菌种的分离与鉴定---大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的简单染色及大小测定

鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法引言大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是两种常见的细菌。

它们在形态、生理特征和生长条件上存在一些差异，因此可以通过一系列实验方法来鉴别它们。

本文将介绍鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的常用方法。

1. 形态特征鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在形态上存在一些差异，可以通过以下方法进行鉴别：•观察细胞形状：大肠杆菌呈长圆柱形或椭圆形，而枯草芽孢杆菌呈短圆柱形或长椭圆形。

•观察细胞大小：大肠杆菌通常较小，长度约为2-4微米，直径约为0.5-1微米；而枯草芽孢杆菌较大，长度约为3-5微米，直径约为0.8-1.5微米。

•观察胞外结构：大肠杆菌通常具有鞭毛，而枯草芽孢杆菌不具有鞭毛。

2. 生理特征鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在生理特征上也存在一些差异，可以通过以下方法进行鉴别：•发酵能力：大肠杆菌能够发酵乳糖和葡萄糖，产生酸和气泡，而枯草芽孢杆菌不能发酵乳糖和葡萄糖。

•氧需求：大肠杆菌为厌氧菌，可以在无氧条件下生长；而枯草芽孢杆菌为好氧菌，需要氧气才能生长。

•温度适应性：大肠杆菌通常在37摄氏度下生长最好，而枯草芽孢杆菌在30-40摄氏度范围内都能生长。

3. 生长条件鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌对于不同的生长条件也有一定的差异，可以通过以下方法进行鉴别：•培养基选择：大肠杆菌通常在富含葡萄糖和氨基酸的培养基上生长，例如LB培养基；而枯草芽孢杆菌通常在富含有机物和无机盐的培养基上生长，例如NA培养基。

•pH适应性：大肠杆菌对中性或弱碱性环境更适应，pH范围为6-8；而枯草芽孢杆菌对中性或弱酸性环境更适应，pH范围为5-7。

4. 鉴别实验方法为了更准确地鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，可以通过以下实验方法进行进一步鉴别：4.1 青霉素抗性试验青霉素抗性是大肠杆菌的一个特征，可以通过以下步骤进行测试：1.取一块含有青霉素的抗生素纸片。

2.在含有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的琼脂平板上分别接种一条直径约为3-5毫米的细菌线。

鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法介绍大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是两种常见的细菌，虽然它们在形态上有一些相似之处，但在生物学特性上有很大差异。

正确鉴别这两种细菌对于保障公共卫生和食品安全具有重要意义。

本文将详细介绍鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的方法。

外观观察大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在进一步检测之前可以通过外观观察进行初步鉴别。

大肠杆菌外观观察1.形态：大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌，呈棒状。

2.颜色：培养在富含营养物的琼脂平板上产生的大肠杆菌菌落呈乳白色或浑浊白色。

3.糖发酵：大肠杆菌能够发酵葡萄糖，产生酸，导致琼脂平板颜色变黄。

枯草芽孢杆菌外观观察1.形态：枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，形态较大肠杆菌更为多样，包括短杆状、长杆状和梭形等。

2.颜色：培养在琼脂平板上的枯草芽孢杆菌菌落呈白色或灰白色。

3.胶质囊：枯草芽孢杆菌形成胶质囊，使菌落观察时呈乳白色，菌落平整立体。

生理和生物化学特性除了外观观察之外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在生理和生物化学特性上也有明显差异，这些特性可以用于进一步鉴别。

大肠杆菌特性1.氧需求：大肠杆菌是厌氧菌，无需氧气生长。

2.好气性发酵：大肠杆菌可以利用葡萄糖进行好气性发酵，产生酸和气体，如二氧化碳。

3.非芽孢形成：大肠杆菌不会形成孢子。

枯草芽孢杆菌特性1.氧需求：枯草芽孢杆菌是好气性菌，需氧气生长。

2.好气性发酵：枯草芽孢杆菌可以进行好气性发酵，但不像大肠杆菌那样产生气体。

3.孢子形成：枯草芽孢杆菌能够在逆境下形成芽孢，以保护自己。

生化试验生化试验是一种常用的方法，用于鉴别大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

大肠杆菌的常见生化试验1.非芽孢形成：通过培养在常规琼脂平板上，观察是否形成孢子，大肠杆菌不会形成孢子。

2.外膜酶试验：大肠杆菌产生β-半乳糖苷酶，可通过添加半乳糖苷甲醚酸盐，观察是否产生金黄色沉淀物来进行鉴别。

3.琼脂溶血试验：大肠杆菌可以分泌溶血素，在琼脂平板上添加红细胞进行观察，大肠杆菌使红细胞溶解，形成溶血环。

设计实验分离合鉴别葡萄球菌,大肠杆菌和枯草芽孢
杆菌
实验目的：设计实验分离、合鉴别葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

实验步骤：
1. 准备培养基和试剂：制备具有区别葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的选择性培养基。

常用的选择性培养基有Mannitol Salt Agar（MSA）和MacConkey Agar（MK）。

2. 预处理样品：将待检样品进行合适的预处理，如食品样品进行均质化，水样本进行过滤等。

3. 涂布法分离：将预处理样品取一定量涂布在MSA和MK上，用锯齿刮子靠边均匀涂布。

4. 培养：将涂布的培养基培养于适宜的温度下，葡萄球菌在37℃培养24-48小时，大肠杆菌在37℃培养24-48小时，枯草芽孢杆菌在55-60℃培养24-48小时。

5. 观察结果：观察培养基上的菌落形态、颜色、透明度等特征，并注意特别有区分的特征，如葡萄球菌在MSA上产酸发酵，大肠杆菌在MK上产气发酵。

6. 进一步鉴定：对观察到的菌落进行进一步鉴定，如进行革兰氏染色、相关生化试验以确定菌株种属。

注意事项：
1. 实验过程需严格遵守无菌操作规范，以避免实验结果受到污染。

2. 实验过程需记载详细实验条件，以备后续数据分析和结果论证。

3. 实验结束后，对实验区域进行彻底清洁和消毒，防止细菌扩散传播。

实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。

2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。

3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。

二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。

由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。

美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。

染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。

它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。

革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。

（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。

（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。

（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。

（5）干燥。

（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。

注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。

学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。

观察细菌个体形态与排列，绘图。

3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

实验三细菌的简单染色与形态观察实验三细菌的简单染色与形态观察实验三细菌的简单染色和形态学观察一、目的要求：1.了解并掌握简单细菌染色的机理和技术；2.学会用油镜观察细菌细胞的形态。

2、实验材料：1株：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌aureus等培养好的细菌斜面；2.染料：结晶紫3.其他：显微镜、玻片、接种环、酒精灯、无菌水、雪松油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。

3、基本原则：染色是细菌学上一个重要而基本的操作技术。

因细菌细胞小而且透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及其细胞结构。

用于微生物染色的染料是苯环上带有显色基团和辅助基团的有机化合物。

显色基团决定了化合物的颜色特征，助色基团决定了化合物的成盐性。

染料通常是盐，分为酸性染料和碱性染料。

在微生物染色中，碱性染料更常用，如亚甲基蓝、结晶紫、碱性红、砂黄、孔雀绿等。

简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性和弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料电离后带有正电荷，很容易与菌体结合使细菌着色。

通过本实验，我们可以学习和掌握细菌染色技术，了解细菌细胞的形态，巩固课堂知识，增加感性知识。

四、方法与步骤：（一）制片1.涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从枯草芽孢杆菌从斜面上取少量真菌苔藓，放入水滴中，搅拌均匀，涂膜，涂膜面积约1~1.5cm2。

2.干燥：室温下自然干燥3.固定：手执载玻片一端，使涂菌一面向上，通过火焰2~3次。

此操作也称热固定，其目其主要目的是使细胞质凝固，以固定细胞形状，并使其牢固地附着在载玻片上。

4.染色：将涂片放在水平位置，滴下结晶紫染色液（最好只覆盖涂片），染色1分钟左右。

微生物实验报告实验（一）：环境水样中细菌总数的测定―――1.培养基的制备、消毒与灭菌一、实验目的与要求1.学习掌握培养基的制备原理2.通过制备麦氏培养基，掌握配制培养基的一般方法和步骤3.学会制作试管的斜面培养基二、实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或代谢累积产物；人工配制培养基的目的，在于给微生物创造一个合适的营养条件。

营养基配制的要素：营养---水分、碳源、氮源、生长因子、和无机盐；适宜的酸碱度和一定的缓冲能力；水活度；氧化还原电位。

三、实验材料与方法面垫上石棉网煮沸融化，以免琼脂烧焦，同时在加热过程中要不断搅拌。

琼脂在40摄氏度以下凝固，所以要在琼脂凝固前将培养基装入试管。

分装过程：将配制的培养基装入试管中，其装量不超过管高的1/3，多余的培养基要装入三角烧瓶中，其装量不要超过三角烧瓶的1/2。

分装完成后要贴上标签，注明时间、培养基名称、组别。

四、实验过程1.称量和融化按培养基配方比例依次准确地称取酵母浸膏、葡萄糖、琼脂、醋酸钠、KCl依次放入陶瓷杯中煮沸融化。

酵母浸膏用玻璃棒挑取，放在称量纸上称量，称量后直接放入水中，这是稍加热，酵母浸膏就会与称量纸分离，然后取出纸片。

加热过程中要不断搅拌，等药品完全溶解后，加水定容到500ml2.分装使用漏斗分装装置趁热将制得的培养基分装到21支试管中，液体量不要超过试管的1/3，多余的培养基溶液装入三角烧瓶中，液体量不超过三角烧瓶的1/23.包装和贴上标签将试管加盖，注意试管要直立，不要倾斜放置。

将21支试管分成3份，每份7支，分别用2层牛皮纸和橡皮筋将试管组和三角烧瓶包好，然后贴上标签，同时在牛皮纸上也写上表浅上的信息，防止在灭菌的过程中标签上的字迹因为蒸汽二变模糊4.灭菌五、结果与讨论加热煮沸后配制得到的麦氏培养基是淡黄色的溶液，冷却一会儿后变为淡黄色的透明固体实验（二）环境水样中细菌总数的测定---水样采集与平板分离一、实验目的1.学会细菌计数的基本原理与方法，了解环境水样的采集方法2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术3.学会平板涂布和平板化线的方法二、实验器材及实验用品1.样品：天然水体水样2.培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基3.器材：无菌试管、无菌平皿、1ml移液枪、1ml无菌枪头，记号笔、玻璃刮铲、接种环、酒精灯等三、实验内容1.加热融化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：将已经灭好菌的固体培养基放入微波炉中加热，当看到培养基融化的时候，关掉开关，取出培养基，冷却到55---60摄氏度2.倒平板：右手持装有培养基的三角瓶置酒精灯火焰旁，用左手将瓶塞轻轻拔出，瓶口对着火焰：用右手小指和手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在酒精灯火焰附近打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布3.样品稀释：取天然水样，用手或置摇床上振荡20分钟，使微生物细菌分散；用1ml无菌吸管，吸取水样0.1ml，移入装有0.9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液充分混合均匀，即成10-1稀释液1ml，移入装有0.9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成10-2稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释菌液4.平板涂布：用无菌吸管吸取0.2ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上。

枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。

因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。

以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。

一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。

采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。

2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。

3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。

通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。

固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。

4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。

液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。

培养时间一般为24-48小时。

5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。

一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。

6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。

纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。

二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。

枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。

2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。

常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。

3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。

4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。

土壤中枯草芽孢杆菌的分离与鉴定之细菌芽孢染色法一、实验目的1.学习掌握芽孢染色法并了解芽孢的形态特征2.学习并掌握荚膜染色法并了解荚膜的形态特征3.学习并掌握鞭毛染色法并了解鞭毛的形态特征4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理1.细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。

2.芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色又难以脱色这一特点而设计的。

3.所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而更能明显地衬托出芽孢，便于观察。

4.染色方法：改良后的Schaeffer-Fulton氏染色法三、实验仪器及材料1.菌种：枯草芽孢杆菌2.染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液3.仪器或其他用具：Eppendorf管架、载玻片、显微镜、电磁炉、搪瓷杯等。

四、实验步骤1.制备菌悬液：在EP管中滴两滴生理盐水，挑取2-3环菌苔加入到含生理盐水的EP管中，混合均匀。

2.染色：在EP管中滴加2-3滴孔雀绿染液，盖紧EP管，将EP管插入浮筏中，放进沸水中加热15-20分钟，加热过程需要有人看护，随时控温，防止沸水进入EP管。

3.涂片固定：取半滴经孔雀绿染色的菌悬液在载玻片的中央，用接种环将菌液涂抹均匀，将载玻片用法电风机冷风吹干，经过酒精灯火焰固定三次。

4.脱色：待玻片冷却后，水洗脱色。

5.复染：滴加数滴0.5%番红水溶液在菌膜上，染色2min，再水洗。

6.镜检：将晾干后放在显微镜下观察。

五、实验结果结果描述：大部分菌体被染成红色，少部分被染成绿色，说明有芽孢产生，但是芽孢的数量没有菌体多，芽孢被染成绿色，菌体被染成红色，由绿色芽孢的外面还包裹着一层淡红色带可知，该芽孢是内生芽孢，芽孢呈椭圆形，位于菌体的中央，是中央生的芽孢，同时可以观察到枯草芽孢杆菌的大小比平常的小得多。