棉花学报Cotton Science2013,25(6):510~516
棉花黄萎病拮抗细菌Z-5菌株的定殖能力检测
张冬冬,刘涛,高同国,姜军坡,雷白时,王世英,朱宝成*
(河北农业大学生命科学学院,河北保定071001)
摘要:拮抗微生物能否在植株根围成功定殖是植物病害生物防治的第一步。以棉田土壤中分离的对棉花黄萎病有较高生物防治效果的芽孢杆菌Z-5菌株为材料,采用抗利福平和抗病原真菌法标记Z-5菌株,筛选出在300μg·mL-1利福平的NA培养基上稳定生长,对棉花黄萎病病原真菌有拮抗作用、菌落形态和菌体形态均未改变的Z-5突变体菌株。利用标记的Z-5菌株对棉花种子进行浸种、拌种和浇土处理,在含有利福平的平板上通过稀释涂布法定期检测棉花植株根际土壤、根、茎、叶中Z-5菌株的数量。结果表明,浇土组棉花根际土壤拮抗细菌Z-5平均数量为49.72×104cfu·g-1,浸种组为0.49×104cfu·g-1,拌种组为2.07×104cfu·g-1。浇土组根内Z-5平均数量为4.93×104cfu·g-1,浸种组为4.12×104cfu·g-1,拌种组为3.29×104cfu·g-1。浇土组茎内Z-5平均数量为
1.32×104cfu·g-1,浸种组为0.17×104cfu·g-1,拌种组为0.74×104cfu·g-1。浇土组叶片Z-5平均数量为0.27×104
cfu·g-1,浸种组为0.17×104cfu·g-1,拌种组为0.22×104cfu·g-1。表明Z-5菌株能够在棉花根际土壤及植株体内有效定殖;采用浇土法处理棉花种子,Z-5菌株在棉花植株体内及根际土壤定殖效果最好,优于浸种法和拌种法。
关键词:棉花黄萎病;拮抗;定殖;抗生素标记
中图分类号:S435.621文献标志码:A
文章编号:1002-7807(2013)06-0510-07
ZHANG Dong-dong,LIU Tao,GAO Tong-guo,JIANG Jun-po,LEI Bai-shi,WANG Shi-ying,ZHU Bao-cheng*
(071001)
The first step in the biological control of plant diseases is to determine whether antagonistic microorganisms can colo-nize successfully the plant rhizosphere soil.Z-5was isolated from cotton plant soil and showed a significant biocontrol effect on cotton Verticillium wilt.The strain Z-5was marked with resistance to rifampicin and pathogenic fungi.A Z-5mutant strain that could stably grow in300μg·mL-1rifampicin NA medium and had wild-type antagonistic activity against pathogen fungi,colony morphology,and cell morphology was selected.The marked strain Z-5was used to treat cotton seeds by seed soak-ing,seed dressing,and soil drench.The number of Z-5cells in cotton plant root soil,roots,stems,and leaves was tested using di-lution on rifampicin plate after different periods.The result showed that the number of antagonistic bacteria of soil drench group in cotton plant root soil was49.72×104cfu·g-1,while seed soaking and seed dressing groups yielded about0.49×104and2.07×104 cfu·g-1.The number of antagonistic bacteria of the soil drench group in cotton plant roots was4.93×104cfu·g-1,while the seed soaking and seed dressing group yielded4.12×104and3.29×104cfu·g-1.The number of antagonistic bacteria of the soil drench group in cotton stems was1.32×104cfu·g-1,while the seed soaking and seed dressing group yielded0.17×104and0.74×104cfu·g-1.The number of antagonistic bacteria of soil drench group in cotton leaves was0.27×104cfu·g-1,while seed soaking and seed dressing group yielded0.17×104and0.22×104cfu·g-1.These results showed that the Z-5strain could effectively colonize cotton roots soil and that,the soil drench group showed a better colonization effect by the strain Z-5than the seed soaking and
收稿日期:2013-05-27
作者简介:张冬冬(1981-),男,在读博士,讲师,zhangdongcumt@https://www.doczj.com/doc/866989959.html,;*通讯作者,男,博士,教授,博士生导师, zhu2222@https://www.doczj.com/doc/866989959.html,
基金项目:保定市科学研究与发展计划项目(10ZC004);河北省自然科学基金项目(C2014204027)
seed dressing group.
Cotton Verticillium wilt;antagonist;colonization;antibiotic.
棉花黄萎病(Cotton Verticillium wilt)是由大
丽轮枝菌(Kleb.)引起的危害
性极大的维管束系统病害,是棉花生长过程中危
害最重的病害之一[1]。随着绿色农业的兴起和可持续发展观念的提出,生物防治被认为是最具有
发展潜力的重要防治方法,而获得高效拮抗菌是
生物防治的基础[2-4]。目前主要利用平板对峙法筛选生防菌,但是用此方法选择出的拮抗作用强的生防菌株并不一定是最好的生防因子,在实际应用中往往会受到很多因素的影响,而决定生防效果的一个主要因素是生防菌能否在一定的生态系统中定殖并适应恶劣的环境。研究表明,土传病原菌的生防菌在作物根部具有较好的定殖能力,是生防菌发挥作用的重要条件之一。因此,植物病害生物防治的第一步是拮抗微生物能在根围成功定殖,其定殖能力决定着生防作用的大小[5]。Bacon等分离了一株与玉米穗粒腐病病原菌串珠镰孢菌()具有共同生存位点的内生枯草芽孢杆菌(),施用该菌剂后菌株能在玉米体内迅速繁殖和定殖,可有效降低串珠镰孢菌及其霉菌毒素()的积累[6]。Coombs和Franco研究了链霉菌属(
spp.)的一个菌株EN27在发芽小麦种子中的定殖情况,在发芽小麦种子的胚芽、胚乳与刚生出的幼根中能看到内生定殖的标记细菌,证明内生细菌能定殖在处于发育早期的植物中[7]。Gyaneshwar等利用能使细菌产生蓝色色素的基因标记了一种具有固氮能力的植物内生细菌粘质沙雷氏菌()IR-BG500,研究了该菌对水稻的定殖情况[8]。何红等研究表明,通过浸种、涂叶和灌根处理后,辣椒内生枯草芽孢杆菌BS-1和BS-2菌株均可在辣椒体内定殖[9]。连玲丽等利用抗生素抗性标记法研究了生防芽孢杆菌菌株EN5定殖能力,研究表明,EN5在试验的番茄根、茎、根际土壤中表现出稳定的定殖能力[10]。李春宏等研究了棉花内生细菌的数量动态,棉花根中内生细菌的数量显著高于茎、叶,6个棉花品种根中内生细菌平均数量差异并不显著,但茎、叶中内生细菌数量不同品种间呈现一定程度差异[11]。田绍仁等从抗生、竞争和诱导系统抗性三个方面对拮抗细菌C-02防治棉花黄萎病的机理展开了研究,C-02在棉花根际土壤中具有显著的营养竞争优势和很好的定殖能力[12]。
从土壤、植物根际等外部环境中分离筛选植物病害的拮抗细菌已有许多的报告,但由于这些拮抗菌易受外界环境的影响,不易定殖,因而其防病效果常常不稳定[5,13]。在生产实践中,生防菌被引入土壤后,往往会受到土壤抑菌作用及生防菌与植物根部亲和能力的影响,这是生防菌防治植物病害不稳定的重要原因之一。因此,生防菌能否在靶植物根际定殖是生防菌能否稳定发挥作用的重要原因之一,也是筛选、评定生防菌的一个重要指标,并最终决定该生防菌是否具有产业化前景。
在前期工作中,本课题组从棉田中分离一株对棉花黄萎病具有较高拮抗活性的芽孢杆菌菌株Z-5[14]。本项研究以Z-5菌株为材料,采用抗利福平和抗病原真菌法标记,利用含有抗生素的平板稀释法简便、准确、快捷地测定棉花植株不同部位拮抗菌的含量,检测拮抗菌在棉花植株体内及根系土壤定殖情况,为阐明芽孢细菌防治棉花黄萎病的作用机制奠定基础,同时为提高和稳定菌株的生防效果、制定科学的施用技术提供理论依据。
材料与方法
菌株和棉花品种
棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌V-190菌株和棉花黄萎病拮抗细菌Z-5由河北农业大学生命科学学院制药工程系保存。供试棉花品种为陆地棉邯208,由河北农业大学农学院王省芬教授惠赠。
培养基
PDA培养基、NA培养基见参考文献[14]。
细菌种子培养基:蛋白胨1%,葡萄糖1%, NaH2PO4·2H2O0.2%,Na2HPO4·2H2O0.4%,Mg-SO4·7H2O0.05%,pH7.0～7.2。
细菌发酵培养基:蔗糖2%,黄豆饼粉1%, KH2PO4·2H2O0.4%,MgSO4·7H2O0.05%,pH7.0。
张冬冬等:棉花黄萎病拮抗细菌Z-5菌株的定殖能力检测
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棉花学报25卷
拮抗菌株的标记
采用抗利福平和抗病原真菌法标记。将供试菌株Z-5转入含0.5μg·mL-1利福平(Rifampicin)的NA平板培养基中。逐步筛选出在含300μg·mL-1利福平的NA培养基上稳定生长、并对病原真菌的拮抗作用不变的Z-5突变体菌株[15-16]。
拮抗菌活性检测
以大丽轮枝菌为测试菌,采用琼脂扩散培养法检测突变株的活性。观察是否出现抑菌圈,并与野生型菌株的抑菌活性进行比较[14]。
突变株稳定性检测
将利福平抗性Z-5突变株于NA培养基中继代培养50代,检测每一代培养的突变菌株的拮抗活性和对抗生素的抗性,考察突变株的遗传稳定性[17]。
拮抗菌突变株菌液制备
将Z-5突变株进行活化,制备种子液,将活化的菌株接入种子液中,摇床培养(37℃,200r·min-1)24h后按10%的接种量接入发酵液中,摇床培养2～3d后进行活菌计数,要求芽孢数达到90%以上。
棉苗处理
采用盆栽的方法在实验室中进行,将土壤晾干,过40目筛备用。每个花盆装干土1.5kg。将硫酸脱绒的棉子在室温下水中浸泡12～14h,将其分为3组,进行不同处理[18]。处理一(浸种组),播种前用浓度为109cfu·mL-1的拮抗菌液浸泡种子24h,分拣出10粒种子,采用稀释涂布法检测含菌量;处理二(拌种组),将菌液离心,回收菌体,将棉子放入浓度为1010cfu·mL-1菌泥,使棉子沾满细菌,分拣出10粒种子,采用稀释涂布法检测含菌量;处理三(浇土组),将棉子播种,加入浓度为109cfu·mL-1的拮抗菌液15mL浇灌土壤后覆土;对照组未接菌。每处理10盆,每盆5株棉苗,温室培养,土壤保持湿润,于播种8d后开始采集样品,每隔7d采集一次,数据采用SPSS V17.0软件进行统计分析[19]。
棉苗根际土壤拮抗菌的回收、计数及鉴定
取根际土,称1g(湿),置于9mL灭菌水中,漩涡震荡30min,用灭菌水稀释成合适的浓度,取0.1mL上述溶液涂布在含有300μg·mL-1利福平的NA培养平板上,37℃培养2d计数;挑取单菌落进行抑菌试验,检测其对大丽轮枝菌的抑菌活性,菌量以cfu·g-1表示[18]。
棉花根、茎、叶拮抗菌的回收、计数及鉴定
取棉苗根、茎、叶,用自来水冲洗干净,用滤纸吸干水分,称量鲜质量1.0g,75%的酒精中浸泡5min,无菌水冲洗3次,然后用0.1%升汞表面消毒10min,再用无菌水冲洗5次,取消毒后最后一次冲洗液0.1mL于灭菌NA培养平板上涂布,在37℃培养2d,观察有无菌落产生,据此验证此消毒是否已把供试材料表面微生物全部杀死。然后在超净工作台中将供试材料用无菌滤纸吸干水分,在无菌研钵中加入9倍体积的无菌水研成糊状后,放置10～20min,使细菌释放出来,得到第1个稀释样品,摇匀后作系列稀释,然后涂布培养,以未接菌的棉苗作为对照。将培养得到的单菌落进行抑菌试验,检测其对大丽轮枝菌的抑菌活性[20-21]。
体内分离获得细菌的鉴定
将涂布得到的单菌落进行抑菌试验,检测其对大丽轮枝菌的抑菌活性;常规革兰氏染色,芽孢染色,并对优势菌落提取16S rDNA,进一步验证是否为所施菌株。
结果与分析
拮抗菌突变株的筛选
筛选出在含300μg·mL-1利福平的NA培养基上稳定生长、对病原真菌的拮抗作用不变的Z-5突变体菌株。Z-5突变菌株仍然具有和野生型菌株相同的活性,并且菌落形态和菌体形态未发生改变。
拮抗菌Z-5突变株遗传稳定性分析
将Z-5突变株在NA培养基中继代培养50代,以确定其抗生素诱导抗性和病原真菌拮抗活性的稳定性,结果显示在传代过程中Z-5突变株对利福平抗性丧失不显著,能够在300μg·mL-1利福平的NA培养基上稳定生长的菌落达97.1% (图1)。野生型Z-5菌株对大丽轮枝菌的抑菌圈直径为(1.73±0.02)cm,Z-5突变株对大丽轮枝菌的抑菌圈直径为(1.72±0.02)cm,两者之间差异不显著。抑菌试验表明Z-5突变株对大丽轮枝菌
512
的拮抗活性未发生改变(图2)。
拮抗细菌Z-5的定殖
经测定,拌种处理每粒种子包裹的拮抗细菌
Z-5数量为16.21×104cfu ·g -1,浸种处理每粒种子
包裹的Z-5数量为3.37×104cfu ·g -1。
对棉花根际土壤拮抗细菌Z-5的测定表明,
在整个检测周期,浇土组Z-5平均数量为49.72×104cfu ·g -1,浸种组为0.49×104cfu ·g -1,拌种组为
2.07×104cfu ·g -1。浇土组拮抗细菌Z-5数量和浸种组及拌种组相比较,差异显著;浸种组和拌种组差异不显著。在整个检测周期,浇土组拮抗细菌Z-5数量变化不大;浸种组拮抗细菌Z-5数量在接种第8天达到最大值,之后逐渐降低,最后趋于稳定;拌种组在接种拮抗细菌Z-5后数量逐渐增加,在第29天达到最大值,之后逐渐降低
(图3)。
浇土组根内Z-5平均数量为4.93×104cfu ·g -1,浸种组为4.12×104cfu ·g -1,拌种组为3.29×104cfu ·g -1。浇土组和浸种组比较,第15、22、36、43、
57天差异显著;浇土组和拌种组比较,第8、22、36天差异显著;浸种组和拌种组比较,第15、43、57天差异显著;其余差异不显著。在整个检测周期,浇土组根内Z-5数量较稳定;浸种组根内Z-5数量逐渐减少,在接种第22天达到最低,之后Z-5数量逐渐上升;拌种组根内Z-5数量逐渐增加,在接种第15天达到最大值,之后逐渐降低(图4)。
图1Z-5突变株对利福平诱导抗性稳定性检测Fig.1
Stability testing of induced resistance to
rifampin of Z-5mutant
A :初始野生型Z-5菌株对大丽轮枝菌拮抗活性;
B :Z-5突变株继代培养50代后对大丽轮枝菌拮抗活性。
A:Antagonistic activity against
Kleb.of initial wild-type strain of Z-5;B:Antagonistic activity against
Kleb.of Z-5mutant
cultured 50generations.图2
Z-5突变株对大丽轮枝菌拮抗活性稳定性检测
Fig.2Stability testing of antagonistic activity against
Kleb.of Z-5mutant
注:浇土组拮抗细菌Z-5数量数量级为106,浸种组和拌种组拮抗细菌Z-5数量级为104;不同字母表示Duncan 新复极差法多重比较5%的差异显著性。
Note:Magnitude of antagonistic bacterial Z-5count of pouring soil group reached 106and magnitude of soaking seeds group and dressing seeds group reached 104;Different letters show significant difference according to Duncan ’s multiple range test at =0.05level.
图3不同处理棉花根际土壤中拮抗细菌Z-5的消长规律
Fig.3Population fluctuation of antagonistic bacteria Z-5in rhizosphere soil of cotton of different treatments
张冬冬等:棉花黄萎病拮抗细菌Z-5菌株的定殖能力检测6期513
棉花学报25卷
注:不同字母表示Duncan新复极差法多重比较5%的差异显著性。
Note:Different letters show significant difference according to Duncan’s multiple range test at=0.05level.
图4不同处理棉花根内拮抗细菌Z-5消长规律
Fig.4Population fluctuation of antagonistic bacteria Z-5in cotton root of different treatments
浇土组茎内Z-5平均数量为1.32×104cfu·g-1,浸种组为0.17×104cfu·g-1,拌种组为0.74×104 cfu·g-1。浇土组、拌种组和浸种组之间茎内Z-5数量差异显著。在整个检测周期,浇土组茎内Z-5数量逐渐增加,从接种Z-5第8天的0.93×104cfu·g-1增加到第57天的2.00×104cfu·g-1;浸种组茎内Z-5数量变化不大;拌种组茎内Z-5数量逐渐增加(除接种第22天波动较大外),从接种Z-5第8天的0.26×104cfu·g-1增加到第57天的0.92×104cfu·g-1(图5)。
注:不同字母表示Duncan新复极差法多重比较5%的差异显著性。
Note:Different letters show significant difference according to Duncan’s multiple range test at=0.05level.
图5不同处理棉花茎内拮抗细菌Z-5的消长规律
Fig.5Population fluctuation of antagonistic bacteria Z-5in cotton stem of different treatments
浇土组叶片Z-5平均数量为0.27×104cfu·g-1,浸种组为0.17×104cfu·g-1,拌种组为0.22×104 cfu·g-1。浇土组、浸种组和拌种组叶片Z-5数量差异不显著。在整个检测周期,浇土组叶片Z-5数量逐渐减少,从接种Z-5第8天的0.40×104cfu·g-1减少到第57天的0.20×104cfu·g-1;浸种组叶片Z-5数量逐渐增加,在接种Z-5后第29天达到最大值,之后趋于稳定;拌种组在接种Z-5第15天从棉花植株叶片中仍检测不到拮抗菌的存在,但接种第22天棉花植株叶片Z-5数量达到0.35×104cfu·g-1,之后趋于稳定(图6)。
回收菌株的鉴定
从上述接种棉花植株体内分离获得的抗利福
平标记的Z-5菌株,在NA平板上生长,单菌落呈
近圆形,边缘不整齐,不透明,灰白色,菌落扁平,中
间有突起;菌体呈杆状,革兰氏染色呈阳性。通过提
取基因组与野生型Z-5菌株16S rDNA进行序列比
对分析表明,从棉花植株分离的利福平标记的菌株
与初始菌株保持一致,为[14]。抑菌试验表明,从棉花植株分离的菌株对大丽轮枝菌
具有抑菌活性(图7)。表明从棉花植株分离的具有
利福平抗性的菌株为Z-5突变株。
514
注:不同字母表示Duncan 新复极差法多重比较5%的差异显著性。
Note:Different letters show significant difference according to Duncan ’s multiple range test
at
=0.05level.
图6
不同处理棉花叶片内拮抗细菌Z-5的消长规律
Fig.6
Population fluctuation of antagonistic bacteria Z-5in cotton leaves of the three different treatments
讨论与结论
在对Z-5菌株进行利福平抗性诱导的过程中,每次抗生素浓度的增加量不宜太大,否则不易筛选到抗性突变株或者突变株容易丢失对利福平的抗性。作者的做法是在抗生素浓度为2～50μg ·mL -1时,以2μg ·mL -1的梯度增加;在50～100μg ·mL -1时,以5μg ·mL -1的梯度增加;当加到100μg ·mL -1以上时,以10μg ·mL -1或20μg ·mL -1
的梯度增加。
在整个检测周期,浇土组根系土壤、根、茎、叶拮抗菌的变化相对较小,说明开始检测的时候,浇土组各部位Z-5数量已经达到或接近饱和而趋于稳定。浸种组和拌种组茎内和叶片Z-5的数量有增大的趋势,最后趋于稳定;说明在刚开
始检测时,浸种组和拌种组茎内和叶片Z-5的数量并未达到饱和。这表明浸种组和拌种组棉花植株体内拮抗菌达到饱和的过程要比浇土组长,这可能与土壤中拮抗菌的数量相关。
在检测后期,各处理组不同部位Z-5数量趋于稳定,并维持在较高水平,说明Z-5能在棉花根系土壤及棉花植株体内成功定殖。
综合上述,各接种后回收检测结果可以得出,Z-5菌株不仅可以在棉花体内定殖,同时还可
以在棉花体内向上传导。不同处理方式影响土壤中拮抗菌的数量,但对植株体内拮抗菌数量影响从根部到叶片逐渐减小。
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回收的Z-5突变株活性检测
Fig.7Activity examination of Z-5mutant recovered
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1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变，为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。 2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。（1）感染性微生物的检测。如：用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等。（2）基因突变的检测。如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP)技术检测地中海贫血基因突变。 （3）法医学检测。如：用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。 （4）基因异常表达的检测。如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。 （5）基因定位。如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。 3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。 4、基因：是基因组中一个功能单位，是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。 5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。
6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位。 7、质粒：是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。 8、转座因子：又称为转座元件，是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列。 9、原核生物基因组的结构特征： （1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。 （2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列。 （3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。（4）具有编码同工酶的基因。 （5)含有可移动的DNA序列。 10、病毒基因组的结构特点： （1）与细菌和真核生物基因组相比，病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。 （2）病毒基因组的核酸类型较多，有双链DNA、单链DNA、双链RNA和单链RNA；有环状分子，也有线性分子。但无论是哪种核酸类型，一种病毒颗粒中核酸成分只能为一种，或
重庆邮电大学生物信息学院 微生物实验报告 实验题目棉花黄萎病菌的分离与纯化 实验人员罗秋兰范欢卢正兴 汤丽刘培 填写时间:2010年12 月22日 重庆邮电大学生物信息学院制
一、选题背景 棉花是我国重要的经济作物，特别是在新疆，山东等地区种植面积非常大。一些农民更是以种植棉花来养家糊口。用棉花加工而成的产品数不胜数，我们的日常生活离不开棉花。 而在当前，棉花黄萎病是影响我国棉花产量与品质的主要病害之一，是由大丽轮枝菌(Vertillium dahliae Kleb．)引起的一种危害性极大的维管束系统病害,该病原菌分布范围广,可浸染双子叶植物及单子叶植物,寄主多达600多种,一旦爆发造成严重经济损失. 在全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元。自20世纪70年代以来,中国棉花黄萎病有发展和蔓延的趋势近年来,我国棉花黄萎病菌致病力分化明显,病害在田间表现出多种症状类型. 国内外在棉花黄萎病防治及抗病育种方面虽然取得了一些进展，但进展缓慢。这是因为棉花黄萎病是一种土传病害，利用物理化学手段进行黄萎病的防治效果甚微。 二、实验目的 通过对棉花黄萎病菌的培养、分离、纯化，掌握此病菌的理化性质；通过此次实际操作，掌握微生物的分离纯化的具体方法以及培养基的制作方法。 三、实验步骤 （一）土壤取样 （二）制备培养基 我们采用的是选择培养基，成分为:蔗糖5克，磷酸钾 1克,硝酸钠 2克，氯化钾 0.5克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.01克,蒸馏水1000毫升,克菌丹0.5ppm,PCNB 350ppm,井岗霉素2.5ppm,氯霉素、链霉素、青霉素各250ppm，琼脂少量。在这种培养基上细菌很少生长,V.dahliae 菌落呈黑色,稍凸起,杂菌主要为白色的镰刀菌,但对 V.dahliae 计数影响不大。 （三）高温消毒 将所需要的所有实验用具和所制得的培养基，放入灭菌锅内，进行高温蒸汽灭菌 （四）稀释样品液 将所得到的土壤样品先第一次加入10ML蒸馏水中进行稀释，静置，沉淀，取1ML上清液到另一干净的试管中，加蒸馏水定容至10ML,重复上述步骤4次，得到五种不同浓度的稀释液。具体步骤如图所示：
分子生物学检验技术 _______期日______ _名___签__任__主__室__研_教名课姓任_ _ ____________名__签__员_教号题学出_ ________________员__教_课次任班学__教_ _ _ _ _ _ ______________次__班_核别考队______数人核考湖北医药学院2011-2012学年第二学期《分子生物学检验技术》期末考试试卷湖北医药学院 A、内含子 B、外显子 C、DNA D、质粒 E、重叠基因 … ………《分子生物学检验技术》期末考试试卷(C卷)8、对染色体端粒进行的显带称为 A、C显带 B、D显带 C、G显带 D、Q显带 E、T显带 ……… 9、染色质和染色体是 ……题目一二三四五总分核分人复查人A、同一物质在细胞中的不同时期的两种不同的存在形式B、不同物质在细胞中的不同时期 ……得分的两种不同的存在形式C、同一物质在细胞的同一时期的不同表现D、不同物质在细胞的… 同一时期的不同表现E、染色质是染色体的前体物质 ……… 10、物理图是以什么作为图距 线…评卷人得分 A、摩尔 B、摩尔根 C、纳米 D、重组频率 E、kb …… 一、A型题（40小题，每小题1分，共40分） …11、下列哪一项不属于真核生物基因组的特点 … ……1、A、重复序列B、断裂基因C、单拷贝序列D、DNA多态性E、多顺反子结构
HTLV基因组中tax基因编码的蛋白是 …12、据调查，糖尿病的单卵双生同病率为84％，双卵双生同病率为37％，根据遗传病研究的 ……A、对病毒的结构蛋白的表达有调节作用B、对病毒的调节蛋白的表达有调控作用C、一种…反式激活因子D、激活细胞的IL-6基因E、激活细胞的IL-2基因双生子法，可以计算出糖尿病的遗传率为 …封…2、A、100％B、75％C、60％D、50％E、25％ 腺病毒基因组不正确的是 …13、两条非同源染色体同时发生断裂，断片交换位置后重接，结果造成 …A、腺病毒基因组是环状双链DNA B、两条链分别称为轻链和重链C、每条链的5’端都…与蛋白质结合D、腺病毒DNA采用半保留复制方式E、腺病毒可引起人类许多急性感染 A、缺失 B、倒位 C、重复 D、插入 E、易位 ………3、基因图是指 14、线粒体基因组DNA的结构一般认为类似于 ……A、EST B、STS C、STR D、YAC E、STR A、原核生物 B、大肠埃希菌 C、质粒 D、病毒 E、真核生物 ………4、α -卫星DNA可由哪种限制性内切酶消化获得 15、发生基因点突变的结、直肠癌中约80％的突变位于 密…A、Alu B、HindⅢC、HinfI D、KpnI E、EcoRI A、K-ras12位密码子突变 B、K-ras13位密码子突变 C、K-ras61位密码子突变 D、H-ras12…位密码子突变 E、N-ras61位密码子突变 ……5、下列哪项不属于Alu家族的特点 …16、与遗传性高发乳腺癌相关的基因是 …A、属于短分散重复片段B、有AGCT序列C、能被AluI切割D、无种属差异E、有调…控作用 A、APC B、BRCA C、DCC D、FHIT E、Rb
第二章临床分子生物学检验标志物 1. 分子生物标志物：指可以反映机体生理，病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。 2. 中心法则：指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。 3. 基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质，包括基因和非编码DNA。 4. 原核生物基因组特征： 1）原核生物基因组较小：大小一般在106—107碱基对之间； 2）原核生物的类核结构：原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区，没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下，以一定的形式盘曲，折叠包装起来，形成类核； 3）原核生物的操纵子结构：原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号，共同组成了一个基因表达单位，即操纵子结构； 4）原核生物的结构基因：原核生物的结构基因中无内含子成分，多数是单拷贝基因，基因与基因之间有重复序列存在； 5）具有编码同工酶的基因：这类基因表达产物的功能相同，但基因结构不完全相同；6）含有可移动DNA序列：可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组，改变生物体的遗传性状，使生物体更适应环境的变化； 5. 质粒：指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子； 6. 人类基因组包括细胞核内的核基因组（3X109bp）和细胞质内的线粒体基因组（16569bp），人类基因组中存在大量的非编码序列和重复序列； 7. 小卫星DNA：由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次，形成的1—5bp 的短DNA，又称可变数目串联重复； 8. 微卫星DNA：核心序列为1—6bp，可以重复上百次，又称短串联重复； 9. 多基因家族：指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因，在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因； 10. 多态性：当某种变异相对常见，在群体中的频率高于1%时，则称为多态性，频率低于
棉花黄萎病菌系不同组合对致病力影响 玄兆伶，张桂寅，王省芬，马峙英* (河北农业大学／河北省作物种质资源重点实验室河北保定 071001) 摘要：为阐明黄萎病菌系对棉花的侵染规律，本研究以陆地棉耐病品种冀棉20和感病品种邯208为鉴别寄主，在人工培养条件下鉴定和比较了不同培养方式、接种方法对6个黄萎病菌系致病力的影响。结果表明，单独培养单独接种时6个供试菌系的致病力可划分为强、中、弱3种类型，其中V2和V6致病力最强，V1和V3中等，V4和V5最弱。相比之下，混合培养后接种时，除个别菌系组合在邯208上略有增强外，其余菌系组合的致病力都存在不同程度的减弱，而单独培养后混合接种的菌系，尽管其致病力较相应单菌系接种时致病力呈现一定程度的波动，但大部分接种菌系在2个鉴别寄主上的致病力表现出增强的趋势。关键词：棉花；黄萎病菌；致病力 棉花黄萎病(Verticillium wilt)是一种流行于棉花种植区的世界性病害。近几年来，棉花黄萎病在我国危害日趋严重，河北省作为中国产棉大省之一，每年均因黄萎病发生而造成严重的棉花产量损失。选育和利用抗病品种是控制该病害最经济有效的手段[1]，而研究各菌系之间致病力的差异是鉴别、选育棉花抗病品种的一项基础工作。国内外植物病理学家、遗传育种学家一直致力于不同来源的黄萎病菌系致病性变异、寄主与病原菌相互作用机理等方面的研究，并取得了可喜的进展[1-6]。20世纪70年代末，我国对黄萎病菌“种”的鉴定结果认为国内棉花黄萎病菌均属于大丽轮枝菌(verticillium dahliae Kleb)[6,7]。之后，一些学者针对黄萎病菌致病力的研究表明，不同地区的黄萎病菌之间存在明显的致病力分化[1,7-11]。但由于病菌与寄主相互作用的复杂性，目前研究者关于黄萎病菌致病力的发生还未得出统一的结论。因此本研究利用6个棉花黄萎病菌系及其不同组合研究了人工培养条件下菌系间相互作用对致病力的影响，为明确棉花黄萎病菌与寄主相互作用的机制和提高抗病育种成效提供依据。 1 材料与方法 1.1 供试菌系 所用黄萎病菌系由河北农业大学棉花遗传育种研究室提供(表1)。 表1 供试菌系的名称和组合 Table 1 Different isolates of Verticillium dahliae and their combinations 菌系代号Isolate code 菌系组合 Isolate combination 菌系代号 Isolate code 菌系组合 Isolate combination V1 V1 V10 V4+V6 V2 V2 V11 V2+V4 基金项目：国家重大基础研究前期研究专项（2004CCA01100）、国家自然科学基金（30471105）、教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20040086002）和河北省自然科学基金（C2004000365）。 作者简介：玄兆伶(1979- )，女，河北省唐山迁安市人，在读硕士研究生，从事棉花遗传育种研究。 *通讯作者：马峙英(1958- )，男，河北新乐市人，教授，博士生导师，主要从事棉花遗传育种和分子生物学 研究。E-mail: mzhy@https://www.doczj.com/doc/866989959.html,
棉花在幼苗期几乎不会出现、整个生育期都可能发作的真菌病害。一般在3~5片真叶期开始显症，生长中后期棉花现蕾后田间大量发病，容易导致整个植株枯死或萎蔫。为害的病原为大丽花轮枝孢和黑白轮枝菌，属于半知菌亚门。该病害可以通过种植管理或药剂喷洒以及细菌撒放来防治。整个生育期均可发病。自然条件下幼苗发病少或很少出现症状。一般在3~5片真叶期开始显症，生长中后期棉花现蕾后田间大量发病，初在植株下部叶片上的叶缘和叶脉间出现浅黄色斑块，后逐渐扩展，叶色失绿变浅，主脉及其四周仍保持绿色，病叶出现掌状斑驳，叶肉变厚，叶缘向下卷曲，叶片由下而上逐渐脱落，仅剩顶部少数小叶，蕾铃稀少，棉铃提前开裂，后期病株基部生出细小新枝。纵剖病茎，木质部上产生浅褐色变色条纹。夏季暴雨后出现急性型萎蔫症状，棉株突然萎垂，叶片大量脱落，发病严重地块惨不忍睹，造成严重减产。由于病菌致病力强弱不同，症状表现亦不同。 根据病症的不同，可以划分为: 落叶型:该菌系致病力强。病株叶片叶脉间或叶缘处突然出现褪绿萎蔫状，病叶由浅黄色迅速变为黄褐色，病株主茎顶梢侧枝顶端变褐枯死，病铃、苞叶变褐干枯，蕾、花、铃大量脱落，仅经10天左右病株成为光秆，纵剖病茎维管束变成黄褐色，严重的延续到植株顶部。 枯斑型:叶片症状为局部枯斑或掌状枯斑，枯死后脱落，为中等致病力菌系所致。 黄斑型:病菌致病力较弱，叶片出现黄色斑块，后扩展为掌状黄条斑，叶片不脱落。在久旱高温之后，遇暴雨或大水漫灌，叶部尚未出现症状，植株就突然萎蔫，叶片迅速脱落，棉株成为光秆，剖开病茎可见维管束变成淡褐色，这是黄萎病的急性型症状。
根据发病时期的不同，可以划分为: 1.幼苗期。一是病叶边缘退绿发软，呈失水状，叶脉间出现不规则淡黄色病斑，病斑逐渐扩大，变褐色干枯，维管束明显变色。二是有些病株在苗期不明显，外观看上去正常，但切开棉花横截面，部分木质部和维管束已变成暗褐色。 2.成株期。黄萎病在现蕾期后才逐渐发病，一般在6月下旬，黄萎病病株出现逐渐增多，到七八月份开花结铃期发病达到最高峰。近年来，其症状呈多样化的趋势，常见症状有: ①病株由下部叶片开始逐步向上发展，叶脉间产生不规则的淡黄色斑块，叶脉附近仍保持绿色，病叶边缘向上卷曲; ②有时叶片叶脉间出现紫红色失水萎蔫不规则的病斑，病斑逐渐扩大，变成褐色枯斑甚至整个叶片枯焦，脱落成光秆; ③有时生长在主干上的或侧枝上的叶片大量脱落枯焦后，在病株的茎部或落叶的叶腋里，可长出许多赘芽和枝叶; ④在七八月份，棉花铃期，在盛夏久旱遇暴雨或大水漫灌时，田间有些病株常发生一些急性型黄萎病症状，先是棉叶呈水烫样，继而突然萎垂，逐渐脱落成光秆; ⑤有些黄萎病黄化但植株不矮缩、结铃少;有些黄萎病株变得矮小，几乎不结铃，甚至死亡。折叠 防治方法 恶霉灵又称土菌消，产品为浅黄色晶体，化学名称为3-羟基-5-甲基异恶唑。1970年由日本三井公司提出作为农药使用，是一种新型内吸性土壤真菌杀菌剂和植物生长调节剂。该产品在世界之所以被公认属无公害农药，是因为它的各项理化性能指标完全符合环保要求，用它生产出来的粮食、蔬菜、水果等农副产品
第二章临床分子生物学检验标志物 1、分子生物标志物:指可以反映机体生理,病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子,就是生物标志物的一种类型。 2、中心法则:指遗传信息从DNA传递给RNA,再从RNA传递给蛋白质,即完成遗传信息的转录与翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA,即完成DNA的复制过程。这就是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)与在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)就是对中心法则的补充。 3、基因组:就是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质,包括基因与非编码DNA。 4、原核生物基因组特征: 1)原核生物基因组较小:大小一般在106—107碱基对之间; 2)原核生物的类核结构:原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区,没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下,以一定的形式盘曲,折叠包装起来,形成类核; 3)原核生物的操纵子结构:原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号,共同组成了一个基因表达单位,即操纵子结构; 4)原核生物的结构基因:原核生物的结构基因中无内含子成分,多数就是单拷贝基因,基因与基因之间有重复序列存在; 5)具有编码同工酶的基因:这类基因表达产物的功能相同,但基因结构不完全相同; 6)含有可移动DNA序列:可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组,改变生物体的遗传性状,使生物体更适应环境的变化; 5、质粒:指细菌细胞染色体以外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子; 6、人类基因组包括细胞核内的核基因组(3X109bp)与细胞质内的线粒体基因组(16569bp),人类基因组中存在大量的非编码序列与重复序列; 7、小卫星DNA:由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次,形成的1—5bp 的短DNA,又称可变数目串联重复; 8、微卫星DNA:核心序列为1—6bp,可以重复上百次,又称短串联重复; 9、多基因家族:指由某一祖先基因经过重复与变异所产生的一组基因,在多基因家族中,某些成员并不产生有功能的基因产物,这些基因称为假基因; 10、多态性:当某种变异相对常见,在群体中的频率高于1%时,则称为多态性,频率低于1%的
土壤棉花黄萎病分离方法 方案一、土壤稀释分离法 供试药剂：牛胆盐、链霉素、1%六偏磷酸钠、 供试仪器： 一、培养基制备 马铃薯200g，琼脂17g，葡萄糖g，蒸馏水1000ml，高压灭菌冷却至45℃时，按每100ml 培养基分别加入牛胆盐和链霉素各50mg。 二、土样选择 选取棉花耕作层0~20cm层内土样(此区域内微菌核数量与田间病害发病有密切联系)。 三、分离方法 1、洗涤微菌核取自然风干过筛的病田土样100mg，置盛200ml含有1%六偏磷酸钠无菌水的三角瓶内，摇动10min后，静止5min，弃去清液，留残渣液20ml于瓶底，连续洗涤5次。将最后一次的20ml残渣液置于培养基上，每皿1ml，均匀涂抹于表面，24℃左右培养10~15d。 2、观察微菌核肉眼从培养皿背面看到菌落时，用蜡笔做出标记，再用低倍显微镜观察鉴定，将显微镜下确认的棉花黄萎病菌微菌核移出纯化。 （棉田土壤黄萎病菌微菌核的研究，吕金殿，杨家荣，吉冉中）1990 方案二 真菌、细菌、放线菌、霉菌土壤稀释分离法 供试药剂： 供试仪器：玻璃珠。 1．取土壤 取表层以下5—10cm 处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。 2．制备稀释液，土壤稀释法，(要无菌操作) (1) 制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底为最好)，振荡5—10min使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。 (2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0．5mL．放入4．5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3一10-8的稀释液(真菌10-3~10-1)。 注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1 支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。 （微生物实验指导） 方案三、水筛法分离及微菌核计数方法 供试药剂：NaNO ，MgSO4?7H2O，K2HPO4，Fe2(SO4)3?7H2O，KCl，氯霉素，井冈霉 3 素， 五氯硝基苯，克菌丹，1%多聚磷酸钠，0.01%Tergitol—NPX。 供试仪器：组织搅拌器（8000r/min），0.125mm筛网，0.0385mm筛网。 一、制备培养基 棉选一号
16S rDNA鉴定细菌的方法 细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分： 1.提取细菌基因组DNA, 2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。 3.琼脂糖凝胶电泳分离 4.胶回收目的片段 5.目的片段测序。 6.BLAST比对获取相似片段。 7.构建系统进化树 试剂： 1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。）。 2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。 3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。 4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。高温高压灭菌，室温保存。1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。 5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。室温保存。用之前在65℃溶解。配置时要戴口罩。 6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。 7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。用之前在65℃溶解。 8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。 9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。 10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。 11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。 12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的 基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46, XX（XY）/47 ，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14 ，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。 分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法 6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析 等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、 F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。 珠蛋白合成障碍性贫血有六种，主要的两种是a珠蛋白生成障碍性贫血和B珠蛋白生成障碍性贫血，基因突变是主要发病原因。&基因多态性有哪些的临床应用？（P4）
分子生物学检测技术简介 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述：具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。 2、Northern 印迹杂交基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和
临床分子生物学检验试题 一填空题 1. 核酸的最大紫外吸收波长在，蛋白质的最大吸收波长在。 2. 双链DNA 中的碱基对有，。 3. 根据分子和结构不同，RNA 可以分为，，，。 4. 核酸变性过程中,紫外光吸收达到最大值50%时温度称为,其主要与核酸 的最终含量有关. 5. DNA 水解后主要产物是, , 。 6. 核酸（DNA 和RNA ）分子除含 有，，，四种元素外，还含有大量的元素。 7. PCR 技术是当今分子生物学使用最多的技术之一，它一般都有，，三 个基本反应步骤构成。 8. 核酸水解后首先得到核苷酸，核苷酸可以继续水解得到和。 9. 通用遗传密码中代表终止密码的三种密码 是UAA 、和。 10. P CR 方法扩增DNA 片段是，在反应中除了用该DNA 片段作为模板外，尚需加入、 和。 11. 在DNA 分子中还有大量的磷（P），P 的含量大约为。 二．判断题 1. 核酸变性时,碱基对之间的氢键断开,堆积力也受到破坏,共价键断裂. （） 2. 核酸杂交原理就是根据核酸分子间互补.（） 3. 在中性或碱性溶液中,核酸主要带正电 荷.（） 4. 核酸分子质量很大,因此核酸溶液具有很大粘性.（） 5. 分子杂交可以发生在任何只有互补核苷酸顺序两条单股核酸单链之间,如DNA/DNA 、DNA/RNA 、RNA/RNA 等.（） 6. 核酸水解后首先得到核苷酸，核苷酸可以继续水解得到核苷和磷酸（） 7. 在高分子溶液中一般球形分子比线形分子的具有较大的粘度。（） 8?核酸的最大吸收波长在280nm，而蛋白质的最大吸收波长在260nm。（） 9?酚一氯仿提取法是我们在提取DNA时所用的经典方法，现在仍然被许多实验室所采用。（）10. 组成RNA的四种碱基是腺嘌呤（A ）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）。（） 11. PCR技术是以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增技术。（） 12. PCR技术是现在常用的一种扩增技术，它的基本步骤的顺序是退火、变性、延伸。 （） 13. 免疫印漬技术及Southern Blotting是一种印漬技术和抗原抗体反应结合的技术（） 14. 在临床基因扩增检验诊断实验室工作的实验操作人员必须经过业务培训并取得上岗证书（） 15. 无论是DNA还是RNA，在多核苷酸链 内既有酸性的磷酸基又有碱性的含氮杂环碱，因此核酸是两性电解质。（） 16. 在PCR 实验中，退火是指在极端的PH 和受热条件下，核酸分子中的氢键断裂， DNA 双螺旋解开的一个过程。（） 17. 临床基因扩增诊断实验室的设置必须遵 循一定的原则，而这些基本原则制定的主要依据就是使建立的基因扩增诊断实验室结果的准确性能够得到保证，能忠实的反映被检的临床样本的真实情况。（ ） 二选择题 1. 核酸在波长为260nm 光吸收强度大小排列正确的是（） A. G>A>T>C B.A>T>G>C C.C>G>T>A D.G>C>A>T 2．鉴别RNA 靶分子的杂交是（） A Southern Blot B Northern Blot C Western Blot D 斑点杂交 3. 在做RNA 检测时，我们对全血抗凝最好用下列哪种抗凝剂（） A. 肝素 B. EDTA-K2 C. EDTA-Na2 D. 草酸钾
须保持在15℃以下。如有异常现象,尽快采取翻堆或通风降温等措施。袋装棉子须堆垛成行,行间留走道,如堆放面积大,应设置通风蔑笼。 棉子入库前,首先应对仓库全面检查,确定仓库门窗关闭是否灵活,隔热和密封效果是否完好,监控仓库温、湿度的仪表是否能正常工作等。其次是清仓和消毒。清仓和消毒是防止品种混杂和病虫孳生的基础。清仓不仅将仓内不同品种的棉花种子、杂质、垃圾等全部清除,还要清理仓具、输送管道以及铲除仓外的杂草等。空仓消毒可用敌百虫或敌敌畏等处理。 我国地域广大,贮藏方式应因地制宜。华北地区冬春季温度较低,棉子水分在12%以下,已适宜较长时间保管,贮藏方式可以用露天围囤散装堆藏;冬季气温过低,须在外围加一层保护套,以防四周及表面棉子受冻。水分在12%～13%以上的棉子要注意经常性的测温工作,以防发热变质。如水分超过13%以上,则必须重新晾晒,使水分降低后,才能入库。棉子要降低水分,不宜采用人工加温机械烘干法,以免引起棉纤维燃烧。 华中、华南地区,温湿度较高,必须有相应的仓库设备,采用散装堆藏法。安全水分要求达到11%以下,堆放时不宜压实,仓内须有通风降温设备,在贮藏期间,保持种温不超过15℃。 3包衣棉子的贮藏方法 由于用剩下的包衣种子带有剧毒农药,无法转商,只能深埋处理,既浪费种子,又会污染环境。 根据研究,只要认真做好安全贮藏,种子发芽率和田间出苗率仍能基本保持原有水平,翌年仍能使用,既节约种子,又增加经济效益,因此,做好包衣棉子的越年保存是很有意义的。 包衣棉子的贮藏应注意以下特点和方法: 3.1脱绒包衣棉种易于在夏秋两季吸潮、发热、降低发芽率。因此,必须降低水分,并防湿包装,堆成通风垛,在种垛上、中、下各处均匀放置温度计,掌握温度的变化情况。高温潮湿季节须每天检测1次,棉子温度须保持在20℃以下。如有异常,迅即采取倒仓或通风降温等措施,最好放入低温库保存,以确保种子安全越夏。 3.2脱绒包衣棉子种皮脆、薄、机械损伤多,如压力一大,往往出现种皮破裂的情况。因此,仓贮中袋装种子高度不应超过2m。 3.3包衣棉种带有剧毒,会发出刺激性气味,仓内不应贮藏其他种子。同时,应注意人身安全,以防中毒。 ● 防治棉花黄萎病的最佳药剂及其方法 邢光耀 (聊城大学农学院,山东252000) 棉花黄萎病是棉花的一种毁灭性的病害。由于棉花对黄萎病最敏感的时期是在棉花的2～6片真叶期,而其发病的主要时期是在棉花现蕾后,所以一旦发病就很难进行防治。根据近年来对棉花黄萎病的防治实践,总结出了以下药剂防治措施: 1播种前进行药剂拌种 对没包衣的种子可用占种子量0.8%的50%的多菌灵WP(或30%的苗菌敌WP,或70%的甲基托布津WP)或者用占种子量0.2%的20%的三唑酮(粉锈宁)EC{或12.5%烯唑醇(速保力)WP 或10%的苯醚甲环唑(斯高、金麦客)W G}拌种,每100kg种子用水2～3kg。 2苗期防治 由于棉花黄萎病对棉花的侵入主要是在棉花收稿日期:20062102252～6片真叶期,所以棉花苗期用药主要是防止病原菌的侵入。在棉花2～6片真叶期可用800倍的天达2116(壮苗专用型)+70%的恶霉灵WP2000倍液,也可使用天达2116(壮苗专用型)+80%的绿亨2号700～800倍液(或+70%的甲基托布津WP800倍液、30%的苗菌敌WP800倍液、50%的多菌灵WP600倍液)混合喷雾,不但可较好地防治棉花黄萎病,而且对棉花苗期病害也有很好的作用。注意不要单独使用棉花专用型的天达2116,否则会造成棉苗卷叶。 3蕾铃期防治 在棉花黄萎病的发病初期,可选用枯萎克星500倍液、黄腐酸盐600倍液、70%的恶霉灵WP2000倍液或70%的甲基托布津WP800倍液对发病的棉株灌根2～3次,200～250mL;同时可任选一种以上杀菌剂+稀释800倍的天达2116+1～2%的尿素+0.2%的磷酸二氢钾混合喷雾,每隔7～10天一次,不但对棉花黄萎病有较好的防治效果,而且也可兼治棉花后期早衰及棉红(黄)叶枯病。 ● ? 7 1 ?
分子生物学检测技术 分子生物学诊断技术是现代分子生物学与分子遗传学取得巨大进步的结晶，是在人们对基因的结构以及基因的表达和调控等生命本质问题的认识日益加深的基础上产生的。近年来，分子生物学诊断技术的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析等方法。1985年由美国Cetus公司人类遗传学研究室Mullis等创立并随后迅速发展起来的DNA 体外扩增技术（Polymerase Chain Reaction, PCR），以及90年代发展起来的DNA芯片技术（DNA Chip），又将分子生物学诊断技术提高到一个崭新的阶段。 一、核酸分子杂交 （一）概述： 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。到目前为止，分子杂交技术在基因诊断中仍占重要地位，它按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种，前者应用较广，有Southern印迹杂交、点杂交、夹心杂交（三明治杂交）、原位杂交和寡核苷酸探针技术等。核酸分子杂交主要涉及两个方面：待测的DNA 或RNA，以及用于检测的DNA或RNA 探针。探针标记的好坏决定检测的敏感性。 1、Southern印迹杂交 是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态。
2、Northern 印迹杂交 基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。由于mRNA比DNA更易受到各种因素的降解，所以整个操作过程须特别小心。 3、斑点杂交 将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有简捷快速的特点，一次可做大批量样品的筛查，适于流行病学调查和感染性疾病外源性致病基因的检测。目前斑点杂交技术在各实验室中得到较普及的应用。该技术可用来分析待测核酸片段中是否存在与探针同源的序列，同时还可半定量反映样品中的模板含量。其原理包括将提取的核酸片段变性后转移并固定于支持膜上，通过预杂交以除去非特异位点，然后以标记探针进行杂交。标记物有多种，以同位素标记的探针杂交后，可通过放射自显影分析结果，而以非同位素(如生物素、地高辛等)标记的探针杂交后，需加入对应的酶标记物(如亲和素、地高辛抗体)，再经过显色反应后，利用光密度扫描仪进行量化检测。本方法特异性可靠，但灵敏度偏低，而且操作复杂，因此大大限制了该技术的普及应用。 4、分支链DNA(bDNA)技术 近几年，bDNA作为核酸直接量化检测技术已广泛应用于HBV、HCV和HIV等的研究。该方法主要是通过将磷酸化的捕获探针以共价键的形式结合在固相载体上，然后依次加入待测核酸和悬挂有多个支链的信号探针进行杂交，每个支链DNA都结合有放大信号的分子(如碱性磷酸酶)，最后通过利用化学发光检测核酸的含量。bDNA技术是目前核酸直接量化检测技术中灵敏度最高的方法之
湖北医药学院2011-2012学年二学期 课程考试试卷答案(D卷) 课程名称：分子生物学检验技术考试时间：120分钟年级：xxx级 专业： xxx 题目部分，（卷面共有65题，100分，各大题标有题量和总分） 一、A型题（40小题，共40分） 1、人类朊病毒基因定位于 A、2号染色体 B、8号染色体 C、9号染色体 D、20号染色体 E、24染色体 答案：D 2、关于Col质粒下列哪项不对 A、可以产生大肠埃希菌素 B、分子量的范围波动很大 C、可以决定细菌的性别 D、小的Col质粒不能自传递 E、大的分子量可达6×10的7次方Da，属自传递型质粒 答案：C 3、大肠埃希菌tRNA基因的特点是 A、已鉴定的大肠埃希菌tRNA基因约有60个拷贝 B、转录单位在500bp以上 C、tRNA基因集中在染色体复制终点附近 D、转录单位大小不同，一般含有5～6个tDNA E、tRNA的拷贝数较多 答案：A 4、下列哪项不是端粒的功能 A、维持染色体的稳定 B、防止染色体重组 C、有丝分裂时染色体分离 D、细胞的生长 E、基因的调控 答案：E 5、在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢方面具有重要作用的细胞癌基因是 A、sis基因 B、erb基因
C、src基因 D、ras基因 E、myb基因 答案：B 6、在酵母中也存在的细胞癌基因是 A、sis基因 B、erb基因 C、src基因 D、ras基因 E、myc基因 答案：D 7、人类结肠癌癌变的序列中哪一个发生最早 A、ras的突变 B、FAP的丢失 C、DCC的丢失 D、p53的丢失 E、c-myc基因的过度表达 答案：A 8、恶性肿瘤中最常见的基因突变是 A、APC突变 B、BRCA突变 C、DCC突变 D、p53突变 E、Rb突变 答案：D 9、与人类血小板衍生生长因子有很高同源性的细胞癌基因是 A、src基因 B、sis基因 C、ras基因 D、myb基因 E、myb基因 答案：B 10、对结缔组织细胞及神经胶质细胞的生长、分裂和分化有重要调控作用的细胞癌基因是 A、erb基因 B、ras基因 C、sis基因 D、src基因 E、myb基因 答案：C
棉花黄萎病 Cotton Verticillium Wilt 棉花黄萎病是棉花生产中最重要的病害，也是全国农业植物检疫对象之一。从1891年美国首次发现到如今，已遍布世界各主要产棉区。我国于1935年在由美国引进斯字棉时传入，后随棉种调运不断扩大。1973年普查，全国枯、黄萎病发生面积36.98万hm2，占统计棉田的10%；1977年发展为57.24万hm2，占统计棉田的12.12%；1979年增至71.17万hm2 ，占统计棉田的18.2%；1982年扩展到148.2万hm2，占当年植棉面积的31.26%；其中纯黄萎病田面积13万hm2,占病田面积的8.7%；截止20世纪80年代末，棉花黄萎病已遍及全国18个省、市、自治区的478个县（市）。进入90年代，黄萎病扩展速度更快，尤其1993、1995和1996年连续3年在全国范围内连续大发生，有些重病田病株率高达80%~90%，并出现成片病株落叶成光秆的棉田，损失相当严重。据估计，我国棉花黄萎病的发生面积每年大约为266.7万hm2，占全国植棉面积的一半，重病田133.3万hm2,每年损失皮棉约为200万担。黄萎病为害棉花造成的损失程度因症状类型、发病早晚及受害程度而不同，现蕾开花期发病损失率可达70.9%~88.8%；盛花期发病损失率为41.6%~48.6%，落叶型和急性萎蔫型黄萎病株易死亡，损失更重；棉花黄萎病已成为我国棉花持续高产稳产的主要障碍。 症状
黄萎病一般在现蕾后才开始发生，开花结铃期达高峰。其症状主要分为如下类型。 普通型：病株症状自下而上扩展。发病初期在叶缘和叶脉间出现不规则形淡黄色斑块， 病斑逐渐扩大，从病斑边缘至中心的颜色逐渐加深，而靠近主脉处仍保持绿色，呈“褐色掌状斑驳”，随后变色部位的叶缘和斑驳组织逐渐枯焦，呈现“花西瓜皮”症状；重病株到后期叶片由下向上逐渐脱落、蕾铃稀少，后期常在茎基部或落叶的叶腋处长出细小新枝。开花结铃期，有时在灌水或中量以上降雨之后在病株叶片主脉间产生水浸状退绿斑块，较快变成黄褐色枯斑或青枯，出现急性失水萎蔫型症状，但植株上枯死叶、蕾多悬挂并不很快脱落。 落叶型：这种类型症状在长江流域和黄河流域棉区都已发现，危害十分严重。主要特 点是顶叶向下卷曲褪绿、叶片突然萎垂，呈水渍状，随即脱落成光秆，表现出急性萎蔫落叶症状。叶、蕾，甚至小铃在几天内可全部落光，后植株枯死，对产量影响很大。 上述不同症状的黄萎病株，其根、茎维管束均变为褐色，但较枯萎病变色浅。 由此可见，枯萎病和黄萎病的主要区别是：枯萎病发病早，出苗后即可发生，现蕾期达发病高峰；黄萎病发病较晚，一般在现蕾期才开始发生，花铃期达高峰。枯萎病症状可由下向上发展，也可沿顶端向下发展形成“顶枯症”；黄萎病的症状则一般由下而上逐渐向上发展，不形成顶枯症。枯萎病常引起植株明显矮化、枯死；黄萎病一般不产生严重矮化和早期死亡。枯萎病叶脉可变黄，呈黄色网纹症；黄萎病没有叶脉变黄的症状。枯萎病维管束变色较深，黄萎病维管束变色较浅。 维管束变色是鉴定田间棉株是否发生枯、黄萎病的最可靠方法，也是区分枯、黄萎病与红（黄）叶枯病等生理病害的重要标志，所以对其怀疑时，可剖开茎杆或掰下空枝（或叶柄）检查维管束是否变色。另外，在枯、黄萎病混生病田还可经常看到黄萎病和枯萎病发生在同一棉株上，称为同株混生型病株。以枯萎病为主的混生型病株，主茎及果枝节间缩短，株型常丛生矮化，病株大部分叶片皱缩变小，叶色变深或呈现黄色网纹的典型枯萎症状，但在病株中下部叶片叶脉间呈现黄色掌状斑驳或掌状枯斑的典型黄萎病症状。以黄萎病为主的混生型病株，大部分叶片呈现块状斑驳或掌状枯斑的典型黄萎病症状。但顶端叶片皱缩、叶色加深，有时个别叶片也呈现黄色网纹的典型枯萎症状。 病原 学名：世界上引起棉花黄萎病的病菌有2个种，即大丽轮枝菌Verticillium dahliae kleb 和黑白轮枝菌Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold，它们都属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。两种菌的主要区别是：大丽轮枝菌形成各种形状的黑色微菌核，而黑白轮枝菌产生黑色休眠菌丝。大丽轮枝菌在30℃下能生长，而黑白轮枝菌则不能生长。大丽轮枝菌分生孢子梗基部是透明的，而黑白轮枝菌分生孢子梗基部暗色。这一特点在寄主组织上明显，而人工