（二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算 1、根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质把溴酚蓝迁移的距离定为d1，迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。的长度，D2定为凝胶染色后的长度。 2、根据公式：Rm ＝d2d1×D1D2计算各根据公式：Rm＝d2d1×D1D2计算各种蛋白质的迁移率。
3、以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对以标准蛋白质的迁移率为横座标，应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移可得到一条直线，率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。在半对数座标图上查出其对应的分子量。
4、实验需多次重复。实验需多次重复。
常见问题及分析 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH 环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1) 还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构 象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2) 带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3) 非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min， 未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED 与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
聚丙烯酰胺 1、定义 丙烯酰胺聚合物是丙烯酰胺的均聚物及其共聚物的统称。工业上凡是含有50%以上的丙烯酰胺（AM）单体结构单元的聚合物，都泛称聚丙烯酰胺。其他单体结构单元含量不足5%的通常都视为聚丙烯酰胺的均聚物。 聚丙烯酰胺，polyacrylamide（PAM），CAS RN：[9003-05-8]，结构式为： n是聚合度。n的范围很宽，数量级为102~105，相应的相对分子质量由几千到上千万。 分子量是PAM的最重要参数。按其值得大小有低分子量（<100×104）、中等分子量（100×104~1000×104）、高分子量（1000×104~1500×104）和超高分子量（>1700×104）四种。不同分子量范围的PAM有不同的使用性质和用途。 2、分类 聚丙烯酰胺按在水溶液中的电离性可分为非离子型、阴离子型、阳离子型、两性型。 非离子型聚丙烯酰胺（NPAM）的分子链上不带可电离基团，在水中不电离；阴离子型聚丙烯酰胺（APAM）的分子链上带有可电离的负电荷基团，在水中可电离成聚阴离子和小的阳离子；阳离子型聚丙烯酰胺（CPAM）的分子链上带有可电离的正电荷基团，在水中可电离成聚阳离子和小的阴离子；两性的聚丙烯酰胺（AmPAM或ZPAM）的分子链上则同时带有可电离的负电荷基团和正电荷基团，在水中能电离成聚阴离子和聚阳离子，ZPAM的电性依溶液体系的PH值和何种类型的电荷基团多寡而定。 PAM的电性称谓和所带的电荷基团解离后的电性称谓相同。 按照聚合物分子链的几何形状可把PAM分为线型、支化型和交联型。PAM分子链的形状一般是线型结构。但是在丙烯酰胺自由基聚合反应的过程中会发生链转移反应。
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量 一、前言 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。 浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。 此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。 聚丙烯酰胺凝胶电泳作用原理 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式:
【跑电泳的步骤】 1、取出电泳仪器和四个烧杯； 2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口； 3、配制过硫酸铵溶液（AP）：0.1gAP+0.9g超纯水，保鲜膜封口； 4、取出所有药品。Tris-HCL(88,6.8)，TEMED，SDS，Acry-bis，按次序排好； 5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪3只； 6、先配分离胶 7、组装凝胶模具，插好板 （1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里； （2）板：Bio-Rad前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。 8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂； 9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）； 10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干； 11、配浓缩胶； 12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我； 13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（1h），等待。），样品煮沸3分钟； 14、用10uL移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内； 15、电压（浓缩胶）90V，电流20mV； 16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。 【附配方】 分离胶separating gel (5mL) ( 1个板3.5mL)1板2板
Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL 1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL 30%Acry/bis 2 mL 1.7 mL 1. 3 mL 1.19mL 1.38 mL 单体胶（29.2g+0.8g/100mL） 10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL 10%AP50uL50uL50uL35uL70uL 7uL(夏)~8 TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL uL 浓缩胶Stacking gel ( 2板3mL) Prescription Volume(2 mL)(2 mL) Del H2O 1.4mL 2.1mL 0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL 30%单体胶330uL495uL 10%SDS20uL30uL 10%AP20uL30uL TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL冬，5 uL夏) 【附所需试剂配制】 1、30%单体胶（30%单体胶即30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g；(100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g) 超纯水定容至50mL，0.45 uM膜过滤，4℃保存（一个月）；说明：单体浓度%T是指单体总质量（丙烯酰胺+双丙烯酰胺）在
常见蛋白质分子量参考值（单位：dalton） 蛋白质分子量 肌球蛋白[myosin] 甲状腺球蛋白[thyroglobulin] β-半乳糖苷酶[β-galactosidase] 副肌球蛋白[paramyosin] 磷酸化酶a[phosphorylase a] 血清白蛋白[serum albumin] L-氨基酸氧化酶[L-amino acid oxidase] 地氧化氢酶[catalase] 丙酮酸激活酶[pyruvate kinase] 谷氨酸脱氢酶[glutamate dehydrogenase] 亮氨酸氨肽酶[glutamae dehydrogenase] γ-球蛋白，H链[γ-globulin, H chain] 延胡索酸酶（反丁烯二酸酶）[fumarase] 卵白蛋白[ovalbumin] 醇脱氢酶（肝）[alcohol dehydrogenase (liver)]烯醇酶[enolase] 醛缩酶[aldolase] 肌酸激酶[creatine kinase]220,000 165,000 130,000 100,000 94,000 68,000 63,000 60,000 57,000 53,000 53,000 50,000 49,000 43,000 41,000 41,000 40,000 40,000
胃蛋白酶原[pepsinogen] D-氨基酸氧化酶[D-amino acid oxidase] 醇脱氢酶（酵母）[alcohol dehydrogenase (yeast)] 甘油醛磷酸脱氢酶[dlyceraldehyde phosphate dehydrogenase] 原肌球蛋白[tropomyosin] 乳酸脱氢酶[lactate dehydrgenase] 胃蛋白酶[pepsin] 转磷酸核糖基酶[phosphoribosyl transferase] 天冬氨酸氨甲酰转移酶，C链[aspertate transcarbamylase, C chain] 羧肽酶A[carboxypeptidase A] 碳酸酐酶[carbonic anhydrase] 枯草杆菌蛋白酶[subtilisin] γ-球蛋白，L链γ-blobulin,L chain[] 糜蛋白酶原（胰凝乳蛋白酶原）[chymotrypsinogen 胰蛋白酶[trypsin] 木瓜蛋白酶（羧甲基）[papain (carboxymethyl)] β-乳球蛋白[β-lactoglobulin] 烟草花叶病毒外壳蛋白（TWV外壳蛋白）[TWV coat protein 肌红蛋白[myoglobin] 天门冬氨酸氨甲酰转移酶，R链[aspartate transcarbamylase, R chain] 血红蛋白[h(a)emoglobin]40,000 37,000 37,000 36,000 36,000 36,000 35,000 35,000 34,000 34,000 29,000 27,600 23,500 25,700 23,300 23,000 18,400 17,500 17,200 17,000
论述一、二、三、四级蛋白质结构及其检测方法？ 蛋白质定义：由一条或多条多肽链以特殊方式结合而成的生物大分子，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 一、蛋白质一级结构： （一）定义：蛋白质的一级结构又称为共价结构或化学结构，它是指蛋白质中的氨基酸按照特定的排列顺序通过肽键连接起来的多肽链结构。氨基酸残基主要通过肽键连接，有些蛋白质中含有二硫键。 （二）检测方法： 二硝基氟苯（DNFB）法、丹磺酰氯法、氨肽酶法、C-末端氨基酸测定（肼解法、还原法、羧肽酶法） 二、蛋白质二级结构： （一）定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主要的化学键为氢键。 （二）检测方法： 构象的研究方法：X射线衍射法、核磁共振光谱法、圆二色谱CD、紫外-可见差光谱、荧光探针法、激光拉曼光谱法、红外光谱法、关联规则与遗传算法。 三、蛋白质三级结构： （一）定义：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键：疏水键、离子键、二硫键、氢键和配位键稳定维系三级结构的作用。 （二）检测方法： 同源建模（比较建模SWISS-MODEL）法、穿针引线方法（折叠识别方法）、从头预测法、最速下降法、牛顿法、共轭梯度法、遗传算法、分解-结合法、离散化方法、分子动力学法、混合预测方法、粒子群优化算法(PSO)。 四、蛋白质四级结构： （一）定义：有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基。蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。 （二）检测方法： 线性降维法：Swiss-Prot数据库中抽取数据集进行四级结构预测。 Quat-PRE方法：综合运用mRMR方法和SVM的wrapper方法进行四级结构预测。 最近邻居算法：从蛋白质一级序列出发，利用蛋白质序列氨基酸组成、二肽组成以及混合组成方法对蛋白质单聚体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和八聚体进行分类研究。
聚丙烯酰胺特性黏度的测定及分子量计算 根据中国国家标准GB12005.聚丙烯酰胺的分子量用特性黏度法测定；水解度用中和法测定；残余单体的含量大于0.01%吋用气相或液相色谱法测定.大于0.5%时用溴化法测定。 (1)特性黏度的测定及分子量计算 ①测定原理：按规定条件制备浓度为0.0005-0.OOlg/mL的试样溶液，该溶液以氯化钠溶液为溶.c(NaCl)=1.00mol/L。用气承液柱式乌式毛细管黏度计分别测定溶液和溶剂的流经时间.根据测得值计算特性黏度。本方法适用于不同聚合方法制备的粉状和胶状非离子型聚丙烯酰胺和阴离子型聚内烯酰胺。 ②仪器 a、玻璃毛细管黏度计：采用GB1632规定的稀释型乌氏毛细管黏度计，如图4.73所示，阳离子聚丙烯酰胺
技术要求如下： i、应使浓度为lmol/L的氯化钠水溶液在30°下的流经时间在 100-130s范围内； ii、型号为4-0.55和4-0.57，其中4表示定量球6的容积（单位mL).0.55和0.57表示毛细管内径（单位mm)。 b、恒温水浴：控温精度士0.05°C。 c、秒表：分度值0.Is。 d、分析天平:感量0.OOOlg。 e、容量瓶：容积25mL、50mL、100mL、200mL。阳离子聚丙烯酰胺厂家 f、移液管：容积5mL、10mL、50mL? g、具塞锥形瓶：容积250mL。 h、玻璃砂芯漏斗：G-2型。 i、烧杯：容积lOOmL。
j、量筒：容积50mL。 k、注射器、乳胶管洗耳球等。 ③试剂和溶液:本分析方法所用的试剂和水，均为分析纯试剂和蒸馏水。 a、氯化钠溶液：将氣化钠用蒸馏水配制成c(NaCl)=l.OOmol/L和 c(NaCl)=2.OOmol/L的溶液。 b、铬酸洗液。阳离子聚丙烯酰胺厂家 ④试样溶液的配制 a、粉状聚丙烯酰胺：在lOOmL容量瓶中称人0.05-0.lg均匀的粉状试样，准确至0.OOOlg。加人约48mL的蒸馏水，经常摇动容量瓶。待试样溶解后，用移液管准确加人50mL浓度2.00mol/L的氯化钠溶液，放在（30±0.05)°C水浴中。恒温后，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用于燥的玻璃砂芯漏斗过滤，即得试样浓度约 0.0005-0.001g/mL 且氯化钠浓度为l.OOmol/L的试样溶液，放在恒温水浴中备用。 b、胶状聚丙烯酰胺：在已准确称量的lOOmL烧杯中，称人固含量为8%-30%的胶状试样0.66-1.25g.精确至0. OOOlg。加入50mL蒸馏水.搅拌溶解后，转移入200mL容量瓶中。加人lOOmL浓度为2.00mol/L 的氯化钠溶液.放在恒温水浴中。恒温后，用蒸馏水稀释至刻度.摇匀，用千燥的玻璃砂芯漏斗过滤，即得试样浓度约为0. 0005-0.001g/mL,且氯化钠浓度1.00mol/L的试样溶液，放在恒温水浴中备用。阳离子聚丙烯酰胺厂家
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实 验原理和操作步骤 实验原理： SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，
加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH 6.7，定容至100ml，4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作
PAM申华原料规格： 申华化学工业有限公司 原料规格表M40-RAD-01 RAW MATERIAL SPECIFICATION 1、原料名称（Material） 原料编号（Code No.）M-4030 版别：1.0 原料名称（Material）聚丙烯酰胺(部分水解)〖Polyacrylamide (PAM)〗 2、规格项目（Specifications） 规格项目（Specifications）指标（Limits）测试方法（Test Method） Appearance White Grain Total Solid / % ≥90 Solubilization Speed / hr ≤1.5 Anion Content / % 20-30 即水解度 Free Monomer / % ≤0.05 3、分子式（Formula） ?[?CH2?CH?]m?[?CH2?CH?]n? ∣∣ C＝O C＝O ∣∣ NH2O Na 4、分子量（Molecular Weight）：3000,000-13000,000 聚丙烯酰胺(cpolyacrylamids)简称PAM，是一种线型高分子聚合物，是水溶性高分子化合物中应用最为广泛的品种之一，聚丙烯酰胺和它的衍生物可以用作有效的絮凝剂，增稠剂，纸张增强剂，以及液体的减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、煤矿、矿冶、地质、轻纺，建筑等工业部门。 一、市售产品规格及主要技术指标 技术指标名称PAM 阴离子PAM 非离子PAM 阳离子PAM 复合离子 外观白色或微黄色粉末 粒径，mm < 2 固含量(%) ≥ 88 溶速(mim) ≤ 1.5 不溶物(%) ≤ 2 分子量(万) 500-2400 300-600 300-800 800-1500 水解度(%) 13-30 5-15 离子度5-50 10-20 注：根据用户要求，分子量控制在表格所定指标的范围内根据市场价格面议 加强混凝作用 ⑴聚合氯化铝（PAC）聚合氯化铝又名碱式氯化铝或羟基氯化铝。它是以铝灰或含铝矿物作为原料，采用酸溶或碱溶法加工制成。其分子式为[Al2(OH)nCl6-n]m ，其中m为聚合度，单体为铝的羟基配合物Al2(OH)nCl6-n ，通常n=1~5，m≤10。聚合氯化铝溶于水后，即
蛋白质相对分子质量的测定 (SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法) 一、实验原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。 聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。 二、仪器及器材 垂直电泳槽及附件、直流稳压稳流电泳仪、移液器等。 三、试剂 1、凝胶贮备液：称取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-双丙烯酰胺（Bis），蒸馏水溶解后定容至100mL，滤纸过滤贮存。 2、10% SDS：称取SDS 10g 加蒸馏水至100ml。 3、10%过硫酸胺（AP），用时现配。 4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。 5、电极缓冲液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.3，加蒸馏水至1 000ml。 6、样品溶解（缓冲）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混匀后用HCL调节pH至8.0，再加0.1g溴酚蓝、2.5mL巯基乙醇，定容至100mL。 7、下层胶（分离胶）缓冲液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至8.8，加蒸馏水至100ml。 8、上层胶（浓缩胶）缓冲液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混匀后用1mol/L HCL 调节pH至6.8，加蒸馏水至100ml。 9、固定液：25%异丙醇，10%乙酸。 10、染色液：0.125g考马斯亮蓝R-250加固定液250ml。 11、脱色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 实验报告
一、实验目的 1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理； 2.掌握垂直板电泳的操作方法。 二、实验原理 1、电泳： (1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 (2)影响电泳效果的因素： ①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快； ②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快； ③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快； ④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快； ⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。 2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） (1)定义 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。 SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠） (2)SDS的作用 SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。 由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小 (3) SDS-PAGE分类： ?SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类： 连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 (4)聚丙烯胺凝胶的生成： 聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。 引发产生自由基的方法有两种：
实验六报告： SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量 1.研究背景及目的 根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。 1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1] 。 通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成 带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅 使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率 主要取于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。 2.原理 由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带 来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电 荷量约为蛋白质本身静电荷 10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子量 一、实验目的： 1、了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。 2、学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。 二、实验原理： SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。 2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS 是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 三、仪器、原料和试剂 1、仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。 2、原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 3、试剂： （1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 （2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。 （3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g 及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。 （4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。 （5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。（6）1%TEMED； （7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。
阴离子聚丙烯酰胺（PAMA）根据不同用途和用户对产品性能的要求可选用不同分子量使用，可用作：1、工业废水处理；2、饮用水处理；3、淀粉厂及酒精厂的流失淀粉及洒槽的回收；4、三次采油的驱油剂；5、调剖堵水剂；6、造纸助剂阳离子聚丙烯酰胺（PAMC）是由乙烯基阳离子单体和丙烯酰胺共聚而成，是一种线型高分子聚合物，可用于：1、污泥脱水；2、生活污水和有机废水的处理；3、自来水厂的高效絮凝剂；4、造纸增强剂；5、油田化学助剂 非离子聚丙烯酰胺（PAMN）是由丙烯酰胺均聚而成，纯度高，离子化成度低，性能好，用途广。可用作：1、各种改性聚丙烯酰胺的基础原料；2、纺织工业助剂； 3、污水处理剂； 4、堤坝、地基、隧道等堵水的化学灌浆剂； 5、固沙剂； 6、土壤改良剂； 7、油田调剖堵水剂； 8、建筑业、建筑胶水，内墙涂料等方面。 两性离子聚丙烯酰胺（PAMCA）是由乙烯酰胺和乙烯基阳离子单体丙烯酰胺单 体水解共聚而成、经红外光谱分析，该产品链结上不但有丙烯酰胺水解后的“羧基阴电荷，而且还有乙烯基阳电荷。”因此，构成了分子链上既有阳电荷，又有阴电荷的两性离子不规则聚合物。可用作：1、调剖堵水剂；2、最新型水处理剂；3、污泥脱水剂；4、造纸化学助剂
聚丙烯酰胺简称PAM，亦称三号凝聚剂，分子式为，是线状水溶性高分子聚合物，分子量在 300-1800万之间，外观为白色粉末状或无色粘稠胶体状，无臭、中性、溶于水，温度超过120℃时易分解。 聚丙烯酰胺分子中具有阳性基因（－CONH2)，能于分散于溶液中的悬浮粒子吸咐和架桥，有着极强的絮凝作用，因此广泛用于水处理及电力、采矿、选煤、石棉制品、石油化工、造纸、纺织、制糖、医药、环保等。 名称分子量(万) 离子度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 阳离子聚丙烯酰胺 CPAM 300-1200 10-50 1-14 ≥90 0.05 白色干粉 名称分子量(万) 水解度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 阴离子聚丙烯酰胺 APAM 300-1800 10-50 7-14 ≥90 0.05-0.15 白色颗粒粉末 名称分子量(万) 离子度(%) 高效PH 固含量% 残单% 外观 非离子聚丙烯酰胺 NPAM 200-600 ≤3 1-8 ≥90 ≤0.05 白色颗粒粉末 名称分子量(万) 阳离子度% 阴离子度% PH 固含量% 外观 两性离子聚丙烯酰胺 NPAM 1000-6000 5-50 8-25 1-14 ≥90 白色粉末 1．阴离子：结构式〔 CH2 CH 〕n CONH2 非离子：结构式：[—CH—CH2—CH—CH2—]n CONH2 CONH2 阳离子：结构式：[—CH—CH2—CH—CH2]n CONH2 CONHCH2N（CH3）2 2．物理特性；本产品为胶体和粉剂。胶体产品为无色透明、无毒性、无腐蚀。粉剂为白色粒状或细粉末状固体，两者均能溶于水。吸水速度随衍生物离子特性的区别而不同。但几乎不溶于一般溶剂（苯、甲苯、乙醇、乙醚、丙酮、酯类等），仅在乙二醇、甘油、冰醋酸、甲酰胺、乳酸、丙烯酸等溶剂中能溶解1%左右。不同品种，不同分子量的产品有不同的性质。 3．用途：主要用于采油、制糖、洗煤、选矿、造纸、涂料、湿法冶金，纺织、石料切割、化工、农药、医药以及污水处理等等。胶体及粉剂聚丙烯酰胺可根据用户提供的产品质量要求生产含量、分子量、水解度各异的产品。 PAM絮凝剂由于应用范围十分广泛，而各种应用对其所要求的性能各不相同，为满足各类用途的需要，世界各国研制了非常复杂的品种和规格，现已形成了
阴离子聚丙烯酰胺(PAM) 已阅：1897 2010-3-13 聚丙烯酰胺是一种线性的高分子聚合物，分子式为 (CH2CHCONH2）n, 简称PAM.它易溶于水,几乎不溶于苯、酯类和 丙酮等一般的有机溶剂，其水溶液几近透明的粘稠液体，属非危险 品；固体PAM热稳定性好，加热到100℃稳定性良好，但在150℃ 以上时会分解。聚丙烯酰胺及其衍生物可以用作有效的絮凝剂、增 稠剂、纸张增强剂和减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、 煤炭、地质和建筑等行业。 主要优点：絮凝性：PAM能使悬浮物体通过电中和，架桥吸附作用起絮凝作用。粘和性：能通过机械的、物理的、化学的作用起粘和作用。降租性：PAM能有效地降低流体的磨擦阻力，可降租50-60%。增稠性：PAM在中性和酸性条件下有增稠作用。 主要产品：驱油用新型聚丙烯酰胺项目指标 产品用途： 水解度%≤25 驱油剂:在三次采油时,在单一的水驱中加入聚丙烯酰胺能使水增粘,从而增加原油产量,降低含水率,提高驱油效率.固含量%≥89 残留单体含量%≤0.1 不容物含量%≤0.2 滤过比%≤2.0容解时间≤2小时表面粘度≥11.0mpa.s分子量(百万)17-25 . 阴离子聚丙烯酰胺: 本产品为水溶性高分子聚合物。不溶于大多数有机溶剂，具有良好的絮凝性，可以降低液体之间的摩擦阻力。 应用范围: 1、主要用于污泥脱水，降低污泥含水率。 2、可用于工业废水、生活污水的处理。 3、用于造纸工业，可提高纸张的干湿强度，提高细小纤维及填料的保留率。 质量指标：
1、外观：白色细砂状粉末或无色透明胶体。 2、离子度：0～100% 3、分子量：800万～1500万。 使用方法及注意事项: 1、产品配成0.1%浓度的水溶液，以不含盐的中性水为宜。 2、溶解时，将本产品均匀撒入搅拌的水中，适当加温(<60℃)可加速溶解。 3、通过小试，确定本产品的最佳用量。 4、固体产品用聚丙稀编织袋包装，内衬塑料袋，每袋25公斤;胶状体用纤维桶包装，内衬塑料袋，每桶50公斤或200公斤。 5、本产品有吸湿性，要密封存放在阴凉干燥处，温度要低于35℃。 6、固体产品避免撒在地上，以防产品吸潮后使地变滑。 阳离子聚丙烯酰胺(PAM) 已阅：1651 2010-3-11 聚丙烯酰胺是一种线性的高分子聚合物，分子式为 (CH2CHCONH2）n, 简称PAM.它易溶于水,几乎不溶于苯、酯类和 丙酮等一般的有机溶剂，其水溶液几近透明的粘稠液体，属非危险 品；固体PAM热稳定性好，加热到100℃稳定性良好，但在150℃ 以上时会分解。聚丙烯酰胺及其衍生物可以用作有效的絮凝剂、增稠剂、纸张增强剂和减阻剂等，广泛应用于水处理、造纸、石油、煤炭、地质和建筑等行业。 主要优点：絮凝性：PAM能使悬浮物体通过电中和，架桥吸附作用起絮凝作用。粘和性：能通过机械的、物理的、化学的作用起粘和作用。降租性：PAM能有效地降低流体的磨擦阻力，可降租50-60%。增稠性：PAM在中性和酸性条件下有增稠作用。
实验一蛋白质分子量的测定—凝胶层析法 一、原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体
积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi。 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi。 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由g×Wr求得（g为干胶重量，单位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。 如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为Vo 时，出现洗脱峰。 凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那