课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
题型一选择培养基的作用及配制方法
1．从混杂的微生物群体中选择优良的单一纯种的方法不包括( )
A．根据微生物对碳源需求的差别，使用含不同碳源的培养基
B．根据微生物对特殊营养物质的需求，在培养基中增减不同的特殊营养物质
C．根据微生物对抗生素敏感性的差异，在培养基中加入不同的抗生素
D．根据微生物耐热性的不同，利用高温、高压消灭不需要的杂菌
答案 D
解析利用高温、高压消灭不需要的杂菌的同时也会将需要筛选的微生物杀死，因此不能通过该方法得到目的微生物，D错误。
2．某混合样品中微生物R含量极少，要得到大量的R，比较理想的方法是采用( ) A．天然培养基
B．稀释涂布平板法
C．利用适合R生长但同时抑制或阻止其他种类微生物生长的选择培养基
D．用显微镜直接观察、寻找，再培养
答案 C
解析在培养过程中可以通过选择该微生物能生长繁殖而抑制其他微生物生长繁殖的培养基，使微生物R能在该培养基上成为优势菌种而大量繁殖，C正确。
3．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
答案 A
解析分解尿素的细菌与其他细菌的重要区别是分解尿素的细菌能以尿素为氮源，该细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，我们可以准确地鉴定出该种细菌能够分解尿素。
题型二菌落数目的统计方法
4．下列不属于菌种计数方法的是( )
A．平板划线法B．稀释涂布平板法
C．镜检法D．滤膜法
解析平板划线法可用于菌种的纯化和分离，不能用于计数，A错误；稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌数目，镜检法也是测定微生物数量的常用方法，B、C正确；滤膜法常用于检测水样中大肠杆菌数目，通常是将已知体积的水样过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌数量，D正确。
5．下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( )
A．采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数在30～300间且差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
答案 C
解析当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，A正确；当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，B正确；一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，密度过大会不好计数，影响结果的准确性，C错误；涂布三个平板，作为重复组，若三个平板统计的菌落数在30～300间且相差不大，取其平均值作为统计结果能增强实验的说服力与准确性，D正确。
题型三细菌分离与计数的实验设计
6．下列关于测定土壤中微生物的数量，正确的叙述是( )
A．一般选用103～107倍的稀释液分别涂布
B．测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释
C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释
D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养答案 B
解析由于土壤中各类微生物的数量不同，在进行分离与计数时，就需要按照不同的稀释度分别进行涂布，A错误；测定放线菌的数量，一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板培养，B正确；测定真菌的数量，一般选用102、103、104倍稀释，C错误；当第一次测量某种细菌的数量，可将稀释的范围放宽点，将103～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养，D错误。
7．在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除含尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作、培养与观察，则乙组实验属于( )
A．空白对照B．自身对照
C．相互对照D．条件对照
解析本实验甲组为实验组，乙组为对照组，给实验组某种处理，给对照组另一条件的处理，为条件对照。
8．关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中，下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的一组是( )
①土壤取样②称取土壤③稀释土壤溶液④涂布平板⑤微生物的培养
A．①②③④⑤B．②③④⑤
C．③④⑤D．②③④
答案 D
解析土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验需进行无菌操作，其中①土壤取样是在室外进行，⑤微生物的培养是在恒温箱中进行，其余过程都需要在酒精灯火焰旁进行，D正确。
9．在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”课题中，以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是( )
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②从土壤中分离出能够分解氨的细菌③统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌④统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌
A．①③B．②④C．①②D．③④
答案 A
解析从土壤中分离分解尿素的细菌并对其计数，统计的是每克土壤样品中含多少分解尿素的细菌，用公式“每克样品中菌株数＝(C/V)×M”进行推测，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数，①③正确。
10．下列属于菌落特征的是( )
①菌落的形状②菌落的大小③菌落的多少
④隆起程度⑤颜色⑥有无荚膜
A．①②③④B．①②④⑤
C．②③④⑥D．①②③④⑤⑥
答案 B
解析菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等，有无荚膜是单个细菌细胞的特征，不是菌落的特征。
11．在做“分离能分解尿素的细菌”的实验时，A同学从对应稀释倍数为106倍的培养基中筛选出大约150个菌落，而其他同学在同样的稀释倍数下的培养基中只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有( )
①土样不同②培养基被污染③操作失误④没有设置对照
A．①②③B．②③④C．①③④D．①②④
答案 A
解析A同学比其他同学所得的实验结果的数据大许多，可能是由于选取的土样不同、培养基灭菌不彻底或操作过程中培养基被污染，也可能是操作失误造成的，如所配制的培养基中混入其他含氮物质、稀释度不够准确等。
12．欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是( )
A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C．可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照
D．用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌
答案 D
解析将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，以便于统计样品中活菌的数目，A正确；为避免偶然误差对实验结果的影响，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，B正确；生物实验要遵循对照原则，故要将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，排除非测试因素对实验结果的影响，可使结论更有说服力，C正确；在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂可筛选出分解尿素的细菌，D错误。
13．图表所示配方的培养基可筛选某种细菌，该细菌可以在该培养基上生长、形成菌落。请回答下列问题：
(1)。
(2)如果从土壤中获取的样本含该细菌的数量较少，则需要对样本中的细菌进行扩大培养，____________(填“能”或“不能”)用表格中的培养基，因为____________________________________________________。
(3)如果对该细菌进行计数，则将得到的细菌用____________法接种，为了确定该细菌确实属于所要分离的细菌，需要在培养基中加入____________(试剂)。
(4)另一种接种细菌的方法是____________，该方法操作时，每一次划线前都要进行灼烧，目的是__________________________。
答案(1)尿素分解菌培养基中尿素是唯一的氮源
(2)不能扩大培养应该用液体培养基，表格配方中含琼脂，是固体培养基(3)稀释涂布平板酚红指示剂
(4)平板划线法杀死残留在接种环上的细菌
解析(1)根据表格分析，培养基中尿素是唯一的氮源，说明该培养基筛选的细菌是尿素分解菌。
(2)图表所示培养基中含有琼脂，说明是固体培养基，不能用于菌种的扩大培养，扩大培养应该用液体培养基。
(3)微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中后者可以用于菌种的计数；以尿素为唯一氮源且含酚红指示剂的培养基可以选择和鉴别尿素分解菌。
(4)利用平板划线法接种时，每一次划线前都要进行灼烧，目的是杀死残留在接种环上的细菌。
14．下图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程。
(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是______________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较________。
(3)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是________，需要消毒的是________。(填序号)
①培养细菌用的培养基与培养皿
②玻棒、试管、锥形瓶和吸管
③实验操作者的双手
(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。
答案(1)尿素酚红红(2)稀释涂布平板法 1.75 少(3)①②③(4)灭菌解析(1)脲酶能够催化尿素分解为氨，故图中选择培养基应以尿素为唯一氮源，鉴别培养基还需添加酚红作指示剂。由于尿素被脲酶分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH 升高，从而使酚红指示剂变红。
(2)用于统计细菌菌落数的常用方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300
之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数。每克该土壤样品中的菌落数对应的应该是每毫升菌液中的细菌数目，所以每克该土壤样品中的菌落数为(156＋178＋191)÷3÷0.1×105＝1.75×108(个)。由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，此外，稀释涂布平板法统计的是活菌数，而血细胞计数板统计的是细菌总数，所以用此计数方法测得的细菌数较少。
(3)在实验中，①培养细菌用的培养基与培养皿和②玻棒、试管、锥形瓶、吸管需要灭菌，③实验操作者的双手需要消毒。
(4)为了防止污染环境，实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉。
1．对表层土壤中自生固氮菌的分离采取的原理(方法)是( )
A．依据自生固氮菌的生长繁殖不需要氮源
B．依据不同微生物生长繁殖所需pH不同
C．依据不同微生物生长繁殖所需温度条件不同
D．依据不同微生物代谢类型不同
答案 A
解析在无氮培养基上只有固氮菌能正常生长繁殖，可根据此特点来分离自生固氮菌，A正确。
2. 在光亮处用同一种培养液分别培养单细胞绿藻和单细胞酵母菌，其结果如图所示(甲为绿藻，乙为酵母菌)。造成这种现象的原因是( )
A．培养液中缺少无机盐
B．培养液中氧气含量太高
C．培养液中有机成分少
D．培养液中不含二氧化碳
答案 C
解析酵母菌为异养型生物，需直接摄取有机物，而绿藻是植物，可以进行光合作用合成有机物，所以在培养液中酵母菌最终被淘汰说明培养液中有机成分少，C正确。
3．如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，有关叙述错误的是( )
A．在配制步骤②、③所用的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌
B．步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落
C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
答案 C
解析在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH值后再高压蒸汽灭菌，A正确；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落，B正确；要筛选出能高效分解尿素细菌，所用的培养基要以尿素为唯一氮源，但牛肉膏和蛋白胨中都含有含氮有机物，因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏和蛋白胨，C错误；步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。
4．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
答案 D
解析在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误；C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。
5．为了判断培养基是否被杂菌污染和选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照组的培养基分别是( )
A．未接种的选择培养基，未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
B．未接种的培养基，接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的选择培养基，接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的培养基，未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
答案 B
解析若要判断培养基是否被杂菌污染，可将未接种的培养基放在恒温箱中培养，一段时间后若有菌落产生，说明培养基被污染，若无菌落产生，说明培养基没有被污染。要判断
选择培养基是否起到了选择作用，接种了的选择培养基是实验组，将等量的稀释相同倍数的菌液接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，作为对照组，在相同的条件下进行培养，观察比较对照组和实验组中的菌落数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，综上所述，B正确，A、C、D错误。
6．下列有关微生物分离、培养和计数的叙述，正确的是( )
A．分离土壤中微生物时，需要先对土壤灭菌，再进行培养
B．测定土壤中细菌数量时，一般选用103～107倍的稀释液
C．测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法或平板划线法进行计数
D．统计菌落数目时，当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
答案 D
解析分离土壤中微生物时，需要对培养基灭菌，但不能对土壤样品进行灭菌，A错误；由于土壤中各类微生物的数量不同，在进行分离和计数时，就需要按照不同的稀释度分别进行涂布，测定土壤中细菌的数量一般选择104、105、106倍的稀释液，B错误；测定土壤样品中的细菌数目常用稀释涂布平板法，平板划线法不能用于计数，C错误；统计菌落数目时，当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，D正确。
7．下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是( )
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
答案 C
解析3号试管中的菌落稀释倍数为104倍，A错误；4号试管中稀释液进行平板培养，稀释倍数比5号试管的低10倍，如果稀释倍数适当，得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍，B错误；5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3÷0.1×106＝1.7×109个，C正确；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细菌细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要低，D 错误。
8．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
答案 D
解析用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基时，需要先灭菌再倒平板，A正确；测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板培养，体积为0.1 mL，为了保证实验的准确性，需进行对照，同时保证无关变量相同且适宜，因此需取等体积的无菌水，分别涂布于各组平板上，B正确；实验组和对照组需要在37 ℃恒温箱培养一段时间，再观察计数，C正确；对照组无菌说明培养基灭菌成功且操作过程中没有杂菌污染，那么在菌落计数时应选择菌落数在30～300间的实验组平板进行计数，D错误。
9．人和哺乳动物的尿液中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染。土壤中有些细菌含有脲酶，可降解尿素。下图是某同学从土壤中筛选出降解尿素菌株的实验流程。请回答有关问题：
配制土壤溶液―→系列稀释―→涂布平板与培养―→菌落计数
(1)用以________为唯一氮源的培养基筛选能分泌脲酶的细菌。从功能上讲，该培养基属于________培养基。分离培养细菌时必须进行________操作。
(2)采用________________法时需要将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养、菌落计数。在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在__________________旁进行操作。稀释处理的目的是________________________________________，接种后的培养皿倒置于适宜温度的恒温箱中培养，平板倒置培养的目的主要是____________________________。
(3)在培养基中加入酚红指示剂，若培养基中存在分泌脲酶的细菌，其菌落周围会出现________，这是由于尿素被分解产生________，遇培养基中所加酚红指示剂产生的颜色变化所致。变色区域越大，表明该菌株降解尿素的能力________。
(4)分离细菌时使用固体平面培养基的原因是_________________________。
答案(1)尿素选择无菌(2)稀释涂布平板酒精灯火焰得到单菌落，避免土壤溶液中菌体浓度过高防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染
(3)红色环带氨(或NH3) 越强(4)固体培养基上细菌分裂产生的子代个体不易分散，从而形成菌落
解析(1)欲筛选出能降解尿素的菌株，培养基中应以尿素为唯一氮源，不能降解尿素的细菌在此培养基上不能生存，这类培养基属于选择培养基。分离培养细菌时必须进行无菌操作。
(2)常用稀释涂布平板法接种培养、菌落计数，稀释菌液的过程中每一步都要在酒精灯火焰旁进行，以避免周围微生物的污染。为了得到单菌落，需将土壤溶液进行一系列的梯度稀释，从而使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，进而能在培养基表面形成单个菌落，便
于纯化分离菌种。平板倒置培养的目的主要是防止培养过程中皿盖上的冷凝水滴落在培养基表面，造成杂菌污染。
(3)细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，遇酚红指示剂变红。降解尿素能力越强的菌株，菌落周围形成的红色环带越大。
(4)液体培养基中难以得到成形的菌落，而固体培养基上可以形成肉眼可见的菌落。
10．在农业生产中发现一种广泛使用的除草剂(含氮有机化合物)在土壤中不易降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行________处理。
(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从物理性质、用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是______________________________________。
(3)在划线培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是____________________________或有氧条件抑制了这些细菌的生长。
(4)在固体培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是________，有透明带菌落利用的氮源主要是________，据此可筛选出目的菌。
(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如下表所示：
突变株A和B 混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是__________
_____________________________________________________________________。
答案(1)稀释
(2)以该除草剂为唯一氮源的固体培养基
(3)培养基中缺少这些细菌可利用的氮源
(4)氮气该除草剂
(5)突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供
解析(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。
(2)从物理性质来看，题图上培养皿中培养基属于固体培养基；从用途方面来看，该培
养基是以该含氮除草剂为唯一氮源的选择培养基。
(3)在以该除草剂为唯一氮源的培养基上，不能降解该除草剂的细菌(除具有固氮能力的细菌外)是不能生长的。
(4)含一定量该除草剂的培养基不透明，被菌落分解后可产生透明带，无透明带说明除草剂未被分解，菌落利用的氮源是空气中的氮气，而菌落周围形成透明带是由于该除草剂被某些细菌降解导致的。
(5)突变株A的生长依赖于营养物质甲，突变株B的生长依赖于营养物质乙。突变株A 由于缺乏合成营养物质甲所需要的酶，所以不能在一般培养基上生长，不添加营养物质甲和乙，二者混合培养时都能生长，最可能的原因是突变株A为突变株B提供了营养物质乙，突变株B为突变株A提供了营养物质甲。
11．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量测定。下面是对某水样中大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
步骤：①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液；
②用稀释涂布平板法接种样品；
③在适宜温度下培养。
结果分析：
(1)一位同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为43.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)____________。
(2)用这种方法测定微生物数量时，实际的活菌数往往要比统计的菌落数________，因为______________________________。
(3)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，________(填“能”或“不能”)肯定大肠杆菌的品系被污染了。原因是________________________________。
答案(1)2.17×108
(2)多当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(3)不能不能确定杂菌的来源
解析(1)每毫升样品中的菌株数为43.4÷0.2×106＝2.17×108。
(2)因为肉眼可见的菌落可能由两个或多个细胞连在一起生长而成，所以实际的活菌数往往要比统计的菌落数多。
(3)杂菌的出现可能是由于培养基灭菌不彻底或在培养过程中感染了杂菌。
高二生物土壤中分解尿素的细菌的分离与 计数知识点梳理 1.培养基一般都含有、、、四类营养物质，另外还需要满足微生物生长对、以及的要求。 2.培养基的分类：按照物理性质可以分为、、;按照化学性质分为和;按照用途分为和。 3.尿素可以为农作物提供肥，但是只有被分解成之后，才能被植物吸收利用。 4.以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到的两个主要目的是： ⑴; ⑵。 (一)筛选菌株 1.原理: 人为提供有利于生长的条件(包括等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 2.方法：选择培养基 (1)定义：在微生物学中，将允许的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 (2)配制的的依据：
①在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，加入可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。 ②培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物 的目的。如培养基中缺乏源时，可以分离固氮微生物。 ③当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。 ④改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在环境中培养只能得到耐高温的微生物。 (二)统计菌落数目 (1)测定微生物数量的常用方法有和。 (2)稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置个平板，选择菌落数在的平板进行计数，并取。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 (三)实验设计 实验设计包括，所需、、用具和药品，具体的以及时间安排等的综合考虑和安排。
试卷编号： 一、名词解释题（本大题共3小题，每小题3分，总计9分） 1.Bioseparation Engineering：回收生物产品分离过程原理与方法。 2.双水相萃取：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相， 并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统(two aqueous phase system)。 利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于50年代 后期开发了双水相萃取法(two aqueous phase extraction)，又称双水相分配法(two aqueous phase partitioning)。 3.电渗：在电场作用下，带电颗粒在溶液中的运动。 二、辨别正误题并改正，对的打√，错的打×（本大题共15小题，每小题2分，总计30分） 1.壳聚糖能应用于发酵液的澄清处理是由于架桥作用。错（不确定） 2.目前国内工业上发酵生产的发酵液是复杂的牛顿性流体,滤饼具有可压缩性。错 3.盐析仅与蛋白质溶液PH和温度有关，常用于蛋白质的纯化。错 4.超临界流体是一种介于气体和液体之间的流体，可用于热敏性生物物质的分离。 对 5.膜分离时，当截留率δ=1时,表示溶质能自由透过膜。错 6.生产味精时，过饱和度仅对晶体生长有贡献。对 7.阴离子纤维素类离子交换剂能用于酸性青霉素的提取。对 8.卡那霉素晶体的生产可以采用添加一定浓度的甲醇来沉淀浓缩液中的卡那霉 素。 9.凝胶电泳和凝胶过滤的机理是一样的。错 10.PEG-硫酸钠水溶液能用于淀粉酶的提取。对 11.乙醇能沉淀蛋白质是由于降低了水化程度和盐析效应的结果。对 12.冷冻干燥一般在-20℃—-30℃下进行，干燥过程中可以加入甘油、蔗糖等作为保 护剂。对 13.反相层析的固定相和流动相都含有高极性基团，可用来分离生物物质。错 14.大网格吸附剂由于在制备时加入致孔剂而具有大孔径、高交联度，高比表面积 的特点。错（不确定） 15.PEG沉淀蛋白质是基于体积不相容性。错 三、选择题（本大题共10小题，每小题2分，总计20分） 1.对于反胶束萃取蛋白质，下面说法正确的是：A A 在有机相中，蛋白质被萃取进表面活性剂形成的极性核里 B 加入助溶剂，可用阳离子表面活性剂CTAB萃取带正电荷的蛋白质 C 表面活性剂浓度越高越好 D 增大溶液离子强度，双电层变薄，可提高反胶束萃取蛋白质的能力 2.能进行海水脱盐的是：C A 超滤 B 微滤
专题2 微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计 金堂县竹篙中学谭善财2013-3-16 一．本节课内容的总体目标 二、教学重点与难点 课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制课题难点：对分解尿素的细菌的计数 三、课时： 1h 四、本课题内容标准 1、研究培养基对微生物的选择作用，“研究”属于知识性领域的目标动词，应用水平 2、进行微生物的分离，“进行”属于技能性领域目标动词，独立操作水平 3、测定某种微生物的数量，“测定”属于技能性领域目标动词，独立操作水平。 五、本课题研究思路
六、教学思路： 七、教学流程 八、教学过程 教学内容 教师活动 学生活动 设计意图 复习提问 1.微生物最常用的两种接种方法是什么？ 2.什么稀释涂布平板法？其目的是什么？ 学生回忆 为细菌计数原 理、操作做好铺 垫 导入课题 引导学生阅读“课题背景”知识，提出的问题。 学生自主学习 回答问题 创设情景，引入 新课，使学生明 确分解尿素的细 菌的重要性，突出课题的必要性
研究思路 1、筛选 菌株 1、教师让学生阅读课本P21，讲解：DNA 聚合酶作用，发现过程。引导学生得到启示根据它对生存环 境的要求，到相应的环境中去寻找（即自然界筛 选）。 2、实验室中微生物的筛选原理实验室筛选：人为提 供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、p H 等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 3、教师展示各种筛选菌株方法的多媒体图片： 黄石公园热泉 海底火山 大肠杆菌显色培养基 实验室筛选SARS 菌株 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿 1、DNA 聚合酶发现过程，同学们得到什么启示？ 2.学生讨论为什么Taq 细菌能从热泉中筛选出来吗？ 3、学生阅读课本P22侧边栏关于本课题使用的培养基成分相关内容，讨论并回答提供碳源和氮源的分别是什么物质。 4.学生分析讨论，以尿素为唯一 氮源的培养基能否筛选出分解尿素的细菌 3、学生观看教师展示的多媒体图片。 4、学生讨论培养基如何对微生物进行筛选。 引导学生对知识进行迁移学习，培养学生的逻辑迁移思维。 通过观看图片， 使学生由感性认 识过渡到理性认 识。培养学生的学科素养。
新人教版生物选修1课题2《土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数》学案 学习目标 研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。 学习重点与难点 重点：对土样的选取和选择培养基的配制。 难点：对分解尿素的细菌的计数。 自主探究 1．尿素只有被分解成之后，才能被植物吸收利用。 2．以土壤中能分解尿素的细菌为研究对象，要达到的两个主要目的是： ⑴；⑵。 3．PCR（）是一种在体外将。此项技术的自动化，要求使用耐高温的DNA聚合酶。 思考：怎样找耐高温的酶呢？ 4．实验室中微生物的筛选应用的原理是：人为提供有利于生长的条件（包括等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 5．选择培养基是指。 6．常用来统计样品中活菌数目的方法是。即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。另外，也是测定微生物数量的常用方法。 7．比较教材中两位同学的操作方法，哪位同学的结果接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进呢？如需要，如何改进？ 8．一般来说，统计的菌落数往往比活菌的实际数目。这是因为 。因此，统计结果一般用而不是活菌数来表示。 9．设置对照实验的主要目的是，提高实验结果的可信度。 10．对照实验是 。 11．实验设计包括的内容有：、、和，具体的实验步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。 12．不同种类的微生物，往往需要不同的培养和培养。在实验过程中，一般每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以 。 13．无菌操作应注意什么问题？ ⑴ ⑵ ⑶ 14．在进行多组实验过程中，应注意做好标记，其目的是。 思考：应标记哪些内容？怎样操作更有利于实验的进行？ 15．对所需的微生物进行初步筛选，只是分离纯化菌种的第一步，要对分离的菌种进行一步的鉴定，还需要借助的方法。 思考：有哪些方法可以对菌种进行鉴定？ 【疑难点拨】
课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶 尿素最初是从人的尿液中发现的 筛选菌株 （1）实验室中微生物的筛选应用的原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 （2）选择性培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（3）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。 统计菌落数目 （1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微
镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数 2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC（在计数琼脂中加入适量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML琼脂中),细菌菌落长成红颜色,对去除食品本底颗粒物干扰非常有意义）. 3.本法仅限于形成菌落的微生物 设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。 实验设计
《生物分离工程》题库 一、填充题 1. 生物产品的分离包括R 不溶物的去除 ，I 产物分离 ，P 纯化 和P 精 制 ； 2. 发酵液常用的固液分离方法有 过滤 和 离心 等； 3. 离心设备从形式上可分为 管式 ， 套筒式 ， 碟片式 等型式； 4. 膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为 微滤膜 ， 超滤膜 ， 纳滤膜 和 反渗透膜 ； 5. 多糖基离子交换剂包括 离子交换纤维素 和 葡聚糖凝胶离子交换剂 两大类； 6. 工业上常用的超滤装置有 板式 ， 管式 ， 螺旋式和 中空纤维式 ； 7. 影响吸附的主要因素有 吸附质的性质 ， 温度 ， 溶液pH 值 ， 盐的浓度 和 吸附物的浓度与吸附剂的用量 ； 8. 离子交换树脂由 网络骨架 （载体） ， 联结骨架上的功能基团 （活性基） 和 可 交换离子 组成。 9. 电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是 引发剂（ 提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚 合所必需的自由基） ； 甲叉双丙烯酰胺的作用是 交联剂（丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺催化剂的作 用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链） ； TEMED 的作用是 增速剂 （催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的 聚合 ）； 10 影响盐析的因素有 溶质种类 ， 溶质浓度 ， pH 和 温度 ； 11.在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有 自然起晶法 ， 刺激起晶法 和 晶种起晶法 ； 12.简单地说离子交换过程实际上只有 外部扩散 、内部扩散 和化学交换反应 三步； 13.在生物制品进行吸附或离子交换分离时，通常遵循Langmuir 吸附方程，其形式为c K c q q 0+= 14.反相高效液相色谱的固定相是 疏水性强 的，而流动相是 极性强 的；常用的固定相有C 8 辛烷基 和 十八烷基C 18 ；常用的流动相有 乙腈 和 异丙醇 ； 15.超临界流体的特点是与气体有相似的 粘度和扩散系数 ，与液体有相似的 密度 ； 16.离子交换树脂的合成方法有 加聚法 和 逐步共聚法 两大类；
1、下列物质不属于凝聚剂的有（C）。 A、明矾 B、石灰 C、聚丙烯类 D、硫酸亚铁 2、发酵液的预处理方法不包括（C） A. 加热B絮凝 C.离心 D. 调pH 3、其他条件均相同时，优先选用哪种固液分离手段（B） A. 离心分离B过滤 C. 沉降 D.超滤 4、那种细胞破碎方法适用工业生产（A） A. 高压匀浆B超声波破碎 C. 渗透压冲击法 D. 酶解法 5、为加快过滤效果通常使用（C） A.电解质B高分子聚合物 C.惰性助滤剂 D.活性助滤剂 6、不能用于固液分离的手段为（C） A.离心B过滤 C.超滤 D.双水相萃取 7、下列哪项不属于发酵液的预处理：（D ） A.加热 B.调pH C.絮凝和凝聚 D.层析 8、能够除去发酵液中钙、镁、铁离子的方法是（C） A．过滤B．萃取C．离子交换D．蒸馏 9、从四环素发酵液中去除铁离子，可用（B） A．草酸酸化B．加黄血盐C．加硫酸锌D．氨水碱化 10、盐析法沉淀蛋白质的原理是（B） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 11、使蛋白质盐析可加入试剂（D） A：氯化钠；B：硫酸；C：硝酸汞；D：硫酸铵 12、盐析法纯化酶类是根据（B）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 13、盐析操作中，硫酸铵在什么样的情况下不能使用（B） A.酸性条件B碱性条件 C.中性条件 D.和溶液酸碱度无关 14、有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为（D） A.乙酸乙酯B正丁醇 C.苯 D.丙酮 15、有机溶剂为什么能够沉淀蛋白质（B） A.介电常数大B介电常数小 C.中和电荷 D.与蛋白质相互反应 16、蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（A）范围内适合。 A. ％～2％B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 17、生物活性物质与金属离子形成难溶性的复合物沉析，然后适用（C ）去除金属离子。 A. SDS B CTAB C. EDTA D. CPC 18、单宁沉析法制备菠萝蛋白酶实验中，加入1%的单宁于鲜菠萝汁中产生沉淀，属于(D )沉析原理。 A盐析B有机溶剂沉析C等电点沉析D有机酸沉析
人教版选修一专题2 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数作业 [基础全练] 1．土壤中的尿素分解菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成( ) A．尿素酶B．脲酶 C．蛋白酶D．肽酶 解析：土壤中的尿素分解菌体内能够产生脲酶，脲酶能够使土壤中的尿素分解为氨。 答案：B 2．用以尿素为唯一氮源加入酚红指示剂的培养基，培养细菌后，指示剂将( ) A．变蓝色B．变红色 C．变黑色D．变棕色 解析：细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，会使培养基的碱性增强，pH升高，加入酚红指示剂将变红。 答案：B 3．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是( ) A．筛选出能分解尿素的细菌 B．对分离的菌种做进一步鉴定 C．作细菌的营养成分 D．如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素 解析：筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的是对分离的菌种做进一步的鉴定。 答案：B 4．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( ) A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基 C．接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
D．接种了的选择培养基 解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此可用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。本实验的变量是培养基种类，其他方面如接种、培养条件等应相同。 答案：C 5．下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( ) A．采用稀释涂布平板法统计的菌落数目往往少于实际的活菌数 B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落 C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数 D．显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法 解析：采用稀释涂布平板法获得的菌落有些可能是由两个或多个细菌形成的，所以统计的菌落数目往往少于实际的活菌数，A正确；当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落，B正确；为了保证结果准确，一般选取菌落数在30～300的平板进行计数，C错误；除平板计数法外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法，D正确。 答案：C 6．用稀释涂布平板法来统计样品中尿素分解菌的数目，为了提高实验结果的可信度，往往要设置对照实验，对于对照组的要求不包括( ) A．对照组培养基也严格灭菌，且不接种任何微生物 B．倒平板时，培养基的用量与实验组必须完全相同 C．所用培养基成分及pH大小与实验组保持一致 D．对照组和实验组均放在相同且适宜的条件下培养 解析：对照组培养基也要严格灭菌，且不接种任何微生物，作为空白对照，A不符合题意；倒平板时，对照组培养基的用量与实验组不一定要完全相同，B符合题意；培养基成分、pH为无关变量，因此对照组所用培养基的成分及pH大小应与实验组保持一致，C不符合题意；对照组和实验组都要置于相同且适宜的条
教学准备 1. 教学目标 1、利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数 2、分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性 3、形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯 2. 教学重点/难点 教学重点：对土样的选取和选择培养基的配制 教学难点：对分解尿素的细菌的计数 3. 教学用具 多媒体、板书 4. 标签 教学过程 （一）引入新课 课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2 。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 3、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 （二）研究思路
1、筛选菌株 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选， 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 （1）实验室中微生物的筛选原理 原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控 制培养条件等选择目的微生物。 （2）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基 〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的的 是尿素，琼脂的作用是凝固剂。 〖思考2〗该培养基对微生物具有选择作用。如果具有，其选择机制是只有能够以尿 素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。 （3）培养基选择分解尿素的微生物的原理 培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺 乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用 此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。 （4）怎样证明此培养基具有选择性呢？ 实验组：以尿素为唯一氮源的培养基—只生长尿素细菌 对照组：牛肉膏蛋白胨培养基—生长多种微生物 2、统计菌落数目 在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。 【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1．研究培养基对微生物的选择作用。 2．进行微生物数量的测定。 一、研究思路 1．筛选菌株 尿素是一种重要的农业____肥，但不能直接被农作物吸收利用，只有当土壤中的细菌将尿素分解成____之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成______。 （1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的______生长的条件（包括营养、______、pH等），同时______或______其他微生物生长。 （2）选择培养基：在微生物学中，将允许________的微生物生长，同时______或______其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。 2．统计菌落数目 （1）常用来统计样品中______数目的方法是________。即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的________。通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目____。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用________来表示。 （2）____________也是测定微生物数量的常用方法。 （3）细菌的数目还可以通过______法来测定。例如，测定饮用水中大肠杆菌的数目，可将________的水过滤后，将滤膜放到________培养基上培养，大肠杆菌的菌落呈现____色，可以根据培养基上________的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。 3．设置对照 （1）设置对照的主要目的是排除实验组中__________对实验结果的影响，提高实验结果的________。 （2）对照实验是指除了________的条件以外，其他条件都______的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。 二、实验设计 实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的________以及时间安排等的综合考虑和安排。关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：1．土壤取样 土壤中的微生物70%～90%是_____，绝大多数分布在距地表______ 的近____性土壤中。 2．样品的稀释 样品的________将直接影响平板上生长的菌落数目。通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在________之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用____________倍的稀释液进行平板培养。第一次实验时，可将稀释范围放宽一点，以保证能从中选择出适于计数的平板。 3．微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养______和培养______。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d，放线菌一般在25～28 ℃的温度下培养5～7 d，而霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 d。 在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取____________时的记录作为结果，
库程》题《生物分离工一、填充题精P 纯化和I 产物分离，P 1. 生物产品的分离包括R 不溶物的去除， ；制 等；离心过滤和 2. 发酵液常用的固液分离方法有 等型式；碟片式套筒式， 3. 离心设备从形式上可分为 管式，，超滤膜微滤膜， 4. 膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为 ；反渗透膜纳滤膜和 两大类；和葡聚糖凝胶离子交换剂离子交换纤维素5. 多糖基离子交换剂包括 ；螺旋式和中空纤维式板式，管式，6. 工业上常用的超滤装置有吸附物和盐的浓度，溶液pH值，影响吸附的主要因素有7. 吸附质的性质，温度 ；的浓度与吸附剂的用量可（活性基）和（载体），联结骨架上的功能基团离子交换树脂由8. 网络骨架 组成。交换离子 提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是引发剂（9. ；合所必需的自由基） （丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺催化剂的作交联剂甲叉双丙烯酰胺的作用是 ；用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链） （催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的增速剂TEMED 的作用是 ；）聚合； pH 和温度影响盐析的因素有溶质种类，溶质浓度，10 ；和晶种起晶法自然起晶法，刺激起晶法在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有11. 三步；和化学交换反应 12.简单地说离子交换过程实际上只有外部扩散、内部扩散qc0在生物制品进行 吸附或离子交换分离时，通常遵循https://www.doczj.com/doc/8714872475.html,ngmuir吸附方程，其形式为?qK?c 14.反相高效液相色谱的固定相是疏水性强的，而流动相是极性强的；常用的固定相有C 辛8烷基和十八烷基C ；常用的流动相有乙腈和异丙醇；18 15.超临界流体的特点是与气体有相似 的粘度和扩散系数，与液体有相似的密度；
姓 线 号 学 封 班 卷 试密学 大 峡 三 2007年春季学期 《生物分离工程》课程考试试卷( A 卷) 参考答案及评分标准 注意：1、本试卷共 2 页； 2、考试时间: 110 分钟 3、姓名、学号必须写在指定地方 一、是非题(对打“√”，错打“x”，每小题 1 分，共 10 分) 1、在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内一般随温度升 高而增大。（√） 2、等电点沉淀适用于疏水性较大的蛋白质，亲水性强的蛋白质，在水中溶解度较 大，在等电点的pH值下不容易产生沉淀。（√） 3、在膜分离操作中，不能完全透过的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近的浓 度升高，引起浓差极化。（√） 4、在双水相萃取中，蛋白质的表面疏水作用会随着盐浓度的增大而减小。（x） 5、为提高分离效果，可通过降低流速u或减小固定相粒径来降低HETP，提高理 论板数。（√） 6、在吸附操作中，疏水吸附作用随温度升高而增大。（√） 7、凝胶过滤色谱是最简单的一种复性色谱方法，其在辅助蛋白质复性方面的作用 主要基于凝胶介质对复性过程中不同尺寸的分子或聚集体的排阻作用。 （√） 8、在膜分离中，温度升高，溶液黏度降低，则截留率升高。（x） 9、有机溶剂内胶团的表面活性剂分子的亲水尾部向外，溶于有机溶剂，而疏水头 部向内，此时形成的胶团称为反胶团。（x） 10、表面活性剂对乳状液膜的稳定作用在于其明显改变相界面的表面张力，但不 是所有表面活性剂都可以用于液膜的制备。（√） 二、选择题（每小题两分，共10分） 1、在收集细胞菌体时，可供选择的离心机可以是（A B C ）；而在收集蛋白时， 一般可供选择的离心机是（C ）。 A1页 A、低速离心机 B、高速离心机 C、超速离心机 2、超滤主要用于分离或浓缩（A、B、D）；微滤主要用于分离（ C ） A、蛋白质 B、病毒 C、细胞 D、酶 3、胰蛋白酶的等电点为10.6,在PEG/磷酸盐（磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物） 系统中，随pH值的增大，胰蛋白酶的分配系数（ A ） A、逐渐增大 B、逐渐减小 C、不变 D、先增后减 4、强酸性离子交换剂的滴定曲线随着氢氧化钠的加入，pH变化规律是（ A ） A、开始恒定不变，然后突然上升 B、开始恒定不变，然后突然下降 C、缓慢上升 D、无法判断 5、在吸附剂上通过化学修饰接上氨基配基，得到的离子交换剂的类型是（ B ）； 在萃取过程中加入季胺盐类表面活性剂，这类表面活性是（ C ）。 A、阳离子交换剂 B、阴离子交换剂 C、阳离子表面活性剂 D、阴离子表面活性剂 三、填空题（每空1分，共30分） 1、离心沉降是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固 体颗粒加速沉降的分离过程。该非均相分离手段不仅适用于菌体和细胞的分离手段， 而且可用于血球、胞内细胞器、病毒及蛋白质的分离。离心加速度一般是重力加速 度的r ω2倍。离心力用Z g来表示。 2、蛋白质的复性方法主要包括稀释复性、添加剂辅助复性、分子伴侣或人工分子伴 侣辅助复性、反胶团的应用、色谱柱复性等。 3、等电点沉淀法的原理是蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子 表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集 体，进而产生沉淀。 4、化学萃取是利用与被萃目标物发生反应的非极性物质作为萃取剂进行萃取操作。 5、超滤是根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相对分子量的差别进行分 离的方法。膜两侧的压力一般在0.1-1MPa之间。分离或浓度微粒的直径大小在 1-50nm。 6、实现吸附操作的主要设备有固定床、膨胀床、移动床和模拟移动床。 7、色谱（层析）是根据混合物中的溶质在两相之间分配行为的差别引起的随着流动 相移动速度的不同进行分离的方法。
专题二课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 【基础知识】 一、理论基础 1.筛选菌株 (1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时或其他微生物生长。 (2)选择培养基：在微生物学中，将允许种类的微生物生长，同时和其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 （3）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养；的微生物.加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。 2.统计菌落数目 （1）测定微生物数量的常用方法有和。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在的平板进行计数。此外，测定微生物数量的常用方法还有直接计数。 3.设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中对实验结果的影响，提高实验结果的。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养的培养基作为空白对照。 二、实验设计 关于土壤中某样品细菌的分离与计数实验操作步骤如下： 1.取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。应先 3 cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的中。 2.制备：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基，将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。 3.微生物的与观察
一、名词解释 1.亲和沉淀：生物亲和作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子 的分离纯化技术。 2.热沉淀：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的 现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。 等电点沉淀：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在 溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作 用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀 4.支撑液膜：是由溶解了载体的膜相液，在表面张力作用下，也考聚合 凝胶层中的化学反应或带电荷材料的静电作用，含浸在多 孔支撑体的微孔内而制成。 5.流动液膜：也是一种支撑液膜，液膜可循环流动，可弥补膜相易流 失的缺点；膜相强制流动或减小厚度可减小传质阻力。6.亲和膜：利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标 蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 7.膜生物反应器：膜分离过程与生物反应过程耦合的生物反应装置。 8.膜蒸馏：膜技术与蒸馏过程相结合的膜分离过程，它以疏水微孔膜 为介质，在膜两侧蒸气压差的作用下，料液中挥发性组分 以蒸气形式透过膜孔，从而实现分离的目的。 9.渗透气化：通过渗透气化膜，在膜两侧溶质分压差的作用下，根据 溶质间透过速度的不同，并在透过侧发生气化，使液体混 合物得到分离的膜分离法。 10.透析：通过小分子经过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小 分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 11.萃取：利用溶质在互不相溶两相间分配系数的不同使溶质得到纯化 或浓缩的方法 12.液膜萃取：液膜是由水溶液或有机溶剂（油）构成的液体薄膜，将 与之不能互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质 选择性透过液膜进入另一侧，实现溶质间的分离。 13. 超临界流体：温度、压力略超过或靠近临界温度和临界压力的流体。 14.离子交换层析：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交 换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层析法。 15.凝胶过滤层析：根据蛋白质的大小和形状进行分离和纯化。 16.盐溶:分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破 坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中。 盐析：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象。 17.临界胶束浓度：表面活性剂在水溶液中形成胶团的最低浓度。 18.正胶团：向水中加入表面活性剂，浓度达到一定值后，将发生表面 活性剂分子的缔合或自聚集，形成正胶团。 反胶团：向有机溶剂中加入表面活性剂，浓度超过一定值时形成反胶团。 19.蛋白质的变性作用：蛋白质分子受到某些物理、化学因素的影响时， 发生生物活性丧失，溶解度降低等性质改变，但是不涉及一 级结构改变，而是蛋白质分子空间结构改变，这类变化称为 蛋白质变性作用。 20.生物亲和作用：生物分子间的特异性作用，生物分子能在某种情况 下能够识别特定物质并与之吸引结合的一种现象。
第二节：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(教案) 一.菌种的筛选与选择培养基 1.菌种的筛选： (1)自然界中目的菌株的筛选： ①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 ②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。 (2)实验室中目的菌株的筛选： ①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 ②方法：利用选择培养基分离。 a.可利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就令尿素作为培养基中的唯一氮源。 b.可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受抑制，而分离对象却可乘机大大增值，在数量上占优势。 2.选择培养基： (1)概念：指允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。 (2)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某一化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。 (3)选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。 (4)选择培养基的用途：使混合菌株中的目的菌变成优势菌，提高该菌的筛选率。 (5)实例：在培养基中以尿素为唯一的氮源，可得到能利用尿素的微生物。 (所需培养基的配方如表所示) 培养基组成含量提供的营养或作用 KH2PO4 1.4 g 无机盐 Na2HPO4 2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖10.0 g 碳源 尿素 1.0 g 氮源、能源 琼脂15.0 g 凝固剂 水容到1 000 mL 氢元素、氧元素 备注：该培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，会因缺乏氮源而无法生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选出能分解尿素的微生物。 (6)常见的选择培养基 ①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。 ②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。 ③无氮源培养基可以分离固氮微生物。 ④石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物的目的。 ⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。 思考1：能在选择培养基上生长的肯定是所筛选的目的菌吗？ 原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在培养基上生长的微生物不一定都是所需要的微生物，还需进一步验证。 二.土壤中分解尿素的细菌的分离 1.实验流程(1)土壤取样： ①土壤取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。 ②要求：富含有机质(富含有机质的土壤层中微生物数量大、种类多)，酸碱度接近中性且潮湿(土壤中的微生物大约有70%~80%是细菌，此环境适宜细菌的生长)的土壤。 ③取样部位：先铲去表层土3cm左右，再取距地表3~8cm的土壤层，将样品装入事先准备好的信封中。(取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌) (2)制备培养基：以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，以尿素为唯一氮源的培养基作为实验组，用来判断选择培养基是否具有选择的作用。 (3)样品的稀释与涂布平板： ①取样稀释：在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡使土样与水充分混合。将细菌分散，制成101倍土样稀释液。用1支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106、107倍土壤稀释液。(稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目) ②取样涂布：按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从107~103的顺序涂布平板，不必更换移液管(涂布时稀释倍数的选择：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30~300之间，便于计数；如测定土壤中细菌的数量时，一般选用104、105、106倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中放线菌的数量时，一般选用103、104、105倍的稀释液进行平板涂布培养；测定土壤中真菌的数量时，一般选用102、103、104倍的稀释液进行平板涂布培养)。如下图： 备注： ★图中1、2、3平板是选择培养基，4平板为牛肉膏蛋白胨培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；要有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。 ★由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围103～107倍的稀释液。 ★实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 (4)微生物的培养与观察： ①培养：将涂布好的培养皿放在适宜温度(细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d，放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7 d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d)下倒置培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 ②计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 ③观察：微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落、最好以表格的形式将不同菌落的特征记录下来。 2.结果分析 (1)是否有杂菌污染： ①对照组培养基上无菌落生长?未被杂菌污染 ②实验组培养基上菌落数偏高?被杂菌污染
专题二微生物的培养与应用 课题二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶。尿素最初是从人的尿液中发现的。 筛选菌株 （1）实验室中微生物的筛选应用的原理 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 （3）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。 统计菌落数目 （1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。 （2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数2.为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入TTC 3.本法仅限于形成菌落的微生物 设置对照 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。 实验设计
《生物分离工程》题库+答案
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
《生物分离工程》题库 一、填充题 1. 生物产品的分离包括R 不溶物的去除，I 产物分离，P 纯 化和P 精制； 2. 发酵液常用的固液分离方法有过滤和离心等； 3. 离心设备从形式上可分为管式，套筒式，碟片式等型式； 4. 膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为微 滤膜，超滤膜，纳滤膜和反渗透膜； 5. 多糖基离子交换剂包括离子交换纤维素和葡聚糖凝胶离子 交换剂两大类； 6. 工业上常用的超滤装置有板式，管式，螺旋式和中空纤维式； 7. 影响吸附的主要因素有吸附质的性质，温度，溶液pH值，盐 的浓度和吸附物的浓度与吸附剂的用量； 8. 离子交换树脂由网络骨架（载体），联结骨架上的功能基团（活 性基）和可交换离子组成。 9. 电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是引发剂（提供催化丙烯酰 胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基）； 甲叉双丙烯酰胺的作用是交联剂（丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双 丙烯酰胺催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长 链）； TEMED的作用是增速剂（催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯 酰胺和双丙烯酰胺的聚合）； 10 影响盐析的因素有溶质种类，溶质浓度， pH 和温度； 11.在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有自然起晶法，刺激起晶法和晶种起晶法； 12.简单地说离子交换过程实际上只有外部扩散、内部扩散和化学交换反 应三步；
13.在生物制品进行吸附或离子交换分离时，通常遵循Langmuir 吸附方程，其形式为c K c q q 0+= 14.反相高效液相色谱的固定相是 疏水性强 的，而流动相是 极性强 的；常 用的固定相有C 8 辛烷基 和 十八烷基C 18 ；常用的流动相有 乙腈 和 异丙醇 ； 15.超临界流体的特点是与气体有相似的 粘度和扩散系数 ，与液体有相似的 密度 ； 16.离子交换树脂的合成方法有 加聚法 和 逐步共聚法 两大类； 17.常用的化学细胞破碎方法有 渗透冲击法 ， 酶消化法，增溶法 ， 脂溶法 和 碱处理法 ； 18.等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其 等电点 的不同； 19.离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有 静态洗脱 和 动态洗 脱 ； 20.晶体质量主要指 晶体大小 ， 形状 和 纯度 三个方面； 21.亲和吸附原理包括 配基固定化 ， 吸附样品 和 样品解析 三步； 22.根据分离机理的不同，色谱法可分为 吸附、离交、亲和、凝胶过滤色谱 23.盐析实验中用于关联溶质溶解度与盐浓度的Cohn 方程为 lgS=β-K s I ；当 在 一定pH 和温度下，改变体系离子强度（盐浓度）进行盐析的方法 称为Ks 盐析法；当 在一定离子强度下，改变pH 和温度进行盐析 称为β盐析法； 24.蛋白质分离常用的色谱法有 免疫亲和色谱法， 疏水作用色谱法 ， 金属 螯合色谱法 和 共价作用色谱法 ； 25.SDS-PAGE 电泳制胶时，加入十二烷基磺酸钠（SDS ）的目的是消除各种待分 离蛋白的 分子形状 和 电荷 差异，而将 分子量 作为分离的依据； 26.常用的蛋白质沉析方法有 等电点沉析法， 盐析法 和 有机溶剂