冰淇淋微生物检验方法
一、大肠菌群检验 (110)
二、菌落总数的测定 (117)
三、嗜冷菌的检测 (120)
四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验 (120)
五、涂抹检验 (125)
六、空气净度检验 (126)
七、水样的检测 (127)
一、大肠菌群检验（依据国标GB/T4789.3-2003）
（一）概念：
大肠菌群：经37℃24h培养，能发酵乳糖，产酸、产气，需氧或兼性厌气的G-无芽胞杆菌。该菌主要条件来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。
（二）培养基配制：
1.乳糖胆盐发酵管：
成分：蛋白胨20g
胆盐5g
乳糖10 g
0.04%溴甲酚紫水溶液25ml
蒸溜水1000 ml
PH 7.4
制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH加入指示剂，分装每管10ml，并放入一个小倒管，115。C高压灭菌15min。
注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。
2.乳糖发酵管：
成分：蛋白胨20g 乳糖10 g 0.04%溴甲酚紫水溶液25ml 蒸溜水1000 ml PH 7.4
制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正PH值，加入指示剂，分装3--5 ml，并放入一个小倒管，115。C高压灭菌15min。
3. 伊红美蓝培养基：
成分：
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂 17g
2％伊红水溶液 20ml
0.65％美蓝水溶液 13ml
蒸馏水 1000ml
pH为7.1
制法：
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内， 121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
（三）大肠菌群检验程序：
（四）操作程序：
1.检样稀释
（1）以无菌操作将检样25ml（g）放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000-10000r/min
的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。
（2）用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。（3）另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。
（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
3.乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，臵36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，臵36±1℃温箱内，培养18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
菌落形态：
Ⅰ紫黑色，有金属色泽
Ⅱ紫黑色，无金属色泽
Ⅲ中心紫黑色，外缘为粉红色
4.证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，臵36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
革兰氏染色：挑取可疑菌落
灭菌盐水→取菌→火焰上固定→结晶紫染色1min水洗→革兰氏碘液染色1min→水洗→95%乙醇染色30S→水洗→复染液染色1min→水洗→待干→镜检。
大肠菌群采用三步法（初发酵，分离培养和证实试验）
第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经平板分离和证实实验后，有时可能成为阴性。因此，初发酵与证实实验相差较大。
5.报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml （g）大肠菌群的MPN值。
6.注意事项：
（1）乳糖胆盐发酵管内有无倒立小导管，且观察小倒管内是否有气泡。
（2）小导管不能缺裂，口不能被堵。
（3）平板分离：挑取菌落3~5个。
（4）加样液时要沿管壁缓慢加入，防止小倒管里冲入气泡。
（5）加入样液时一定要混匀。
（五）染色法：
1.美兰染色法：
（1）吕氏美蓝染色液
美蓝 0.3g 95%乙醇 30ml 0.01%氢氧化钾溶液100ml
将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。
（2）染色法
将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1-3分钟，水洗，待干，镜检。
（3）结果：菌体呈兰色。
2.革蓝氏染色法：
（1）原理：G-菌（革兰氏阴性菌）细胞壁厚，细胞壁中脂类化合物多，含肽聚糖少，酒精溶解脂类，细胞壁通透性好，酒精
可以碘和结晶紫的复合物溶出，番红进入→红色。
G+菌（革兰氏阴性菌）细胞壁薄，细胞壁中脂类化合物
少，含肽聚糖多，细胞壁通透性差，碘和结晶紫的复合物
滞留→蓝紫色。
（2）染液的配制：
1）结晶紫染液：结晶紫1g + 95%乙醇20ml + 1%草酸铵水溶液 80ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
2）革蓝氏碘液：碘1g + 碘化钾2g + 蒸馏水300ml，将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，等完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。
3）沙黄复染液：沙黄0.25g + 95%乙醇10ml + 蒸馏水 90ml，将沙黄溶解与乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
（3）染色法：
1)用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再用灭菌环挑取少量菌种于载玻片上与生理盐水充分混合。
2)涂片自然干燥或在火焰上固定，滴加结晶紫，染1分钟水洗。
3)滴加革蓝氏碘液，作用1分钟，水洗。
4)滴加95%乙醇脱色，约30秒；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10秒。
5)水洗，滴加复染液，复染1分钟。水洗，待干，镜检。
（3）结果：革蓝氏阳性菌呈紫色。革蓝氏阴性菌呈红色。
附：大肠菌群最可能数（MPN）检索表
注：（1）本表采用3个稀释度（1ml(g) 、0.1ml(g) 、0.01ml(g) ），每稀释度3管。
（2）表内所列检样量如改用10 ml(g)、1 ml(g)、0.1 ml(g)时，表内的数字应相应降低10倍，如改用0.1 ml(g)、0.01 ml(g)、0.001 ml(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。
二、菌落总数的测定（依据国标GB/T4789.2-2003）
（一）概念：
菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分培养温度和时间、PH值、需氧性等）所取1ml（g）检样中所含菌落的总数。
主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌对食品被污染程序的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
（二）培养基：
营养琼脂:
成分：蛋白胨 10 g
牛肉膏 3 g
氯化钠 5g
琼脂 15-20g
蒸馏水 1000ml
制法：将除琼脂以外的成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2 ml校正PH至7.2-7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121。 C高压灭菌15分钟。（注：现化验室用直接配制好的营养琼脂混合物）
（三）操作步骤：
（1）以无菌操作，将检样25g(25ml)剪碎放于含有225ml，灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。
（2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。
（3）另取1ml灭菌吸管，按上面操作顺序，做10递增稀释液，如此每增加一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
（4）根据样品卫生标准要求或对样本污染情况进行估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时（从检样稀释到倾注平板不超过20min）将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿内15ml，并转动平皿使混合均匀。同时，将营养琼脂培养基倾入不加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。
（6）待琼脂凝固后，翻转平板，臵36±1℃温箱内培养48±2h。
注意事项：
（1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。
（2）吸液体时液体不能进入吸头。
（3）样品稀释时一定要混匀。
（4）倒培养基前，瓶口要过火焰。
（5）一定要有空白对照。
（6）培养基温度控制，培养基薄厚。
（7）检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。
2 、检测完要迅速进行培养。
（四）菌落计数的方法
（1）平板菌落数的选择
选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌数生长时，则不宜采用，应以无片状菌数生长的平板柞为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数，平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线）若仅有一条链，可视为一个菌落，如有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。（2）稀释度的选择
①应选择平均菌落数在30~300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告。
②若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30~300之间，则视两者之比如何来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的数字。
③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数报告。
⑤若所有稀释度无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
⑥若所有稀释度的平均落菌数均不在30~300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300平均菌落数乘以稀释倍数。（3）菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数来表示。（见下表）
稀释度选择及菌落数报告方式
三、嗜冷菌的检测
（一）培养基：
CVT培养基配制：
成分：酵母浸膏2.5g，蛋白胨5.0g，结晶紫0.002g，琼脂条冬季加15g、夏季加20g，TTC 0.05g，葡萄糖1.0g，蒸馏水1000ml。
制法：在未加琼脂条和指示剂前、在室温下用4%的氢氧化钠调
PH=7.0，溶解后，再15P，20分钟条件下高压灭菌。
（二）操作步骤：
1.以无菌操作称取检样25g（或25ml），放入含有225 ml灭菌水的三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。
2. 用灭菌吸管吸取1：10稀释液1 ml注入含有9ml无菌生理盐水的试管中，即为1：100稀释液。依此类推，做成稀释倍数为1：1000和1：10000的稀释液，做一次递减稀释液换一次吸管。
3.用无菌管吸取1ml 1：1000的稀释液于灭菌平皿中，作2个平皿；再吸取1：10000的稀释液1ml于灭菌平皿中，作2个平皿。
1.将凉至45。C左右的嗜冷菌培养基（最好是CVT培养基）注入平皿
中，待凝固后，倒臵于7~10。C冰箱中，培养10天后开始计数。（三）菌落计数方法：见国标GB/T4789.2-2003菌落总数的测定中7.3菌落计数的报告（即菌落总数记数方法）。
（四）菌落形态：呈红色或紫色。
四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验（依据国标GB/T4789.29-2003）1培养基：
1.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）
1.1.1成分：
胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL
1.1.2制法：将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min，备用。
1.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSA-YE）
1.2.1成分：
胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL
1.2.2制法：将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min，备用。
1.3 EB增菌液
1.3.1成分：
胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL，盐酸丫啶黄15mg/L，萘啶酮酸40mg/L 1.3.2制法：除盐酸丫啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合，调PH 至7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min。使用前加盐酸丫啶黄15mg/L 和萘啶酮酸40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。
1.4李氏增菌液（LB1，LB2）
1.4.1成分：
胰胨5g，多价胨5g，酵母膏5g，氯化钠20g，磷酸二氢钾1.35g，磷酸氢二钠12g，七叶苷1g，蒸馏水1000mL
1.4.2制法：将上述各成分加热溶解，调PH至7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min。
1.4.
2.1李氏Ⅰ液（LB1）200 mL加入：
1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.45mL
1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馏水配制）0.27 mL
1.4.
2.2李氏Ⅱ液（LB2）200 mL加入：
1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.40mL
1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馏水配制）0.50 mL
无菌分装于10 mL大试管中。
1.5三糖铁（TSI）琼脂：GB/T4789.28-2003中4.26、27。
1.5.1成分
蛋白胨20g,牛肉膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g,氯化纳5g, 硫酸亚铁铵[Fe（NH4）2（SO4）2?6H2O]0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,
酚红0.025g,蒸馏水1000mL,pH7.4
1.5.2制法
将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入
琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121℃高压灭菌15min，放臵高层斜面备用。
1.6 SIM动力培养基
1.6.1成分：
胰胨20g，多价胨6g，硫酸铁铵0.2g，硫代硫酸钠0.2g，琼脂3.5g，蒸馏水1000mL
1.6.2制法：将上述各成分加热混合，调PH至7.2，分装小试管，121℃高压灭菌15min。
1.7血琼脂：GB/T4789.28-2003中4.6。
1.7.1成分:
豆粉琼脂(PH7.4~7.6)100 mL,脱纤维羊血(或兔血)5~10mL
1.7.2制法:加热溶化琼脂，冷却50℃,以灭菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板.亦可分装灭菌试管,臵成斜面.亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼.
1.8改良的Mc Bride（MMA）琼脂
1.9硝酸盐培养基：GB/T4789.28-2003中3.17。
1.9.1成分：
硝酸钾0.2g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，PH7.4。
1.9.2制法：熔解，校正PH，分装试管，每管约5 mL，121℃高压灭菌15min。
1.9.3硝酸盐还原试剂：
甲液：对氨基苯磺酸0.8 g 溶解于2.5mol/l乙酸溶液100 mL中。乙液：甲萘胺0.5 g 溶解于2.5mol/l乙酸溶液100 mL中。
1.9.4试验方法：
接种后在36±1℃培养1~4天，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于于立刻或数分钟内显红色。
注：本试验阴性原因有三:细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
1.10缓冲葡萄糖蛋白胨水：GB/T 4789.28-2003中3.4。
1.10.1成分：磷酸氢二钾5 g、多胨 7g、葡萄糖5 g、蒸馏水1000mL、PH7.0。
1.10.2制法：加热熔解，校正pH。分装试管，每管1 mL ，121℃高压灭菌15min。
1.11糖发酵培养基：GB/T 4789.28-2003中3.2。
1.11.1成分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钠
(Na2HPO4〃12H2O) 2g，0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，pH7.4
1.11.2制法：
1.11.
2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒臵小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。
1.11.
2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
1.11.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1℃培养，一般观察2～3d。迟缓反应需观察14～30d。
1.12Rustigian尿素培养液：GB/T 4789.28-2003中4.38。
1.1
2.1成分：
尿素20.0g，酵母浸膏0.1g，磷酸二氢钾0.091g，磷酸氢二钠0.095g，酚红0.01g，蒸馏水1000mL
1.1
2.2制法：
将上述成分于蒸馏水中溶解，校正PH为6.8±0.2。不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管约为3 mL。
1.13 1%盐酸丫啶黄溶液：用灭菌蒸馏水配制
1.14 1%萘啶酮酸钠盐溶液：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制
2操作步骤：
2.1样品的收集及处理
无菌取样品25g （mL）放灭菌均质器中加225mL EB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。
2.2增菌培养
EB增菌液放30±1℃培养48h，LB1增菌液225 mL放30±1℃培养24h，吸0.1mL，加入10 mL LB2增菌液中二次增菌。
2.3分离培养
将EB增菌液和LB2二次增菌液，分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30±1℃48h，调取可疑菌落，在白炽灯45o角斜射光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。
2.4选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂和SIM动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月牙状生长。一般观察2~7天，阳性者可做下一步鉴定。
2.5纯培养
将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产生硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基
（TSA-YE）上纯培养，做以下鉴定。
2.6染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为（0.4 ~0.5m）х（0.5~2.0μm）；生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
2.7生化特性
将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别见表1。
五、涂抹检验
（一）涂抹操作规程：
1.进入车间先经过消毒池消毒；
2.在洗手池洗手消毒；
3.涂抹前用75%的酒精棉球消毒手和镊子；
4.用消毒镊子取25cm2湿润灭菌涂抹纸（或涂沫棒），贴（或涂）于被涂抹物表面，使之充分接触，贴完50 cm2后，立即放入装有50ml灭菌生理盐水的三角瓶中，盖好瓶塞，使涂抹纸与盐水充分混合并做好标识，在4h内进行菌落总数和大肠菌群的测定。（二）菌落总数的测定：
1.检样前使三角瓶内生理盐水与涂抹纸充分摇匀，使之充分接触。
2.用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，注入灭菌平皿内且做两个平皿。
3.及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿（沿同一方向）使混合均匀。
4.待琼脂凝固后，翻转平板臵36±1℃温箱内培养48±2h。
（三）大肠菌群的测定：
用10ml灭菌吸管吸取10ml液体，沿管壁缓缓注入装有10ml双料乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；
用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，沿管壁缓缓注入装有10ml单料乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；
用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，沿管壁缓缓注入装有9ml生理盐水的试管内，混匀做成1：10的稀释液；
用1ml灭菌吸管吸取1ml1：10的稀释液，沿管壁缓缓注入装有10ml单料乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；
做好标记臵于36±1℃温箱内培养24±2h。
（四）芽孢耐热芽孢检验
1.用10 ml灭菌吸管吸取10ml检样分别于两个灭菌试管内，盖紧棉塞，做好标识。
2. 另取两试管装入10 ml水，分别插入温度计1支。
3.将上述试管同时放入水浴中，待温度计温度升至80℃（芽孢检验温度）或100℃（耐热芽孢检验温度）开始计时，10分钟后取出，立即冷却至室温。
4.用1ml灭菌吸管吸取1ml检样于灭菌平皿内，做两个平皿。
5.将凉至46℃左右的锰盐营养琼脂（每1000ML普通营养琼脂中加硫酸锰(3.08gMnSO4+100mlH2O)1ml）培养基注入平皿内约15ml，充分转动摇匀。
6.芽孢测定将平皿翻转臵36±1℃温箱内培养60--62h。
药品微生物检验替代方法验证指导原则 本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。 随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。 在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 微生物检验的类型及验证参数 药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。 由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。 表1 不同微生物检验类型验证参数 注： 尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。 进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。 替代方法验证的一般要求 在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法
附件 食品微生物之檢驗方法－阪崎腸桿菌之檢驗 1 適用範圍〆本方法適用於一般食品及奶粉中阪崎腸桿菌之檢驗。 2 檢驗方法〆 2.1 工作環境〆工作平台須寬敞、潔淨、光線良好，操作平台光度為100呎燭光以上，密閉室內換 氣良好，儘可能沒有灰塵及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 2.2 器具及材料〆 2.2.1 乾熱滅菌器。 2.2.2 高壓滅菌釜。 2.2.3 攪拌均質器（Blender）或鐵胃（Stomacher）〆適用於無菌操作者。 2.2.4 天平〆可稱量到2000 g者，靈敏度為0.1 g々可稱量到120 g者，靈敏度為1 mg。 2.2.5 冰箱〆能維持5 ±3℃者。 2.2.6 吸管或吸管尖〆已滅菌，1 mL吸管應有0.01 mL之刻度々5 mL及10 mL吸管應有0.1 mL 之刻度。 2.2.7 吸管輔助器（Pipette aid）或微量分注器。 2.2.8 稀釋瓶〆160 mL，玻璃、聚乙烯（polyethylene）、鐵弗龍（Teflon）或其他能耐121℃濕熱滅 菌20分鐘以上之塑膠材質，附螺旋蓋。 2.2.9 培養皿〆已滅菌，內徑約9 cm，深度約15 mm，底皿之內外面應平坦，無氣泡、刮傷或其 他缺點。 2.2.10 增菌用容器〆附螺旋蓋之125 mL、250 mL、2 L三角錐瓶或廣口瓶々玻璃、聚乙烯、鐵弗龍 或其他能耐121℃濕熱滅菌20分鐘以上之塑膠材質。 2.2.11 pH測定儀。 2.2.12 培養箱〆能維持內部溫度在±1℃以內者。 2.2.13 溫度計〆量測溫度範圍1～55℃，最小刻度0.1℃。 2.2.14 水浴〆加蓋，具水流循環系統，能維持水溫溫差在±0.2℃以內者。
食品微生物检验技术课程文献综述 题目: 常见致病菌导致的食物中毒及其检测姓名: 木日西提江 学院: 新疆农业大学食品科学与药学学院专业: 食品科学 班级: 071班 学号: 074031156 指导教师: 王伟 2010年12 月7 日
常见致病菌导致的食物中毒及其检测 摘要:食品安全与食源性疾病已成为一个全球性的重大公共卫生问题，而食物中毒作为最典型的一大类食源性疾病更得到了世界各国政府的广泛关注与重视。凡是导致机体正常生理功能破坏，引发机体病理改变甚至死亡的物质被称为毒物。毒物随食物或毒物被当作食物进入人体引起的中毒被称为食物中毒。本文以常见致病菌导致的食物中毒为出发点，对常见食物中毒分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性三大类，叙述其中毒原理及常见症状，描述食物中毒的发病原理，发病症状，检验方法（包括快速检验）。并详细描述微生物的快速检测。 关键字致病菌沙门氏菌检验快速检验 正文 食物中毒是指吃了不洁或有毒食物而导致的疾病。通常在吃了有问题的食物1至72小时内发病，病情严重者可以致命。食物中毒一般分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性（包括细菌性和真菌性食物中毒）。 一、化学性食物中毒 化学性食物中毒是指误食有毒化学物质，如鼠药、农药、亚硝酸盐等，或食入被其污染的食物而引起的中毒。发病率和病死率均比较高。中毒症状急性中毒有心悸，面颈、四肢肌肉颤动，有手抖甚至不能站立，头晕，乏力，原有心律失常的患者更容易发生反应，心动过速，室性早搏，心电图示S-T段压低与T波倒置。其中常见的化学性食物中毒有： （一）毒鼠强中毒：毒鼠强毒性极大，对人致死量5—12毫克。一般在误食10－30分钟后出现中毒症状。轻度中毒表现头痛、头晕、乏力、恶心、呕吐、口唇麻木、酒醉感。重度中毒表现突然晕倒，癫痫样大发作，发作时全身抽搐、口吐白沫、小便失禁、意识丧失。 （二）亚硝酸盐中毒：俗称“工业用盐”。摄入亚硝酸盐0.2-0.5克就可以引起食物中毒，3克可导致死亡。发病急，中毒表现为口唇、舌尖、指尖青紫等缺氧症状，重者眼结膜、面部及全身皮肤青紫。自觉症状有头晕、头痛、无力、心率快等。急救处理：催吐、洗胃和导泻以消除毒物；应用氧化型亚甲蓝（美蓝）、
竭诚为您提供优质文档/双击可除医学检验微生物实习自我鉴定 篇一：检验科细菌室实习小结 检验科细菌室实习小结 1、检验科细菌室实习小结 细菌是的工作中，无菌操作很重要，不管是在细菌接种、鉴定还是药敏的时候，必须严格进行规范操作，否则将导致交叉污染，同时无菌操作也能更好的保护好自己。 在实习和工作中一定要将理论联系实际，要善于思考，在观察菌落形态和细菌镜下形态时更应仔细认真，临床微生物的工作是一个经验积累的过程，要想成为一名优秀的检验医师，今后在微生物方面的学习中还得加倍努力。 在细菌室实习生活结束之际，我要特别感谢细菌室的每一位老师，感谢他们耐心、和蔼的教导，是他们严谨、一丝不苟的科学态度教育了我，是他们团结协作、融洽的工作气氛感染了我。他们循循善诱给我讲解，他们耐心规范了我的操作，他们给予我很大的信任与鼓励，放手让我操作。而我能做的是在今后的学习和工作中带着一颗感恩的心认真负
责地工作，培养高尚的职业道德、严肃的科学态度和一丝不苟的工作作风，使自己成为一名合格的检验专业的的优秀人员。 祝福细菌室每一位老师工作顺利、阖家幸福。 2、检验科细菌室实习小结 还记得，实习第一天的时候，老师就说，在细菌室，这短短的两个月时间是远远不够的。确实啊，我的细菌室实习是暂时告一段落了，但在微生物的学习之路还是很长的。现在我们所学到的仅仅只是入门啊！ 在实习和工作中一定要将理论联系实际，要善于思考，要严谨对待，临床微生物的工作即是一个不断积累经验的过程也是一个要随时更新知识的过程。要想成为一名合格的检验医师，今后在微生物方面的学习中还得加倍努力。 在细菌室实习生活结束之际，我要特别感谢细菌室的每一位老师，感谢他们耐心、和蔼而又严厉的教导，是他们严谨、一丝不苟的科学态度教育了我，是他们团结协作、融洽的工作气氛感染了我。他们循循善诱给我讲解，他们耐心规范了我的操作，他们给予我 很大的信任与鼓励，放手让我操作。也很谢谢你们包容我的错误，并给予我改正错误的机会，而我能做的是在今后的学习和工作中更认真负责地工作，培养高尚的职业道德、严肃的科学态度和一丝不苟的工作作风，使自己成为一名合
食品微生物检验技术复 习题 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
名词解释 样品（sample）是指从某一总体中抽出的一部分。 食品采样（sampling）是指从较大批量食品中抽取能较好地代表其总体样品的方法。 接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。 V-P试验：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。 生理生化试验：微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 硫化氢（H2S）试验：有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 增殖培养基: 在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。 外源性污染：食品在生产加工、运输、贮藏、销售食品过程中不遵守操作规程或不按卫生要求使食品发生污染称为外源性污染，也称为第二次污染． 环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。 微生物性食物中毒：食用被微生物或微生物毒素污染的食品而引起的中毒称为微生物性食物中毒。 无菌接种操作：培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具在无菌条件下接种含菌材料于培养基上，这过程叫做无菌接种操作。 菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。 细菌总数：指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。 大肠菌群：系指一群在37度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。 淀粉水解试验：某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 糖酵解试验：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。甲基红（Methyl Red）试验：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至以下，使甲基红指示剂变红。 靛基质（Imdole）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。尿素酶（Urease）试验：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。氧化酶（Oxidase）试验：氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验：试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。选择培养基:在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。鉴别培养基: 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。 无菌技术:指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。 粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。玻片凝集法：是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。试管凝集法：是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。 沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。大肠菌群MPN：大肠菌群MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。 大肠菌群值：大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。内源性污染：凡由动物体在生活过程中，由于本身带染的微生物而造成食品的污染者，称为内源性污染，也称第一次污染．食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程．
微生物实验室岗位职责 实验室主任职责 1.负责本科室的业务和行政管理工作。 2.制定本科室各类业务工作计划，组织实施，协调完成各项检测任务，提 高检验人员的技术水平，拓展业务。 3.负责安排与监督指导科室检测工作，复核检测报告，监督检测资料整理 归档。 4.监督执行各项规章制度的实施，对本检验室进行考核。 5.完成领导下达的工作任务。 安全监督员职责 1.严格按照SOP文件做好检验人员的个人安全防护监督及人员健康监测， 保证检验人员在工作期间无生物安全事故发生。 2.管理所有个人防护装备及救护用品。 3.定期进行实验室安全巡查，对实验室生物安全、水、电、气、消防及防 盗安全进行检查并做好巡查记录，及时提出纠正意见并监督实施。 质量监督员职责 1.监督质量体系的运行情况，发现问题及时向检测人员汇报，做好书面记 录，提出纠正要求并进行跟踪验证。 2.监督本实验室检验方法、规程和操作规范的有效性和正确使用。定期检 查环境条件、仪器设备、质控图等记录是否符合要求。当质量监督员发
现检测人员使用了不正确标准，操作不当，环境条件不符合时，有权暂停检测工作，并要求有关人员进行纠正。 检验员职责 1.按SOP文件开展检测工作，如实填写检验原始记录，正确报告，按时完 成检测任务，保证检测数据诚实准确。 2.积极参加人员业务培训，不断提高技术水平。 3.当检测设备、环境条件等不符合要求时，有权暂时不进行检测活动。 设备管理员职责 1.负责职责范围内所有使用仪器设备的保管和日常维护，熟习其性能及操 作规范。 2.负责仪器购置申请、建立档案、维护记录、定期检查和报废申请工作， 做好使用、维护及报废记录。 试剂耗材管理员职责 1.做好试剂耗材的申购、验收、保管、分发、登记工作。 2.做好各种耗材的入库登记和使用情况记录。 3.对各类耗材应科学分类科学管理，建立电子档案，便于查找，努力为检 验人员做好服务工作。 样品接收员职责 1、负责检查待接受样品包装是否完整，样本数量、质量是否符合检验要求。 2、负责核实样品送检单的内容。 3、负责做好接收登记，并标记本实验室统一编号放置待检。 样品保管员职责
食品微生物检验的内容及检测技术 食品安全检验过程的主要内容 食品微生物的检验。食物在生产过程中以及放置过程中会受到环境中微生物的损坏或影响，在部分研究中，将食品中细菌数量对食品的损坏程度作为食品安全检测的首 要内容。在食品微生物的检验过程中，我们主要对人体有害微生物进行检验，其中在食品安全检验过程中，因为食品中有多种微生物共存现象，所以在检验前，微生物检验员要把不同的菌体进行分离，这样才能更加清楚的了解各种微生物的数量及菌体的分布情况，包括生产型食品微生物，如醋酸杆菌，酵母菌等和使食物变质的微生物，如霉菌、细菌等和食源性病原微生物如溶血性大肠杆菌，肉毒杆菌等。对食品原辅料微生物的控制和产成品微生物的检验是保证食品安 全的重要途径。 针对食品致病菌的相关检验。不同的致病菌会对人们的身体健康有不同程度的危害，像我们在生活中经常吃到的大米，有些不法商家将发霉的大米加工后再次放入市场进行二次销售，虽然经加工后，在外表上和普通大米没啥两样，但这种大米中含有黄曲霉这一致病菌，据可靠信息表明，黄曲霉的危害性十分巨大，如果人们长时间吃这样的大米，出
现癌症的风险要比常人高出很多倍，由此可见，食品中致病菌的检验是保证我们能吃到放心食品十分关键的微生物检 测技术，所以我们在致病菌的检验上对不同种类的致病菌进行定量严格检验。如乳制品和肉制品的致病菌主要是黄曲霉菌和大肠杆菌，而蛋制品中则容易出现染沙门菌、大肠菌群、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，罐头食品容易出现肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌。 食品微生物检验中的主要特点 对食品检测要求相对较高。在食品微生物的一系列检验中，由于食品中涉及的微生物种类较多，因此加大了食品微生物检验的难度。国家标准或行业标准对不同食品中微生物的含量特别是致病菌的含量有明确的要求。在食品的运输过程中，食品致病菌以及其他微生物对相应的食品有一定的污染，随着微生物种类的增多，检测人员需要对食品受致病菌影响的程度、食品保质期以及其他相关的标准进行测量，难度会随着微生物种类的增多而复杂。所以在微生物检验上我们对每一阶段的食品安全检测都要重视，在各个微生物的测量上，相关的检测技术要求就有所提高。 食品微生物检验效率。随着食品市场的商品流通提高，人们对食品需求不断增加，而食品安全问题却在日益严重，为了保障人们在能够及时满足食品种类和数量要求的同时，进一步促进食品安全的保障措施落实，必须加强食品安
《食品微生物检验技术》期末考试卷 适用班级：考试方式：闭卷 班级学号姓名 一、名词解释： 1.细菌：是一类细胞细而短（细胞直径约0.5μm，长度约0.5～5μm）、结构简单、细胞壁坚韧、以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物。 2.菌落：固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团，这就是菌落（colony）。 3.放线菌：是一类呈菌丝状生长、主要以孢子繁殖和陆生性强的原核生物。 4.菌丝体：许多分枝菌丝相互交织在一起构成菌丝体。 5.生长因子：通常是指那些微生物生长所必需而且需要量很小的，但微生物自身不能合成的，必须在培养基中加入的有机营养物。 6.培养基：根据微生物对营养物质的需要，经过人工配制的适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质称为培养基。 7.消毒：是指利用某些理化方法杀死物体表面或内部所有对人体或动植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施。 8.菌株：又称品系（在病毒中则称毒株或株），表示任何由一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯种群体及其一切后代。 9.诱变育种：是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，再从中筛选出少数符合育种目的的突变株。 10.干酪：是在乳中（也可用脱脂奶油或稀奶油）加入适量的乳酸菌发酵剂和凝乳酶，使蛋白质（主要是酪蛋白）凝固后，排除乳清，将凝块压成块状而制成的产品。
11.食品腐败变质：是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价值的过程 12.发酵乳制品：是指良好的原料乳经过杀菌作用接种特定的微生物（主要是乳酸菌）进行发酵，产生具有特殊风味的食品，称为发酵乳制品。 13.栅栏技术：已知的防腐方法根据其防腐原理归结为高温处理，低温冷藏或冻结，降低水分活性，酸化，降低氧化还原值和添加防腐剂等几种，即可归结为少数几个因子。把这些起控制作用的因子，称作栅栏因子。栅栏因子共同防腐作用的内在统一，称作栅栏技术。 14.食物中毒：是指人体因食用了含有害微生物、微生物毒素或化学性有害物质的食物而出现的非传染性的中毒。 15.双歧因子：一种能促进双歧杆菌生长，不被人体吸收利用的天然或人工合成的物质。 二、填空题： 1.原核微生物中常见的类群有细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、螺旋体、衣原体、立克次体等。 2.肽聚糖是原核微生物细胞壁所特有的成分，是由N- 乙酰葡萄糖胺（NAG）、N- 乙酰胞壁酸（NAM）和短肽聚合而成的网状结构的大分子化合物。 3.放线菌的菌丝由于形态与功能不同分成三类：基内菌丝、气生菌丝、孢子丝。 4.在自然界中霉菌主要是形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖，无性孢子有孢子囊孢子、分生孢子、节孢子、厚垣孢子和芽孢子。有性孢子常见的有卵孢子、接合孢子、子囊孢子和担孢子。 5.微生物生长所需的营养物质应该包含组成细胞的各种化学元素。营养物质按照它们在机体中的生理作用不同，可分成碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水六大类。 6.配制培养基的基本原则：根据不同微生物对营养的要求、根据营养物质的浓度及配比、适当的pH 、培养基中原料的选择。 7.高压蒸汽灭菌法一般采用0.1 MPa 的压力、121摄氏度处理20min。 8.目前根据发酵乳制品的生产过程、发酵剂的种类、产品的特征及其他特性的不同大致
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人
申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
检验科微生物室工作制度 1、临床细菌室守则：临床细菌室是进行细菌学实验的场所，在此完成标本接种、孵育、分离、细菌鉴定和药敏试验等工作。细菌室必须符合以下条件： 1.1细菌室必须安装严密的门窗，以防外部污浊气体和昆虫进入室内污染环境。室内禁用电扇，以避免加速气体流动，造成细菌播散。 1.2菌室必须装有供空气消毒的紫外线灯，置于离操作台面1m的高度，每天开始工作前照射20min。对紫外线灯的消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。 1.3室内备有工作人员洗手使用的肥皂和自来水源。此水源不可与处理标本相关的水源共用，须设置消毒剂水盆，供操作后浸手用。 1.4室内必须常备消毒剂，如来苏或过氧乙酸，一旦发生菌液溅落试验台或地面，应能立即进行消毒处理。 1.5室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少每周用消毒剂擦洗1次。 1.6室内对接收的标本和消毒过的器具，要分别指定地点放置，特别是对无菌和有菌器具要明显分开。用过的试管、平皿必须及时高压灭菌处理。 1.7不能或不便高压灭菌的标本和废弃物品须焚化处理。 1.8细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。 1.9设置必要的消防设备。 2、无菌室守则：对无菌实验室以及在其中操作的要求如下： 2.1无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。无菌室与外界可开一拉门小窗，供传递器具用。 2.2在无菌室中仅限于分装无菌的培养基等操作，不进行有菌标本的分离及其它操作。 2.3用前应以紫外灯消毒30min，定期用乳酸蒸熏，彻底消毒。 2.4工作人员进入无菌室前应换专用鞋、专用衣。在无菌室内进行无菌操作时，应戴口罩，口罩每次用后消毒。 2.5无菌室应仅限操作人员进入，操作时应严格关门，其他人员可在室外观看或经拉门小窗进行协助。 2.6条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。超净工作台应选择垂直气流通风方式。 2.7无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。 对临床细菌检验人员的要求： 2.8负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。 2.9一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。 2.10通晓细菌室守则，并严格遵守。 2.11负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。
食品微生物检验方法（FDA与ISO对比） 内容提要： ●菌落总数检测 ●大肠菌群及大肠杆菌检测 ●金黄色葡萄球菌检测 ●沙门氏菌检测 ●单核细胞增生李斯特氏菌检测 菌落总数测定——菌落总数的概念 ●菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。 菌落总数测定——卫生学意义 ●判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。 ●及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。 ●通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。 FDA BAM 菌落总数测定流程 检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液） 适当十倍稀释样品 选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内 （每个稀释度做两个平行） 每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA） 35 ℃48 ±2h 菌落计数 FDA BAM 菌落计数方法 ●选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d ●所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。EAPC：estimated aerobic plate count ●所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。 ●所有平板的菌落数都超过100/cm2，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml （g）为＞65*100* 1/d。 ●无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。 ●最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
微生物限度检查方法（平皿法） 验证方案 目录 一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 2．验证方法步骤 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.2验证试验操作 3.3试验结果 4．验证结果评价分析
5．附件 微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 1验证方案的起草
2．验证方案的审核与批准 验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的 为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理 通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2．验证方法步骤 2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。 2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、
检验科微生物个人总结三篇 篇一： 20**年满载着累累硕果即将过去，在这一年里，在深入实践科学发展观下，医院创建“平安医院”，带动科室规范有序发展下，认真落实工作任务，强化和提升医疗质量，紧紧围绕科室的中心工作，开拓创新、团结协作、奋力拼搏，全面完成了今年的工作任务。 一、解放思想，更新观念，与时俱进，开拓创新 在过去的一年里，认真学习中国共产党xx大会议精神，深刻领会“三个代表”的思想精髓，深入实践科学发展观，围绕创建“平安医院”，发扬“万众一心，众志成城，不畏艰险，百折不挠，以人为本，尊重科学”的抗震救灾精神，并向参加抗震救灾的医务工作者学习，提高思想觉悟，改进工作作风，积累经验。通过不断的学习，我的工作热情和主人翁责任感进一步增强，思想政治觉悟和理论水平也有了明显提高，这对我的工作实践也提供了有益的指导和帮助。 二、恪尽职守，认真做好本职工作 工作严谨负责，勤勤恳恳，任劳任怨，积极配合领导的工作，不计较个人得失，加班加点按质按量完成任务。始终坚持以病人为中心的服务思想，急病人之所急，得到病人的好评。医。学教育网搜集整理严格遵守危急值报告制度，能及时通知临床医师或者病人，为病人的诊治争取时间。在完成临床检验工作的同时，还承担一部分本科室实习生的实习带教工作，坚持以理论联系实际，做到学以致用，得到学生的好评。 三、严于律已，努力提高业务水平 在作风上，严于律已，遵守医院各项规章制度，遵纪守法，团结同志，始终保持严谨认真的工作态度、一丝不苟的工作作风，勤勤恳恳，兢兢业业，受到上级领导和同事的好评。端正态度，积极参加本学科的各种学习讲座、网上继续教育等，学习最新知识、新进展。团结群众，团结同事，共同学习研究本学科疑难问题，并取得很大进步。
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释：
任县医院检验科微生物实验室菌种、毒株管理规定与 流程 1．目的 对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。 2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员 适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理； 菌种、毒种专职管理人员：宋素玲乔伟涛 3．职责 3．1微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。 3．2科室指定宋素玲乔伟涛2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。 3．3科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。 3．4技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。 4．工作程序 4．1报送及入库 4．1．1当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预
防控制中心。 4．1．2新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须宋素玲乔伟涛2人参加。 4．1．3一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库 4．1．4个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理 4．1．5菌、毒种入库时，宋素玲乔伟涛2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。 4．2日常管理 4．2．1保管人员由宋素玲乔伟涛2名检验人员组成。4．2．2菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》 4．2．3严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。 4．2．4菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。 4．2．5菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。 4．2．6菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时
食品微生物之檢驗方法－肉毒桿菌之檢驗 101年5月16日署授食字第1011901882號公告第一部份：肉毒桿菌及其毒素之檢驗 1. 適用範圍：本方法適用於食品中肉毒桿菌及其毒素之檢驗。 2. 實驗室生物安全措施： 2.1. 生物危害標幟應懸掛於實驗室入口處，並管制人員進入，以及將該實驗區之人數維持至最低需求。 2.2. 備有治療用肉毒桿菌抗毒素之醫療院所緊急連絡電話號碼應張貼在明顯處。 2.3. 實驗操作應在生物安全操作櫃進行。 2.4. 應有洗眼用噴水器及腳踏或自動式洗手設備。 2.5. 絕不可以用口吸取任何檢體，應以機械式吸管輔助器操作。 2.6. 工作前、後應以1%次氯酸溶液擦拭工作檯。 2.7. 實驗後，工作人員應將所使用過之器材及廢棄物，立即滅菌處理。 3. 檢驗方法：檢體經前處理後，經增菌，續以選擇性培養基培養，配合肉毒桿菌毒素檢測與型別鑑定之方法。 3.1. 工作環境：工作平檯須寬敞、潔淨、光線良好，操作平檯光度為100呎燭光以上，密閉室內換氣良好，儘可能沒有灰塵 及流動空氣。每15分鐘落菌數不得超過15 CFU／培養皿。 3.2. 器具及材料： 3.2.1. 生物安全操作櫃（Biological safety cabinet, BSC）：第二等級（class II）（含）以上者。 3.2.2. 高壓滅菌釜。 3.2.3. 乾熱滅菌器。 3.2. 4. 冰箱：能維持5 ± 3℃者。 3.2.5. 培養箱：能維持內部溫度溫差± 1℃以內者。 3.2.6. 天平：可稱量到2000 g 者，靈敏度為0.1 g ；可稱量到120 g 者，靈敏度為5 mg。 3.2.7. 旋渦混合器（Vortex mixer）。 3.2.8. 加熱板（Hot plate）。
一、定义 通过一定的实验方法测定食品中的微生物，特别是致病微生物的数量、种类、性质，从而判断食品的卫生质量，保证消费者的身体健康。 二、食品微生物检验的内容 卫生指标菌检验 菌落总数测定 细菌检验 大肠菌群数测定 致病菌检验 霉菌、酵母菌数测定 真菌检验 产毒霉菌检验 霉菌毒素测定 三、食品微生物检验的特点 1、具有法规性 2、检验的范围广 3、杂菌含量多，要检验的菌少。 （1）需要增菌（2）抑制杂菌 4、检验结果具有数量界限 5、需要采样后尽快检验，快出结果 四、意义： 检出有害微生物，避免食物中毒，避免造成经济损失。 五、食品卫生细菌常规检验项目 卫生指标菌 菌落总数测定 大肠菌群测定 沙门氏菌检验 u 致病菌 志贺氏菌检验 金黄色葡萄球菌检验 溶血性链球菌检验 六、细菌污染食品的途径 1、食品加工原料的污染 2、产、储、运、销过程中的细菌污染 3、从业人员的污染 4、食品加工过程中的污染 第一章 食品微生物检验中的生理生化实验 设计生化实验的原则：在实验中加入某些化学物质，使细菌代谢途径中分解代谢产物与加入<的化学物质发生反应，产生某些变化或出现某种特征。 一、过氧化氢酶及过氧化物酶实验原理 1、2H 2O 2 过氧化氢酶 2H 2O+O 2 阳性 2、过氧化物酶： RH 2+H 2O 2 过氧化物酶 R+2H 2O 阳性：细菌变为黑褐色； 阴性： 不变色。 阳性 阴性 二、细胞色素氧化酶实验原理 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + --奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无变化。 三、氰化钾实验 阳性： 不抑菌，变混浊 阴性：抑菌 无 蓝 四、硝酸盐还原实验原理 KNO 3 还原酶 KNO 2KNO 2 +对氨基苯磺酸+ a -萘胺 红色化合物（立刻或数分钟内）红色 无色 五、糖发酵实验 分解糖产酸，PH 值下降，使 培养基的 酸碱指示剂发生变化。 阳性：产酸产气 六、氧化发酵实验（O/F 实验 有些微生物分解葡萄糖 必须有氧参加，此种细菌菌称为氧化型； 阳 阴 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。 灭菌琼脂（厌氧） 七、甲基红实验（MR 实验）和V-P 实验 1、MR 实验原理：一些细菌分解葡萄糖产 生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基的PH 值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应 2、V-P 实验原理 一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。（实验结果同MR 实验） 阴 八 、柠檬酸盐实验（枸橼酸盐实验） 一些微生物可以以铵盐作为唯一 的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳 源，在柠檬酸盐培养基上生长，分 解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基 变成碱性，酸碱指示剂变色 九、丙二酸钠实验 一些微生物可以以丙二酸钠 作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。 十、马尿酸盐实验 一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色的苯甲酸盐沉淀。 十一、明胶液化实验 一些细菌可产生胞外酶，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶的凝固能力。 十二、苯丙氨酸脱氨酶实验 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶， 可以脱氨 生成苯丙酮酸， 其与FeCl 3反应产生绿色 。 十三、氨基酸脱羧酶实验 一些细菌可以产生氨基酸 脱羧酶使氨基酸脱酸，产生胺类物质，使培养基
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将