目 录
声明： (1)
大肠杆菌感受态细胞的制备 (2)
一、CaCl2感受态细胞的制备 (3)
二、电转感受态细胞的制备 (4)
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化 (14)
农杆菌感受态细胞的制备及转化 (17)
酵母感受态细胞的制备及转化 (18)
关于载体连接的讨论 (23)
声明：
本文所涉及的技术要点主要来源于相关文献、网络和书籍，此外，一些操作中的技巧及经验等来自于本人及同学、朋友的总结，仅供大家参考，同时也请下载者不要传播尤其是以商业为目的的复制、传播等等；如有转载、传播请注明来源于“螺旋网”。若本文侵犯了您的版权或有任何不妥，请Email：lofeel@https://www.doczj.com/doc/86587036.html, or helixnet@https://www.doczj.com/doc/86587036.html,告知。
此外，由于学识、经验有限，本文难免会存在一些错误或缺陷，敬请不吝赐教，联系方式：lofeel@https://www.doczj.com/doc/86587036.html, or helixnet@https://www.doczj.com/doc/86587036.html,；同时因存在环境、试剂、仪器以及人为等原因，不能保证实验100%的成功，仅供参考。
大肠杆菌感受态细胞的制备
体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。野生型E.coli 并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出不同的方法处理细菌，经过多年的努力，科学家们发现了可以增加细胞吸收外源DNA 效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种经过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，该细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。
对于E.coli，目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。其中，电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。其转化效率为109～1010转化子/μg DNA。而对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106～107转化子/μg DNA。
一、CaCl2感受态细胞的制备
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；
2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约
2.5-3小时（250-300rpm）；
3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；
以下步骤需在超净工作台和冰上操作
4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；
5．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl 2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
以上是基本步骤，基本同“分子克隆指南”，具体的体积（一次制作感受态细胞的量）由个人根据实际情况掌握，不一定要死守以上的体积，但要保持试剂、菌体等量的平衡。提高感受态效率的关键如下述――
注意事项：
1.克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板；
2.菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD 值不要过高，更不能超过0.6；
3.低温处理的时间，做完后冰上保存12到24h后分装，并保存于－80℃；
4.试剂和用品，非如果有可能，所有的用品（离心管、摇瓶等等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl 2溶液要过滤除菌，不要高压灭菌。
二、电转感受态细胞的制备
1、 -80℃冰箱保存的菌种在SOB固体平板上划单菌落；
2、次晨，挑选单克隆感至内含1ml SOB液体培养基的试管中，37℃，300rpm，6 hr；
3、然后转接到含400ml SOB液体培养基的2L摇瓶中（按1:500的量转接），300rpm，
4hr，然后每隔2 min测一次OD600，至OD600=0.76；
4、立刻置冰水浴中骤冷，可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转
摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来；
5、随后在250ml预冷的离心杯中离心，4℃，2000 g，10 min；
6、弃上清后，用预冷的水（灭菌的重蒸水）洗：先加少量水悬浮菌体（具体办法：
在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮），菌体悬浮后再把水加满，2200 g，10 min，弃上清；
7、再用10%的甘油同样方法洗两次，2400 g，10 min；
8、最后一次倒尽甘油后（尽量去干净），用残存在管底的甘油悬浮细胞，每120
μl分装到1.5 mL Ep管（EP管要-70度预冷），用-70℃的乙醇迅速冰冻；
9、保存在-80℃冰箱中备用。
以DH10B为例说明：
步骤1：每次做感受态都要新鲜划菌，不要使用保存于4℃或室温的平板；尽量使用原代菌，最好不要用多次传代的菌；LB平板也可以，但效率可能会降低；
SOB使用GIBCO公司的试剂配制，效果最好；但若电转的连接子为一般性载体，使用普通的试剂配制培养基即可；
步骤2：该步骤与步骤3中出现的数字存在相关性，条件允许的话尽量按照要求做，不允许的话则按照实验室实际情况稍做修改，确保菌体生长良好；
步骤3：确保OD达到要求，宁可低一点，也不要高一点，建议在达到0.5后过2-3 min就测一次OD值；
步骤4：一定要在冰水混合物中快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来，不要静置于冰水混合物中，摇动大约10 min；
步骤5：建议使用离心杯，因为其底是平的，并且灭菌时里面要装上双蒸水,利于步骤6，7与8中的悬浮操作；
步骤6：悬浮菌体时不要使用移液枪，开始时加入的水量要少，避免过多，等菌体重悬起来以后再加满。用手摇动时保证培养基液面低于冰面，重悬过程中注意悬浮的菌团出现，需将其全部分散开；
步骤7：同上
步骤8：尽量倒尽甘油，使感受态更浓，每400ml培养物制备1-1.5mL感受态为益；
关于EP管预冷与-70℃的乙醇迅速冰冻的具体办法：在菌种保藏盒内加入适量的乙醇，再把空的EP管盖上帽子后放入其中，置于-70度冰箱（或-80℃冰箱）预冷，分装感受态的时候将其取出（连带保藏盒），在超净台分装，分装时使用灭菌并剪去尖头的枪头，尽量使用1ml蓝色大枪头。完成后置于- 80℃冰箱；
步骤9：关于保存感受态的温度，- 70℃、- 80℃皆可，建议实验室现有的温度最低的冰箱；
以上方法适用于很多E.coli菌株，例如：XL1-Blue，DH10B，DH5α，Top10，
JM109，BL21等做电转感受态，可能不同的菌株生长速度有差异，方案中的培养时间与最佳OD值可能有变化，不妨用此方案尝试一下，如果效率不够高的话可以对所用的菌株进一步进行优化。
注意：
1.所用的摇瓶和离心管要洗的特别干净，禁用任何洗涤剂，用NaOH溶液洗数次；
2.重悬菌体用手振荡，不用振荡器；
3.用枪吸打要轻，枪头需要剪去尖头；
4.如果做的效果好，效率可以达到1010以上。
对于E.coli感受态制备，以上实验方案都要特别注意：所有的容器要用新的，不用洗涤剂，用手洗且保证彻底干净；相应的器材要作为制备感受态细胞专用，不做其他用途；试剂要选用最好的，尽量过滤除菌，不用高压灭菌等等。因为电转化效率更高，对要求转化率的实验，建议采用电转化的方法。
附件1. 晶美公司高效感受态细胞制作方法：
版权归晶美公司所有，仅供大家参考！
方法一
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；
C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小
时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。
根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。
1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态
的效率增加。
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。
方法二
1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.
2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.
3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于37度.
4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟
5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体
6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟
7.再次离心回收菌体
8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟
9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.
10.在液氮或-80度保存.
附件2. 小木虫 发布的高效感受态细胞的制作
小木虫网站所有，供大家参考。作者: noah
方法一
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；
C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。用纱布将所有装有
感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到1010，但是操作起来比较麻烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。
根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有许多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。
1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培养后的OD值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
6、培养温度。文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法，它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。
7、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。
方法二
1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.
2.挑直径1-3毫米的单菌落*可多个, 接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基. 培养基量不可再多,会影响效率.
3.在18度 150-250RPM 培养19-50小时*没有冷却摇床的可在室温, 但不可高于
37度.
4.OD600约0.4-0.8时停止培养, 放在冰水中冷却10分钟
5. 4度, 300RPM离心15分钟, 回收菌体
6.去掉上清后, 用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮, 在冷10分钟
7.再次离心回收菌体
8.用1/12.5体积的TB悬浮, 添加最终浓度为7%的DMSO, 再冷却10分钟
9.0.1-1毫升分装, 直接在液氮中冻上.
10.在液氮或-80度保存.
方法三
（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。
（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。
（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（4）用预冷的TB Buffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
（5）重复第4步操作。
（6）用8mL预冷的TB Buffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7% 。
（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。
本法效率极高,建议大家采纳
方法四
1. 单菌落-------2ml LB 37度 120RPM过夜------1%转接-------37度 200RPM2小时(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 弃上清, 悬浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重悬浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。
方法五
E.coli感受态细胞制备方法:
单菌落平板至2ml LB, 37℃250 r/m, 1ml 转至50 ml LB, 37oC 250 r/m至
A600=0.2-0.4
离心后用10毫升TSS重悬后,分装 -70oC保存。尽量冰上操作.
转化: 加质粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分钟，42℃ 90秒，冰上2分钟，加LB至1ml, 37℃1小时后铺抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及转化
以枯草芽孢杆菌168（Bacillus subtilis 168）为例
枯草杆菌化学感受态制备及转化方法
1.准备新鲜的168单克隆平板，取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37°C 培养箱培养12 h；
2.转化前一天晚间挑单菌落至3 ml LB培养基中，37°C，250 r/min培养过夜；
3.第二天上午取160 μl培养液转接至8 ml SPI培养基中，37°C，250 r/min培养至对数生长末期(168约4-5 h)；
4.取0.2 ml生长至对数期末的培养液至2 ml SPII培养基中，37 °C，100 r/min 培养90分钟；
5.在上述SPII培养基的菌体中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min培养10分钟；
6.将上述处理后的菌液分装成0.5 ml每管，各加入5 μl DNA（DNA量不能过高，不超过5μg），再于37 °C，250 r/min培养90分钟，取菌液涂布筛选平板。
相关试剂配方如下：
SP盐：
0.2%( NH4 )2SO4,
1.4% K2HPO4,
PO4,
0.6% KH
0.02% MgSO
?7H2O,
0.1% 柠檬酸钠;
CAYE (100×)：2 % Casamino acid，10%酵母膏。
SPI培养基： SP盐溶液加入1 %体积浓度为50%葡萄糖溶液，1 %体积100×CAYE
溶液；
SPII培养基：SPI培养基加入1 %体积50 mmol/L CaCl2溶液，1 %体积250 mmol/L MgCl2溶液。
z试剂
SP－A Salts Solution：（500 ml Solution）
0.4％ (NH4)2SO4 2g
2.8% K2HPO4·3H2O14g
1.2% KH2PO4 6g
0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g
121℃灭菌20min
SP－B Salts Solution：（500 ml Solution）
0.04% MgSO4·7H2O 0.2g
121℃灭菌20min
100× CAYE Solution：（100 ml Solution）
acid 2g
2％ Casamino
10％Yeast
Extract 10g
121℃灭菌20min
SPI Medium：（20 mL）
9.8mL SP－A Salts Solution
9.8mL SP－B Salts Solution
200μL （1％V）Glucose（50％w/v，115℃灭菌20min）
200μL （1％V）100× CAYE
SPII Medium：（6 mL）
5.88mL SPI Medium
60μL （1％V）50mM CaCl2
60μL （1％V）250mM MgCl2
100×EGTA Solution：10mmol／L EGTA 溶液，溶解时需加少量NaOH至pH8.0 注意：
1.注意仪器用品的干净和无菌；
2.8ml SPI培养基要放于50ml离心管中培养，以保证菌体的生长状态，不要使用
玻璃试管；
3.注意测定OD值，一定要等菌体生长至对数期后期；
4.保证菌体的浓度，可以提高转化率。
农杆菌感受态细胞的制备及转化
参考帖子：
https://www.doczj.com/doc/86587036.html,/viewthread.php?tid=72
https://www.doczj.com/doc/86587036.html,/redirect.php?tid=1056&goto=lastpost
酵母感受态细胞的制备及转化
有关毕赤酵母的相关资料：
毕赤酵母表达操作手册（精译版）
https://www.doczj.com/doc/86587036.html,/viewthread.php?tid=17&extra=page%3D1
毕赤酵母表达实验手册(丁香园版)
https://www.doczj.com/doc/86587036.html,/viewthread.php?tid=34&extra=page%3D1
毕赤酵母表达手册英文原版
https://www.doczj.com/doc/86587036.html,/viewthread.php?tid=19&extra=page%3D2
Pichia pastoris完整操作手册
https://www.doczj.com/doc/86587036.html,/viewthread.php?tid=2136&extra=page%3D2
更详细、全面的有关酵母的资料请去：
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以毕赤酵母为例说明其感受态细胞制备及转化。
对于毕赤酵母的转化目前有4种方法：
1.锂盐法；
2.PEG法；
3.原生质体法；
4.电穿孔法。
锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个转化子或更低，一般不多用。原生质体法和电穿孔法转化率都较高，且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到105/μg。但因原生质体法操作繁琐费时，所以简便、快速、高效的电穿孔法是理想的转化方法。
对以上几种方法分述如下：
毕氏酵母氯化锂转化法
1.试剂
1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）
2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；
2.感受态毕氏酵母的制备
1. 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；
2. 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；
3. 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；
4. 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；
5. 按50ul/管分装，立即进行转化；
注：不要将感受态酵母菌冰浴；
3.毕氏酵母的转化
1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；
2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；
5. 30℃水浴孵育30min；
CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 原理： 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。 受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-)，可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法，如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高，成为感受态细胞(Compenent cells)，使外源DNA分子得以进入。 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入无菌甘油至总体积15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl2法为使用更广泛。 准备： 1、配制0.05mol/L CaCl2-15%甘油(可用0.1mol/L CaCl2和30％甘油等体积混合) 混合溶液，高温高压灭菌； 注：CaCl2必须为分析纯以上。 2、实验中所需的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净， 高温高压灭菌； 注：最好有制备感受态细菌专用的一套实验器材。 3、受体菌的培养：从非选择性LB平板上挑取E.coli单菌落,接种于3-5ml LB液 体培养基 （ ）中，37℃振荡培养过 夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50~100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注：培养时间不宜超过2.5小时，否则不能达到最高转化效率。 实验步骤： 1、细菌的收获：培养液冰浴5分钟后，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）冰浴时间不要超过10分钟；（2）或者4℃8000g离心2分钟，速度太快或时间太长对细菌状态不利，并且不利于下步洗涤。（3）若出现很多黑色沉淀（细菌碎片），说明有多量细菌死亡，此时细菌状态并不好，但若只有少量黑色沉淀，或对转化效率要求不高，亦可继续进行。 2、用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟。 注：（1）洗去细菌碎片和残留的培养液；（2）洗涤时间宜短不宜长。 3、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分 钟，4℃5000g离心5分钟。 注：此时可见细菌沉淀为白色，体积也胀大为最初沉淀体积的数倍。 4、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感 受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2 法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经 CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体 中，一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转 以移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，摄取外源 DNA 。 转化（ Transformation）是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M- ），它可以容忍外源DNA 分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些 特殊方法（如电击法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生 了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞（ Compenent cells ）。进入受体细胞的 DNA 分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant ，即带有异 源 DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 和 RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可 以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70 ℃保存（半年），因此CaCl2 法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB 液体培养基
农杆菌电击感受态的制备及电击转化 表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化 （1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。 （2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。 （3）农杆菌EHA105电击预备处理。 I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。1.5ml III. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。 IV. 重复步骤ⅲ三次。 V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。 （4）电击 I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。 II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。 III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L 和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。8000rpm 1.制备农杆菌电转感受态 (1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素 100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。 (2)将2m1过夜培养的菌液加到50ml含同样抗生素的LB培养基中，28'C, 220rpm震荡 3-4小时，至OD560=0.5左右。 (3) 5000rpm离心5分钟，去上清。 (4) 加入40m1 10%甘油悬浮菌体，冰浴30min. (5) 4'C, 5000rpm离心5分钟，去上清。 (6 加入30mL10%甘油重悬浮菌体，4'C, 5000rpm离心5分钟， (7)重复步骤6一次，去上清，加入2ml10%甘油悬浮，分装于1.5ml的离心管中(200 p 1/ 管)备用。 2 农杆菌感受态的电转化 〔I)取2 ul质粒加到200 u I EHA 105感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30分钟。 (2)把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。 (3)马上加入lml新鲜的LB液体培养基，28'C, 150rpm轻摇4-6小时。 (4)收集菌体涂布于含有链霉素100mg/L),利福平(50mg/L)及质粒所含的抗性的LB固体培
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
农杆菌感受态制备与转化 普通农杆菌感受态制备与转化：方案一 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。 2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。 3. 5k rpm离心5分钟。 4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。 5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。 6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。 7. 液氮中冷冻1分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。 10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。 11. 涂板，28℃培养2-3天。 电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二 1．挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。（如用5mlYEP，需培养36h） 2．将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。 3．转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。4．用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。 5．4℃，4000rpm离心10min，弃上清。 6．重复4、5步骤2~3次。 7．用2ml冰浴的10％甘油重悬。 8．每管100μl分装于1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。 1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。 注：HEPES需现用现配。 电击法转化农杆菌感受态细胞 1．取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。 2．加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。3．取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中(电击杯-20℃预冷)，在2500V高压下电击。 4．取出电击杯，加入500μl预冷的YEP培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h。 5．取30-40μl菌液涂在含相应抗生素的YEP平板上，28℃倒置培养
实验三大肠杆菌感受态细胞的制备 【课前预习】 1、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理是什么？ 2、大肠杆菌感受态细胞的制备可以采用哪些方法？ 【目的要求】 1、了解感受态细胞生理特性及制备条件； 2、掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法； 【基本原理】 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。 基因工程技术中最常用的是氯化钙转化技术，虽然对其基本原理仍然不完全清楚，但是比较认同的看法是，细菌处干0℃、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀形成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附与细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，之后细菌在富含营养的培养基上生长，球状细胞复原并分裂繁殖，重组质粒在转化的细菌中，表达目的基因，因而在选择性培养基平板中，可以选出阳性细菌转化子。Ca2+处理的感受态细胞，一般每微克DNA能转化105-106个细菌、环化的质粒DNA 愈小，转化率愈高。环化的DNA分子比线性DNA分子转化率高1000倍。CaCl2转化法的优点是：简单快速，重复性好，菌株适用范围广。 另外，电击法也可用于转化过程，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依赖短暂的电击，利用瞬时高压电流（数千伏特）处理细胞悬浮液，使微生物细胞膜在高压电作用下发生去极化，产生微孔，悬液中溶解的核酸即可通过细胞膜上的空洞进入细胞内部，转化率最高达109-1010转化子/μg闭环DNA。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效
感受态细胞的制备（DH5α） 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） ① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 ② SOB培养基（Super Optimal Broth） ③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存） ④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块，调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4度保存。
A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。 其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和 感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。 以下是一些制备感受态的注意事项： 1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。 2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。 3、培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2。等菌摇好后，可以测一下pH 值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。 4、培养后的OD值。其实这是一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响
农杆菌感受态细胞的制备及转化、浸润烟草 1）挑取农杆菌单菌落于3 ml Sm（1000倍稀释）抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养过夜； 2）取过夜培养菌液500μl加入到50ml的Sm抗性的LB液体培养基中，28o C振荡培养至OD600为0.5； 3）5000rpm离心5min，倒掉培养液； 4）加入10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm 5min； 5）倒掉上清，加入1ml 预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用，或者分装成每管200μl，液氮中速冻，保存于-70 o C备用。 取200μl感受态细胞，加入1ug质粒DNA，液氮中速冻1min，37o C水浴5min，加入1ml LB，28o C慢速振荡培养4－6h后，涂布于含有相应抗生素的固体培养基平板上，28o C 培养约48h。挑取平板上长出的单菌落，接种于LB液体培养基（含有50μg/ml Kan和100μg/ml sm）中，28℃振荡培养过夜，碱裂解法小量提取质粒DNA，进行PCR及酶切鉴定。 用于浸润的菌液制备 MMA buffer：10mmol/L MgCl2(95.21)，10mmol/L MES(195.23)，100μmol/L 乙酰丁香酮(196.20)（Acetosyringone）(MgCl2 :2g MES :2g 乙酰丁香酮:50ul) 1）取单菌落接种于3ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）培养基中28℃振荡培养过夜； 2）取1ml活化后的菌液接入50ml LB（含有50μg/ml Kan和100μg/ml SM）中，28℃振荡培养至合适浓度OD600约0.8-1.0； 3）4℃，4000rpm离心15min，沉淀用MMA buffer重悬，菌液终浓度为OD600约1.0-2.0； 4）室温静置2hr以上，用1ml注射器对合适苗龄的本生烟进行浸润。
感受态细胞的制备： 1.以1:100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）。 2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。 3.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。 4.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。 5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。 6.于4℃，以4000rpm 离心10min，回收细胞。 7.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。 8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。 9.在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，防御-70℃冻存。 10.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。 感受态细胞制备流程图： 过夜菌250ul加入25ml LB液体培养基37℃，200r/min 振荡培养2-3h OD600测 达0.5左右转移至50ml聚丙烯离心管冰上放置30min 培养物到0℃ 4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞弃培养液倒置放置1min 加入 5ml 0.1mol/LCaCl2悬浮细胞沉淀，冰上放30min 4℃，4000rpm ，离心10min 回收细胞 弃培养液倒置放置1min 加入1ml预冷0.1mol/LCaCl2（含15%甘油）悬浮细 胞沉淀冰上分装，10ul/份70℃冻存（当天实验4℃放置4h，最多可放置48h）
A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页） 1 材料、设备及试剂 1.1材料 大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株 1.2试剂 LB液体培养基： 蛋白胨10g/L 酵母提取物5g/L NaCl 10g/L NaOH（1mol/L）1mL/L 400mL 0.1M/L预冷的CaCl2溶液（高温高压灭菌） 50%甘油 75%酒精 95%酒精 液氮 1.3 实验设备 接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。 2 实验步骤 1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。 2、培养12～16h，取1ml培养物加入到100mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD=0.4~0.6(3~4h) 3、在无菌条件下将菌液转移到250mL离心管中，置于冰上10min. 4、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。 5、加入20mL预冷的0.1M/L CaCl2溶液重新悬沉淀，至于冰上30min（严格） 6、于4℃，3000rpm离心5～10 min，弃上清，收集菌体。 7、加入4 mL0.1M/L CaCl2溶液及15%(最终浓度)甘油（50%的甘油1.71428 mL），重悬沉淀。 8、以100μL每管分装于1.5mL冻存管中保存于液氮。 3 试验结果 4 注意事项
Y187 酵母感受态制作及转化 1）挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液，30℃，250 rpm 培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10 转接，此时OD600≈0.3； 3）30℃，250 rpm，4-7 h，每2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6； 4）转入2 个50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清； 5）加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清； 6）每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清； 7）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc，每管100 ul 分装； 10）分别加入100 ng 左右DNA（plasmid）和0.1 mg 鲑鱼DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液； 11）分别加入600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）； 12）30℃摇床恢复30 min； 13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀； 14）42℃热激15 min； 15）冰上放置1-2 min； 16）14 000 rpm,15 s,去上清； 17）300 ul TE 重悬细胞； 18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。
农杆菌感受态细胞制备 第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。 注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。 第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。 注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。 第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。 注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。 摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。 4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。 6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。 7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。 注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。 8) 4℃，5000rpm 离心5min 。 9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。 10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。 注意：要用1ml 枪轻轻抽打。 11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。
感受态细胞制备 实验目的 1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术； 2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法； 3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。 实验原理 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的 状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态, 如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶 液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时 间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCI2 能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化
学法高出1 到2 个数量级，达到1x108转化子每1 卩gDNA甚至1x109转化子每1卩gDNA所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围 广，感受态细菌可以在-70 C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109?1010转化子/卩g 闭环DNA因操作简便，愈来愈为人们所接受。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化率（转化子数/每卩g质粒DNA =转化子总数/ 质粒DNA加入量（卩g） 理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数 为1*10 10 实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB 液体培养基、 实验试剂：溶液、含10%甘油的溶液、GYT三蒸水、10% 甘油的水
一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB 液体培养基（1升）：酵母提取物1g ，牛肉膏5g ，蛋白胨5g ，蔗糖 5g ， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm ）储液：125mg/ml
0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。 四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB 液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l液体培养基中，28°C 振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min ； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml ，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备用。
一、目的 1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。 2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。 二、原理 （一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理 所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子 的感受态细胞。在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。 目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。主要有两种假说： 1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。证据有： （1）发芽的芽孢杆菌容易转化； （2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化； （3）适量的溶菌酶能提高转化率。 2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；
（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。 目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1776菌株的转化结果，认为： 近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。 （二）重组DNA 的转化原理 我们已经制备好大肠杆菌感受态细胞，接下的实验是把重组的DNA 引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中选出转化子。作为受体的大肠杆菌C600 或DH5α，必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株。这样外来的DNA分子不会受其限制酶的降解。保持外来DNA 分子在受体细胞中的稳定性。制备的大肠杆菌细胞就具有这三种缺陷（rk- mk- rec-）同时此受体细胞还是氨苄青霉素敏感（Ap）。 在体外构建好的重组分子上具有分解氨苄青霉素（Ap）基因存在，当它导入受体细胞后，就赋于这些受体细胞新的特性，即Ap 抗性。同时载体质粒上具有乳糖操纵的β一半乳糖苷酶基因(lacZ，我们可以利用外源基因插入载体β一半乳糖苷酶基因(lacZ，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理来选择新构建的重组子。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期6个月 。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法 ，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5× 106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高 100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便愈来愈为人们所接受。 3、感受态细胞制备及转化中的影响因素
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。