该相应抗原的抗体。特异性较高。 如：抗HIV检测 免疫比浊 原理是在一定的反应体系中，抗原抗体的反应速度与其浓度相关。测定体系中抗原抗体反应所引起的浊度变化速率即可间接测定体系中抗原或抗体的浓度。一般用于全自动的免疫分析仪。如免疫球蛋白的检测。放射免疫 一般为竞争法：以放射性元素标记抗原，与待测抗原共同竞争与同时加入的抗体的结合，待测抗原越多，与抗体结合的标记抗原越少，存留的放射性就越低。 抗原的标记：琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法 放射性元素的选择：碘125、碘131、氢3等。检测放射性：γ计数仪 酶免试验
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
第九章酶免疫技术 一、A1 1、在ELISA技术中，将抗原或抗体固相化的过程称为 A、封闭 B、固定 C、包被 D、吸附 E、结合 2、检测HIV感染的初筛试验常用 A、对流电泳法 B、酶免疫法 C、免疫荧光法 D、免疫印迹法 E、PCR法 3、检测HBsAg最常用的方法为 A、凝集试验 B、酶联免疫吸附试验 C、荧光免疫法 D、分子生物学法 E、火箭电泳 4、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 5、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 6、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm
7、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 8、酶免疫技术中酶的要求 A、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高 B、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定 C、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响 D、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好 E、以上都是 9、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相 E、固相异相 10、辣根过氧化物酶的酶活性基团为 A、糖蛋白 B、亚铁血红素 C、活跃糖基 D、醛基 E、羟基 11、下列说法错误的是 A、TMB是ELISA中应用最广泛的底物 B、一般采用四甲基联苯胺作为AP的底物 C、AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统 D、AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP低 E、β－半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-R-D半乳糖苷 12、下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的 A、可测定产物生成量 B、可测定底物消耗量 C、需最适pH D、需最适温度 E、与底物浓度无关 13、下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定 A、间接法ELISA B、反向间接法ELISA
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之
酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围
全自动酶免分析系统的技术发展与现状 王兆强（澳斯邦生物工程有限公司） 酶联免疫吸附试验（ELISA/EIA，简称“酶免试验”）是一项现代医学临床检验基本的、常规的检测技术。尽管在90年代初期，由于以聚合酶链反应（PCR）技术为代表分子生物学水平技术的发明，人们纷纷预测，酶免试验将被更高灵敏度、数百万级信号放大的、病原体水平检测的核酸放大试验（NAT）所取代。但由于免疫临床标志物（抗原/抗体）具有无法替代的临床意义、以及酶免试验具有操作简便、技术可靠，特别是，90年代末期ELISA 检测系统的灵敏度和特异性以及检测过程的自动化得到了显著提高与完善，因此，酶免试验再也没人怀疑将被淘汰，而成为传染病血清学标志物（如肝炎、艾滋、致畸病原Torch）、肿瘤标志物及内分泌等各种临床免疫指标检测的主导技术。 支持酶免试验技术的进步，酶标板检测仪器朝着二个方向快速发展。一方面，侧重酶免试验的光学检测系统——酶标仪，到90年代末已达到至臻完美状态；随着纳米技术微量加样的发展，酶标仪将很容易由检测传统的96微孔板，转化为检测384微孔板，甚至1536微孔板，达到更高的检测效率。另一方面，侧重酶免试验处理过程技术——酶标分析系统，到90年代末已充分发展；随着多任务软件，如O/S2，Unix及Windows NT等操作平台的完善，满足现代实验室GMP/GLP要求的全自动酶标分析系统，正在世界各种实验室普及。应当指出，在发达国家全自动酶标分析系统的进步，是由法规要求严格、酶免试验结果至关重要的血站实验室需求推动的。这是因为，不同于临床病人检测结果，仅是医生诊断的参考数据，血站血液筛查实验室的检验结果判定，将直接决定血液的安全性。 以日本为代表的“全面实验室自动化”（TLA）运动，对于全自动酶免分析系统产生了巨大的需求。在90年代初期，手工酶免试验操作曾经成为TLA的主要障碍。目前，由于全面实验室自动化具有标准化、高效率、高质量的自动化与网络化特征，正成为临床实验室发展的新趋势。 酶免试验自动化与网络化的时代已经到来，全面实验室自动化不再是一种模型。了解这些技术进步将有助于高效临床实验室的建设与发展。
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
免疫分析技术研究进展 摘要：目的：综述免疫分析技术的最新研究进展。方法：通过查阅国内外有关免疫分析技术的研究论文，对放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等免疫分析技术进行了综述，同时指出了发展前景和尚待解决的问题。结果：多种免疫分析方法相互结合，可大大提高分析方法的灵敏度，增大检测范围；CLIA和TRFIA是非放射免疫分析的两大主流，其中，CLIA更具有竞争力。结论：目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺的，各种技术还需要不断发展和完善，以开发出更新、更理想的免疫分析技术。 关键词：药物分析学；免疫分析；放射免疫分析；酶免疫分析；荧光免疫分析；化学发光免疫分析 免疫分析法(immunoassay ，IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、荧光标记、化学发光、酶标记等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。免疫分析法起始于本世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，开创了放射免疫分析方法的先河。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术[1]，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。 1 免疫分析方法分类 (1)根据标记物的不同，可以免疫分析主要分为放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶免疫分析(enzyme immuoassay，EIA)、化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)等。 (2)按反应机制的不同，可以分为竞争法和非竞争法。非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体复合物，产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将过量的待测抗原与定量标记抗原竞争结合形成定量的特异性抗体，待测抗原的量越大，与抗体结合的标记抗原量越少，产生的信号强度越小，由此定量待测抗原的量。 (3)还可以按测定过程中的某些步骤的差异分为均相免疫分析和非均相免疫分析两大类。均相酶免疫测定法的特点是抗原-抗体反应达到平衡，对结合与游
酶免疫技术 （一）单项选择题（A型题） 1、HRP的活性基团是 A．糖蛋白B．亚铁血红素C．白蛋白 D．球蛋白E．色氨酸 2、表示HRP纯度（RZ）的是 A．入403nm/入275nm B．入420nm/入275nm C．入403nm/入290nm D．入275nm/入403nm E．入290nm/入275nm 3、HRP（用于标记）的RZ值应大于 A．3.0 B．3.1 C．3.2 D．3.3 E．3.4 4、β-Gal的常用底物是 A．OPD B．TMB C．5-ASA D．ABTS E．4MUG 5、下列酶-底物-颜色反应组合中，正确的是 A．HRP—OPD—蓝色B．HRP—TMB—红 色C．AP—P—NPP—黄色 D．HRP—P—NPP—蓝 色 E．AP—TMB—蓝色 6、AMIT测定可以测定 A．大分子抗原B．小分子抗原或半抗 原 C．补体 D．PcAb E．McAb 7、应用最广泛的均相EIA是 A．CEDIA B．SPEIA C．AMIT D．ELISA E．IFA 8、关于酶免疫技术的特噗，正确的是 A．酶标记物催化抗原反应，使其结果放大，提高了检测的灵敏度 B．酶活性易受理化因素的影响，酶标记物稳定性差 C．底物以酶催化后的成色，使酶标主免疫反应结果得以放大 D．选择高度质量的标记用酶是建立酶免疫技术最重要的前提 E．酶免疫技术检测方法较为繁琐 9、关于固相化抗体的制备，正确是的 A．抗体包被固相载体后，再用小牛血清蛋白包被一次为了稳寄存载体对抗体的吸附
B．化学偶联包被抗体，可有效提高包被抗体的结合量．均一性和牢固程度 C．为提高抗体的包被量，包被液的浓度应较高 D．吸附法包被抗体时，选用偏酸性的缓冲液，可提高包被抗体的稳定性 E．包被抗体时，温度越高越有利于提高包被抗体的稳定性 10、关于载体的选择，正确的是 A．醋酸纤维膜吸附蛋白的能力强于塑料板，但对微量样品的吸附不完全 B．高分子微颗粒载体含有的基团易与抗体蛋白形成化学偶联，且结合容量大 C．塑料制品吸附蛋白分子的稳定性和均一性好 D．固相微颗粒因体积小，不易与磁性材料组合使用 E．膜载体吸附抗体蛋白一般是采用化学偶联法 11、酶免疫技术和于样品中抗原或抗体的定量测定是基于 A．酶标记物参与免疫反应 B．固相化技术的应用，使结合和游离的酶标记物能有效地分离 C．含酶标记的的免疫复合物中酶可催化底物成色，其颜色的深玫与待测物含量相关D．酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测定值呈正比 E．酶催化免疫反应，复合物中酶的活性与样品测定值呈反比 12、关于HRP，描述正确的是 A．HRP由具酶活性的蛋白主酶和亚铁血经素辅基构成 B．测定HRP的RZ值，可判断酶活性的高低 C．HRP对酶催化反尖中的受氢体专一性要求不高 D．酶变性后，其RZ值不变 E．邻苯二氨底物液被HRP催化显蓝色，其最大吸收波长为492nm 13、均相酶免疫测定的基本特征是 A．以应平衡后，抗原抗体复合物中酶活性人发生变化 B．酶标抗原与抗体在固相介质表面形成复合物后，作用于底物成分 C．不用分离B．F即可确定待测物质的含量，表明其反应不易受内源性酶的干扰D．反应属于非竞争结合，测定的灵敏度较高 E．测定方法较为复杂，且不易用于自动化检测 14、司于均相酶免疫测定的方法是 A．酶联免疫化学光测定B．dot-ELISA C．双抗体夹心法 ELISA D．酶增强免疫测定技 术 E．竞争法ELISA 15、反应结束时，阴性以照管的呈色最强，此情况常见于
酶免疫技术的特点方法原理 免疫酶技术是指在一定的生物反应器内,利用酶的催化作用,进行物质转化的技术.其应用范围已遍及工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面。下面是给大家的酶免疫技术的特点，希望能帮到大家! (1)酶和酶作用的底物： ①辣根过氧化酶(HRP)：是一种糖蛋白，含糖量约18%;分子量为44kD;是一种复合酶，由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰;辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。在反应中H2O2是受氢体底物，DH2无色的供氢体底物，在HRP的催化下脱氢而显色，此即HRP作为示踪物的原理。 ②碱性磷酸酶(AP)：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的最适pH为8.0;用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9.6。 ③其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。 (2)酶标记的抗体或抗原： 称为结合物。制备方法通常有戊二醛交联法(包括有一步法和二步法)和过碘酸盐氧化法。标记抗体的最佳用量：通常采用棋盘滴定法进行滴定。 (3)固相载体： 主要试剂：固相的抗原或抗体、医学`教育网搜集酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。可作固相载体物质最常用
的是聚苯乙烯。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。聚苯乙烯作为ELISA固相载体，载体还包括微孔滤膜和含铁磁性微粒。聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。 (4)免疫吸附剂： 固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过 程称为包被。如在包被后再用1%～5%牛血清白蛋白包被一次，可以 消除这种干扰。这一过程称为封闭。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。 ACA(抗心磷脂抗体)主要通过抑制血管内皮细胞合成PGI2，干 扰血栓调节素、纤溶酶原激活剂和蛋白质C系统的活性，抑制抗凝血酶III的活化等而致凝血前高凝状态，与复发性动静脉血栓形成、反复自然流产及血小板减少症关系密切。 其主要程序为用纯心磷脂的无水乙醇溶液包被聚苯乙烯板，封 闭后分别于标本孔和对照孔中加入一定稀释度的被检血清及阳性与 阴性对照血清，之后加入酶标二抗和酶底物，终止反应后肉眼观察结果或测吸光度(A)值。 具体步骤如下： 预步骤：先用一定浓度的心磷脂溶液包被聚苯乙烯板的小孔，4℃冰箱过夜，次日取出甩尽液体备用。 (1)用微量移液器分别加待检血清、阳性对照、阴性对照各100μl于1、2、3孔中，370C水浴箱温育30min。
2016 第九章酶免疫技术 一、A1 1、HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈 A、蓝色 B、橙黄色 C、棕黄色 D、黄色 E、紫色 2、HRP与底物OPD反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 3、HRP与底物TMB反应后的测定波长为 A、278nm B、450nm C、403nm D、495nm E、492nm 4、用于标记的HRP的RZ值应大于 A、2.4 B、3.0 C、1.5 D、3.5 E、5.0 5、酶免疫技术中酶的要求 A、酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高 B、易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定 C、作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响 D、酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好 E、以上都是 6、酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为下述哪几种类型 A、均相异相 B、同相均相 C、异相固相 D、固相均相
E、固相异相 7、辣根过氧化物酶的酶活性基团为 A、糖蛋白 B、亚铁血红素 C、活跃糖基 D、醛基 E、羟基 8、下列说法错误的是 A、TMB是ELISA中应用最广泛的底物。 B、一般采用四甲基联苯胺作为AP的底物 C、AP系统的敏感性一般高于应用HRP系统 D、AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率也较HRP 低 E、β－半乳糖苷酸的底物常用4-甲基酮基-β-D半乳糖苷 9、下列对血清中酶活力的测定的描述哪一项是错误的 A、可测定产物生成量 B、可测定底物消耗量 C、需最适pH D、需最适温度 E、与底物浓度无关 10、酶联免疫吸附试验（ELISA）中应用最多的底物是 A、邻苯二胺（OPD） B、四甲基联苯胺（TMB） C、ABTS D、对硝基苯磷酸酯（P-NPP） E、以上都不是 11、下述哪一种酶联免疫吸附实验方法最常用于抗原测定? A、间接法ELISA B、反向间接法ELISA C、竞争法ELISA D、双抗体夹心法ELISA E、捕获法 12、下列哪项不是血药浓度免疫学测定的技术 A、化学发光免疫测定 B、免疫电泳法 C、放射免疫法 D、荧光免疫法 E、酶免疫法
第九章酶免疫技术 第一节酶免疫技术的特点 它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。 一、酶和酶作用底物 （一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合： 1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。 2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。 3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。 4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。 5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。 （二）常用的酶 1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。 RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。 酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。 2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。 3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。 （三）常用的底物 1.HRP的底物 （1）邻苯二胺（OPD）：是HRP最为敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。OPD应用液稳定性差，易变色，需新配制后在1小时内使用，显色反应过程需避光，而且具有致癌性。 （2）四甲基联苯胺（TMB）：TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长450nm。TMB稳定性好，成色无需避光，无致突变作用，是目前ELISA中应用最广泛的底物。缺点是水溶性差。 （3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）。 2.AP的底物 常用对-硝基苯磷酸酯（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。 3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物 常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。 二、酶标记抗体或抗原 （一）酶标记抗体或抗原的制备 标记方法应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶
本文由：华夏学术传媒网提供https://www.doczj.com/doc/875574925.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强
附件1 酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则 一、前言 本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。 本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。 三、基本要求 （一）基本原则 1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂
生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： （1）外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。 （2）纯度和分子量