植物与病原物互作相关基因
Plant and Pathogen Interaction Relative Genes
yog
摘要植物与病原菌互作是一个复杂的过程本文从分子生物学角度分别对植物和病原物在互作过程中起重要作用的相关基因Avirulence gene, Resistance gene, Hrp gene, Harpin binding protein gene及其产物进行了介绍并试图将他们归纳到一个完整的模式中
关键字植物病原物互作基因, avr, R gene, hrp, HrBP1
植物与病原物的互作类型受基因型组合调控并与生化特征相关在寄主抗病/感病等位基因和病原物的无毒/毒性基因互作中寄主抗病基因和病原物无毒基因都为显性在自然状况下植物抗病表型是普遍的而感病表型仅在特定情况下发生一种病原物所能侵染的植物在植物界总是少数多数植物是非寄主对病原物侵染表现抗性反应
图1. 植物表现感病或是抗病取决于病原物的致病因子和植物防御之间的竞争病原物致病因子强于植物的防御反应则植物表现感病病原物致病因子弱于植物的防御反应则植物表现抗病
在经典遗传学中植物与病原物互作被看作是由基因型控制的植物抗病性常常是由来源于植物的抗病基因R resistance与相应的来源于病原物的无毒基因avr avirulence 互作所决定的即基因对基因学说gene-for-gene theory Flor, 1971这种病原物与寄主之间的基因对基因的识别机制被描述为受体-配体模式见图2a 另外一类的非小种特异性的互作就是由hrp基因簇编码的harpin蛋白与harpin蛋白的受体互作引起植物非特异性的防卫反应图3
图2基因对基因模式的生化图解
a经典的受体配体模式Avr蛋白与相匹配的R蛋白之间直接互作引起防卫反应 (b)共受体模式Avr 蛋白首先连接到一个共受体的高度亲和位点上(C), 后者与R蛋白互作激发防卫反应(双箭头表示) (c)看守模式抗病蛋白保卫着相应的致病性靶标(P). (d) 依赖于蛋白酶的防卫激发反应有几种细菌真菌和病毒的avr 基因编码蛋白酶,它们对寄主蛋白的裂解作用诱导了植物的防卫反应
R, R蛋白; X, 蛋白酶靶标; AP, 非原质体; PM,质膜; CY,细胞质.
图3 植物与病原物互作的分子作用机理
下面我们将分别介绍植物与病原物互作过程中几类重要的基因及其产物
一病原物无毒基因及其产物
基因与基因互作中病原物的无毒基因是指与寄主抗病基因互作其产物是与寄主抗病基因产物互补的基因Keen et al.,1990无毒基因是决定对寄主植物特异性不亲和的基因也称为寄主专化性基因或反向调节寄主范围的基因在病原物与寄主植物之间存在的基因对基因关系中病原物无毒基因产物与寄主中相应抗病基因产物互作从而导致不亲和反应使病原物在植物中的定殖和扩展受到抑制甚至在侵染初期就破坏了亲和关系病原物无毒基因主要决定对植物不同品种的无毒性有时也决定对不同种植物的无毒性
从植物病原细菌真菌和病毒中都发现存在与相应的寄主植物抗病基因互作的无毒基因一般认为无毒基因编码的特异性激发子是与抗病基因产物受体特异性结合的配体Gabriel et al.,1990
无毒基因直接或间接产物作为激发子与相应抗病基因产物识别并诱导寄主的防卫反应
从而表现小种品种互作的不亲和性无毒基因失活或缺乏相应的无毒基因则表现小种品种互作的亲和性反应目前发现的所有无毒蛋白都是由hrp基因簇编码的型通道系统所分泌的利用农杆菌在植物体内表达avr基因可以引起依赖于R基因的HR这间接的表明无毒蛋白是被转运至植物细胞内
1细菌的无毒基因
无毒基因存在与否决定着病原菌能否入侵含相应抗病基因的寄主植物或入侵后细菌能否大量增殖典型的诱导抗病性反应是过敏性反应HR它引起一种快速局部的细胞死亡
伴随着受侵染植物组织中的细菌生长受抑制迄今为止已有超过40种细菌的无毒基因被克隆测序这些无毒基因主要来源于假单胞属Pseudomonas和黄单胞属Xanthomonas Vvivan et al.,2000它们位于染色体或质粒上编码亲水性可溶蛋白并不具有典型
的信号肽大部分无毒基因只存在于特定病原菌中的某些小种中它们的缺失并不导致致病性的丧失尽管很多细菌的无毒基因已分离到但是除了avrBs3和avrRxv/yopJ(YopJ, Yesinia protein J)家族外大部分没有或只有很少的同源性
1 1 avrBs3基因家族
avrBs3是avrBs3基因家族中第一个被发现的基因它来源于Xanthomonas
campestris pv. v esicatoria X.c.v编码一个1.22104的蛋白质具有17.5个完全相同的34个氨基酸序列重复avrBs3基因家族分布于Xanthomonas和Ralstonia solanacearum http: //sequence.toulouse.inra.fr/R.solancearum avrBs3家族中
有一些基因具有双功能avrBs3基因家族成员有以下共同点它们可以在抗性寄主上引起HR Bonas et al.,1989De Feyter et al.,1993在感病寄主上加重水渍状症状或引起溃疡状/肿瘤状毒性症状Yang et al.,1994Swarup et al.,1991它们具有序列同源性
Bonas et al.,1993Hopkins et al.,1992avrBs3基因家族成员在结构上的一个典型特征是它们在其中心区域都含有一个由34个氨基酸串联的重复区域它们的不同在于重复单元的数目不同13.5-25.5个Lahaye et al.,2001见图4a
图4
(a) X.c.v的AvrBs3无毒蛋白结构, 中心区域由17.5 几乎一样的34个氨基酸重复构成. C末端含两个有功能核定位信号(NLS) 和一个酸性转录激活区(AAD)(b) 决定AvrBs3类蛋白的毒性与无毒性的分子机制理论模式AvrBs3类蛋白通过细菌的III 型泌出系统转运进植物细胞NLSs与importin 互作, 后者又与importin 结合将AvrBs3类蛋白运输到核内AvrBs3通过和DNA的直接或间接互作来调节寄主的转录AvrBs3及其同源物的识别常常依赖于NLSs, 这暗示着相应的R 蛋白[e.g. 辣椒( Capsicum annuum) Bs3]是存在于核中的但是有一些R蛋白可能是在细胞质中识别AvrBs3类蛋白(e.g. 番茄的Bs4). HR, hypersensitive response.
1. 2 AvrRxv/yopJ家族
已经分离的R基因编码的蛋白产物有着结构上的相似性例如富含亮氨酸重复Toll-白介素-1受体类功能域Ser/Thr激酶等在昆虫和哺乳动物寄主防卫反应途径中也发现这些功能域Staskawicz et al.2001Dangl et al.2001Cohn et al.2001因此在进
化中来源于共同祖先的植物和动物可能拥有一种天生固有的免疫能力Hoffmann et
al.1999有意思的是有一类型分泌系统的效应子在动物和植物病原物中都是保守的
Galan et al.1998AvrRxv/yopJ 家族中最先分离到的成员是来源于植物病原物
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria 的 AvrRxv 和来源于 Yersinia Pseudotuberculosis 的 YopJ Lahaye et al.2001该家族还包括哺乳动物病原菌Y.
enterocolitica [YopP (Mills et al.1997)]
植物病原菌X.c.v [AvrBsT(Ciesiolka et
al.1999)AvrXv4(Astua-Mconge et al. 2000)]Pseudomonas
syringa e[ORF5(Alfano et al.2000)AvrPpiG(Arnold et al.2001)]
Erwinia
amylovora Bogdanove et al.1998以及植物共生菌Rhizobium spp.[y410(Freiberg et al.1997)]
2 .病毒的无毒基因 植物病毒的无毒基因编码着病毒的重要组分例如病毒衣壳蛋白复制酶蛋白以及运
动蛋白等病毒基因产物的确定主要是通过2种方法一是通过对能克服抗病基因功能的病毒株系及引起过敏性反应株系的序列比较分析
二是人为构建能引起HR 的病毒基因的结构突变观察在植物体内表达后是否导致过敏性反应的发生
研究发现一种病毒可诱发多种植物产生HR 同种病毒无毒因子可以诱导不同的抗病基因介导的HR 如胡椒轻型班驳病毒Pepper mild mottle virus 的外壳蛋白诱导胡椒抗病基因L 2和L 3介导的HR 这些不同的抗病蛋白是否识别同一外壳蛋白的不同位点有待进一步证实此外氨基酸序列差异大血清学上相关性小的不同病毒外壳蛋白均可诱发同一抗病
基因介导的HR 如TMV 齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus, ORSV 和黄瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV 的外壳蛋白均可
诱导N. sylvestris N’介导的HR Taraporewala et al.1997
3.真菌的无毒基因
迄今只从为数不多的几种真菌中克隆到了一些无毒基因,主要是由于缺乏简便有效的克隆方法目前得到的少数基因也多数是通过反向遗传方法克隆得到的大部分真菌avr 基因是从能在植物组织胞内定殖的真菌中克隆到的Lauge et al.,1998与病原物的定殖一样这些Avr 蛋白被注射到胞间区域外质体中可诱导HR 反应 主要包括番茄叶霉菌Cladosporium fulvum 无毒基因a vr9和a vr4稻瘟菌
Magnaporthe grisea 无毒基因AVR-Pita 以前被称为Avr2-YAMO 第二类无毒基因编码物种特异性抗性激发子称为PWL 激发子以及大麦云纹病菌 Rhynchosporium
secalis 无毒基因另外其它真菌的无毒基因的克隆也在进行之中包括编码豇豆锈菌
Uromyces vignae 品种特异性激发子的基因亚麻锈菌M. lini 无毒基因
十字花科黑胫菌Leptosphaeria maculans 无毒基因a vrLm 1以及M. grisea 无毒基因avr 1-Co 39avr1-MARA avr1-Irat 7avr1-Mednoi 和avr1-Ku 86Lauge et al.1998Dioh et
al.2000
4卵菌无毒基因
卵菌是完全不同于真菌的真核植物病原生物Elicitin 蛋白是一类由疫霉属Phytophthoa和腐霉属Pythium的某些种产生的低分子量蛋白其中有些已被证实
具有无毒激发子活性
5在植物防卫反应中的蛋白酶类Avr蛋白
有争议的是来源于病毒细菌和真菌病原物中的一些avr基因可能编码蛋白酶类基因图2d R蛋白可能是起防卫寄主蛋白的作用或者它们本身会受到蛋白酶裂解作用推测的AVR-Pita蛋白酶和Pi-ta R蛋白可能就是后一种情况R蛋白含有蛋白酶酶切位点当酶切发生后它就会被切成为植物防卫反应的激发子也可能R蛋白组成防卫反应负调控因子并被AVR蛋白酶降解时就诱导了植物防卫反应图2d但是后一种模式不太可能大部分R 基因是显性而不是隐性的
二植物R基因及其产物
1不同结构的R基因介导相似的防卫反应信号传导过程
病原细菌在植物体内的特异性识别常常是由单个抗病基因R控制抗病基因是指基因对基因假说中寄主植物与病原无毒基因表现非亲和互作的基因它决定寄主植物对病原菌的专化性识别并激发抗病反应
人们已发展了一些成功克隆抗病基因的方法这些方法主要有差异表达克隆法G.
Bruening et al., 1988, 染色体步查法J. L. Dangl, 1991,功能互补法(Keen et al., 1990)图位克隆法(Bent et al., 1994; Dong et al., 1991; Martin et al., 1993; Mindrinos et al., 1994Ronald et al., 1992; Salmeron et al., 1993; Whalen et al., 1991)转座子标签法(Johal et al., 1992; Jones et al., 1994; Lawrence et al., 1994; Meeley et al., 1992; Padgett, et al., 1993; van den et al., 1992; van Kan et al., 1991; Whitham et al., 1994)及异源基因克隆法等
到目前为止已克隆的植物抗病基因有30多个(Hulbert et al., 2001)根据它们保守的结构域特征可以将其分成七种类型(表1)LZ-NBS-LRR TIR-NBS-LRR
NBS-LRR LRR-TM S/TK LRR-TM-S/TK TM-TM-TM-TM-TM-TM大多数抗病基因的结构与其对病原物的识别及信号传导激活下游防卫反应的功能是一致的根据对R基因产物中共同结构的分析推测R基因在对病害抗性过程中在识别和信号传
递中起重要的作用在识别作用中亮氨酸重复LRR Dangl et al.2001Holub et
al.2001被认为是受体蛋白LRRs 可介导蛋白质蛋白质的互作Kajava et al.1998信号传导过程有关的R 蛋白结构还包括核苷酸结合区NB
TIR(Toll/interleukin-1-receptor)和LZ
Structure R Gene Plant Pathogen Avr Gene References Species
LZ-NBS-LRR
RPS2 Arabidopsis Pseudomonas avrRpt2 Dong
et al., 1991; syringae pv. tomato Whalen
et al., 1991; Bent
et al., 1994; Mindrinos
et al., 1994. RPM1 Arabidopsis Pseudomonas avrRpm1 Grant
et al., 1995 syringae pv. maculicola avrB
Prf Tomato Pseudomonas avrPto Salmeron
et al., 1996 syringae pv. tomato
Mi Tomato Meloidogyne spp. ---- Mulligan et al., 1998
RPS5 Arabidopsis Pseudomonas avrpphB Warren
et al., 1998 syringae pv. tomato
RPP8 Arabidopsis Peronospora avrPp8 McDowell
et al., 1998 parasitica
Rx1 Potato Potato virus X PVX
Abdelhafid et al., 1999 RPP13 Arabidopsis Peronospora avrPp3
Bitter-Eddy et al., 2000 parasitica
Rx2 Potato Potato virus X PVX Abdelhafid
et al., 2000 Mla1 Barley Erisyphe graminis avrMla1 Zhou
et al., 2001 f. sp. hordei
Mla6 Barley Erisyphe graminis avrMla6
Halterman et al., f. sp. Hordei
Yr10 Wheat Puccinia striiformis ---- Unpublished
TIR-NBS-LRR
N Tobacco Tobacco mosaic virus replicase? Whithams
et al., 1994 L 6 Flax Melampsora lini AL 6 Lawrence
et al., 1995 M Flax Melampsora lini AM Anderson
et al., 1997 RPP5 Arabidopsis Peronospora avrPp5 Parker
et al., 1997 Parasitica
RPP1 Arabidopsis Peronospora ---- Botella
et al., 1998 parasitica
RPS4 Arabidopsis Pseudomonas avrRpt4 Hinsch,
et al., 1996 syringae pv. tomato Warren et al., 1999
Structure R Gene Plant Pathogen Avr. Gene References
Species
NBS-LRR
I2C Tomato Fusarium oxysporium ---- Ori et al., 1997
f. sp. Lycopersici
Xa-1Rice Xanthomonas ---- Yoshimura et al., 1998
oryzae pv. oryzae
Rp1-D Maize Puccinia sorghi ---- Collins et al., 1999
Bs2Pepper Xanthomonas campestris avrBS2 ai et al., 1999
Pi-b Rice Magnaporthe grisea ---- Wang et al., 1999
Pi-ta Rice Magnaporthe grisea avrPita Bryan et al., 2000
LRR-TM
Cf-9Tomato Cladosporium fulvum avr9 Jones et al, 1994
Cf-2 Tomato Cladosporium fulvum avr2 Dixon et al., 1996
Cf-4Tomato Cladosporium fulvum avr4 Thomas et al., 1997
Hsl pro-1 Sugar beet Heterodera schachtii Unknown Cai et al., 1997
Cf-5Tomato Cladosporium fulvum avr5 Dixon et al., 1998
Toxin reductase
Hm1Maize Cochliobolus carbonum none Johal et al., 1992 S/TK
Pto Tomato Pseudomonas avrPto Martin et al., 1993
syringae pv. Tomato
LRR-S/TK
Xa-21Rice Xanthomonas Unknown Song et al., 1995
oryzae pv. Oryzae
TM-TM-TM-TM-TM-TM
Mlo Barley Erisyphe graminis Unknown Buschges et al., 1997
f. sp. Hordei
Note: LZ, leucine zipper; NBS, nucleotide binding site; LRR, leucine rich repeat; TM, transmembrane domain; S/TK, serine/threonine kinase; TIR, Toll and interleukin-1 receptor.
表1 已克隆的植物抗病基因
2R蛋白的结构决定功能
R基因编码的蛋白有2个作用首先是识别来源于病原物的信号第二启动配套的植物防卫反应R蛋白有一个调节结构来确保它们在信号的感应转导过程中的功能在水稻Xa21 Xanthomonas campestris抗病基因21抗病基因和拟南芥BRI1油菜素类固醇不敏感基因1基因之间进行功能域转移后者编码一个油菜素类固醇受体Xa21蛋白和BRI1
蛋白均含有胞间LRRs结构和一个胞外激酶功能域杂合蛋白质含有BRI1的LRR区和Xa21的激酶区在油菜素类固醇的作用下杂合蛋白质可激活防卫反应He et al.2000这表明这类R蛋白的同源功能域代表了一种功能性调节因子
NB-LRR与胞间LRR结构的两种R蛋白序列比较分析表明特异性识别主要位于LRRs 区Parniske et al.1997但是对于拟南芥NB-LRR抗性基因PRS的研究中发现LRR 的突变抑制了多种R基因的功能这说明LRs不仅在感应信号上起作用而且在下游信号传导中也起作用Warren et al.1998很多证据表明NB-LRR R蛋白并不是仅仅由一些单独的功能单元构成有可能一个NB-LRR蛋白是由不同共进化的区域构成的而且信号感应和传导需要分子间的互作
3Avr与R分子亲和性及R-信号组分
细菌的Avr蛋白在抗性植物细胞中激发HR这说明它们可能直接与植物细胞中相应的R 基因编码的蛋白互作R蛋白与相匹配的Avr蛋白据推测位于亚细胞位置上这2个组分在空间上相互依赖例如细菌Avr蛋白大部分可能是通过型泌出系统被注射进寄主的细胞质中这与大部分相应的R蛋白可能位于细胞质的推测相吻合相反来源于非侵入
mon-invasive型真菌Cladosporium fulvum的Avr9则被分泌到外质体Joosten et
al.1999这说明在相应的R蛋白Cf-9上有一个跨膜功能域和一个胞间LRR结构据推测很多对有吸器的真菌和卵菌类病原物有抗性的R蛋白是位于细胞质的这说明微生物将Avr 蛋白转运至了植物细胞将来源于生长在胞间的真菌M. grisea的AVR-Pita在植物体内做表达那么在含有推测的细胞质Pi-ta R基因的植物上会引起细胞死亡
免疫细胞生化学可以用来研究Avr与R的亚细胞定位早期的生化作用来研究NB-LRR 蛋白RPM1对P. syringae sp. m aculicola 1有抗性它缺乏明显的亚细胞定位信号
但是却和质膜相关Boyes et al.1998AvrRpm1和AvrB都可诱导RPM-1专化性防卫反应它们具有保守的豆蔻酰化靶序列
豆蔻酸一种14-C脂肪酸可决定膜定位值得注意的是在AvrPpm1和AvrB中豆蔻酰化靶序列的存在对它们的无毒功能十分重要但是NDR1(非小种专化性抗病基因1)对于RPM1的功能是必需的它含有2个推测的跨膜功能域有可能在同一亚细胞位置上取代R Avr和R信号组分见图5
图5 Avr 和R 蛋白在不同的寄主病原物互作过程中的位置很多细菌的Avr 和相匹配的R 蛋白 都存在空间上的相互依赖性由于很多对真菌卵菌和线虫有抗性的R 蛋白据推测是位于细胞内的
这些病原物相应的Avr 蛋白很有可能被这些病原物转运到寄主的细胞质中
三病原物hrp 基因及其产物
hrp 基因hypersensitive reaction and pathogenicity gene 决定着革兰氏阴性植物病原细菌在非寄主植物上激发过敏反应能力hypersensitive response, HR 和在
寄主植物上的基本寄生性或致病性
parasitism or pathogenicity
Lindgren et al.(1986)用转座子诱变的方法从P. s. pv. phaseolocola 中鉴定出控制非寄主过敏性反应
和寄主致病性的基因-hrp 基因研究发现有些
hrp 突变体在寄主和非寄主植物上并不产生任何可
视反应在感病寄主上观测到
P.s.pv.syringae X.c.pv.vesicatoria
R.solanacearum 及E.amylovora 的hrp 突变体生长衰退现象和寄主上生长相比hrp 突变体并
不损害其在培养基中的生长能力而表现营养缺陷能在基本培养基上生长因此hrp 基因并不编码一般生长或代谢所需的产物九十年代初人们相
继从E.amylovora P.s.syringae P.s.tomato
R..solanacearum 等植物病原细菌中鉴定出hrp 基因簇
他还图6 由Harpin Ea 引起的烟草叶片的HR Wei et al.(1992)首先从E.amylovora 的
E.coli DH5的表达克隆中分离纯化到一蛋白类激发子Harpin Ea注射烟草叶片可诱导HR图6在以后几年里相继从P.s.syringae R..solanacearum P.s.tomato 中克隆到编码Harpin的基因并表达了Harpin蛋白(Harpin pss PopA1 Harpin pst Harpin Xoo Harpin Xooc)He et al.1993,Arlat et al.1994,He et al.1994Wen et al.2001)
1hrp基因簇
hrp突变体的遗传学分析表明, 在绝大多数植物病原细菌中的hrp基因簇由两部分构成一大的hrp基因簇长度为17~41Kb,如在P. s. pv. phaseolicola P.s.pv.vesicatoria E.amylovora和P.solanacearum中克隆的这些基因簇通常由许多转录单位组成, 如P.s.pv.syringae的hrp基因簇长为30Kb就由13个转录单位组成;另外一小的hrp基因簇长度只有2.5~4Kb, 与第一类大的hrp基因簇不相连, 已从P. s.pv. syringae P. s. pv. phaseolicola R. solanacearum和X. c.pv. campestris中鉴定得到如R.solanacearum中除22Kb的hrp基因簇外,还存在一个独立的由1.3Kb和0.7Kb两个转录单位构成的hrp位点这两类基因簇之间不存在同源性第二类hrp基因又被称为附属的hrp位点hrpM为这些附属hrp位点中的一个它在P. syringae
pv.syringae和P. syringae pv. phaseolicola中有同源性由两个ORFs组成编码的蛋白产物和E.coli mdoGH操纵子的产物非常相似用P. s. pv.syringae的hrpM可以互补E.coli的突变体, 据此, 可推断P.syringae的hrpM与寄主植物病原物互作中起作用的周质葡聚糖的合成有关hrpM突变体菌落粘性的改变也证实了这个设想大多数植物病原细菌的hrp基因存在于染色体上,而青枯假单胞的的hrp基因则存在于一个大质粒上
根据同源性比较将植物病原菌的hrp基因簇分成2组图7一组包括青枯假单胞和甘蓝黑腐黄单胞的致病变种,它们的hrp基因簇是共线性的,以相对较高的严谨度相互杂交,且同源性涉及到hrp基因的全长的大部分另一组包括丁香假单胞的致病变种和梨火疫病菌这一组细菌之间的hrp基因也具有同源性但两组细菌间的hrp基因都不存在同源性对植物病原菌hrp基因产物氨基酸序列分析,发现Hrp蛋白还与一些人和动物病原细菌致病决定因子具有高度的同源性
图7. 根据同源性比较将植物病原菌的hrp基因簇分成2组
2Hrp基因的调控基因
不同的病原菌的hrp调控基因有有所不同几个研究的较为清楚的包括
hrpS和hrpL是多元的调控系统的一部分负责hrp及avr基因表达
22. Erwinia amylovor a的调控系统E. amylovora含有与P. syringae的hrpS 和hrpL同源的基因表明这些病原细菌具有共同的调控元件但在E. amylovora和P. syringae hrpL间并无功能性的交叉互补因此虽然E. amylovora和P. syringae的
hrp调控系统具有类似的组分但两病原菌调控hrp基因的方式或许存在差异
2 3. Xanthomonas campestris的hrp基因调控X. campestris. pv.
vesicatoria的hrp基因调控不同于P. syringae的hrp基因hrpG和hrpX是编码调控X. c. pv. vesicatoria中hrp基因的调控蛋白基因这两个基因相互毗邻但并不与大的hrp簇直接相连其转录是从一趋异启动子区域处开始的图8另外hrp基因
表达并不需要rpoN基因Lindgren, 1997
图8 Xanthomonas campestris的hrp基因簇表达调控模式
X. campestris. pv. vesicatoria的hrpX编码一种调控蛋白是AraC家簇成员虽然hrpA的表达与hrpX无关但hrpB到hrpF的表达依赖于一种功能性Hrp X蛋白有趣的是hrpB hrpC hrpD和hrpF的启动子区域含有所谓的PIP (plant induceable promotor) 框其序列为TTCGC-N15-TTCGC现在认为它是Hrp X蛋白的结合位点
由于在hrpG突变体中所有其它hrp基因的表达被阻止现认为Hrp G是一种应答调控子并且是hrp基因活化调控途径中的第一个蛋白按这种模式Hrp G活化hrpX和hrpA的转录并且Hrp X随之活化剩余hrp基因的转录估计至少一种以上的蛋白与这种信号支路有关因为在X. campestris. pv. vesicatoria中已经鉴定出感受环境刺激物所需的双组分系统的环境感应蛋白Hrp G
2 4 R. solanacearum的hrp基因调控机制R. solanacearum的hrp基因调控机制中Hrp B作为调控蛋白而起功能其活化R. solanacearum6个中的5个hrp转录单元表达有趣的是X. c. pv. vesicatoria HrpX与R. solanacearum HrpB具40%的同源性和58%的相似性并且R. solanacearum hrpB能够部分互补X. c. pv.
vesicatoria hrpX突变体另外R. solanacearum的hrp基因及popA1基因中还发现了类似于PIP框的基序这些结果说明R.solanacearum和X. c. pv. vesicatoria的hrp调控系统具有共同特征Hrp G调控hrpB基因hrpG的表达受PrhJ(plant-regulated hrp)的调控PrhJ基因与转录因子Lux/JphA家族同源prhJ基因的表达受PrhA调控
prhA编码产物是细菌外膜蛋白的组分感应植物信号分子后转录于prhJ上水稻黄单胞菌中是否有类似情形还不清楚PrhJ与siderophore receptor具有同源性
3. harpin蛋白
1992年韦忠民(Z.M.Wei)等首先从E.amylovora中分离出一个激发过敏反应的蛋白,定名为Harpin Ea,大小为44kd由hrpN基因编码Harpin Ea具有以下分子特征1亲
水性2403个氨基残基长度分子量44kD 3对热稳定100摄氏度处理10分钟
不会使其失活4对蛋白酶K
和紫外线敏感5富含甘氨酸而缺少半胱氨酸6水溶
性酸性蛋白7无四级结构
名 称
来 源 编码基因 大小 出 处 Harpin Ech
E.chrysanthemi hrp N Ech 36kD Bauer D.W.1995 Harpin Ecc
E.c. pv. carotovora hrp N Ecc 36kD Mukherjee A.1997 Harpin Ea
E . amylovora hrp N Ea 44kD We Z.M.1992
Hrp W E. amylovora hrp W 42.9k D
D
Harpin Pst hrp Z 36.5k Preston G.1995
PopA1 PopA1 Arlat M.F .1994 vesicatoria
9 6
HrfA Xoo X. o. pv. oryzae hrpA Xoo 15.3k D
闻伟刚Charkowski
A.1998 Hrp W P.s. pv. tomato hrp W 42.9k Charkowski
A.1998
Harpin Pss P.s.pv. syringae
hrp Z 34.7k D
Preston G.1995 Harpin Psg P.s.pv .glycinea hrp Z 35.3k D Preston G.1995
P.s.pv. tomato D
Rolstonia
Solaniciarium
Hrp A1 X.c. pv. hrp A1 64kD Wengelink K.192001
HrfA X. o. pv. oryzicola hrpA 15.6k D
闻伟刚Xooc Xooc 2001
表2已报道的Harpin 类蛋白
Harpin 在hrp 系统表达时可分泌到培养基中注入烟草和几种其它植物时有激发HR
的激发子活性(Alfano J.R.et al.1996) E. amylovora hrp N 蛋白基因突变体HR 活性和e 致病性状明显减弱(Kim J.F .t al.1998)但几种P. syringae hrp Z 蛋白基因的突变体HR 表型变化不大或无(Alfano J .et al.1996,Charkowski A.O.et al.1998).R 说明有的病原菌可能含有多种Harpin
Eden 生物公司的研究小组最近的研究表明haprin 处理后会引起拟南芥中Cl, Ca, K, H, Cu, Zn 离子通道的激活以及各种氧化酶的激活包括ACC 合成酶Cu. Zn 超氧化物歧化酶基质抗坏血酸氧化酶Cu/Zn 超氧化物歧化酶Cu 分子伴侣前体等等这些因子在植物抗病信号通路中起着重要的的作用图9
图9 植物抗病信号途径
Harpin可以激活植物中多种信号通路可以分为三大类一类是与植物抗病性相关的信号通路的激活包括过敏性反应与细胞死亡离子交换通道水杨酸途径茉莉酸途径苯丙氨酸解氨酶介导的途径以及其他一些抗性基因介导的途径比较特殊的是存在一条不依赖于NPR1的能介导植物对细菌抗性的信号通路图10
图10 harpin介导的抗病相关信号途径的推测图
另一类是与促进植物生长相关的信号通路的激活Eden公司通过拟南芥的基因芯片分析了harpin处理后拟南芥基因表达的情况发现了有124个基因的表达有超过2倍的增长也有一些基因的表达降低了这些有显著增长的基因包括一般的生长调节因子乙烯反应元件结合蛋白系胚轴延伸转录因子生长转录因子和蔗糖合成酶及其他的胚胎形成酶
还有一类就是与植物抗逆相关的信号通路的激活包括热休克蛋白COR基因和耐盐锌蛋白
harpin虽然是来自于病原菌但是作为一种非特异性的激发子却能够引起非寄主的抗病性的增加以及促进植物的生长但是更有意思的事是harpin Ea是来自与梨火疫病的
病原菌E.amylovora然而在转harpin Ea的梨上harpin Ea也表现出了非常强的抗病
图11 正常梨与转hrp Ea梨接种梨火疫病菌 E.amylovora
A正常的梨在接种梨火疫病后很快发病B转hrp基因后的梨对梨火疫病表现出了很强的抗性性包括梨火疫病本身图11这一现象目前还没有很好的解释有人认为是E.amylovora 在侵染梨时harpin的初表达量非常低不能引起植株抗性显著的增强以对抗病原菌的毒性
作用
三harpin蛋白的受体HrBP1
harpin蛋白的受体HrBP1是由Eden公司的植物受体和信号传导小组利用酵母双杂交系统从拟南芥中克隆到的同时发现这一受体在植物中广泛存在图12并被定位了在细胞壁上由于涉及商业机密目前HrBP1的有关具体情况还不是非常清楚
图12 来自拟南芥的HrBP1蛋白和其他植物上HrBP1类似蛋白的序列比较
结论
寄主很快地死去或者造成寄主种群的灭绝都不是病原菌希望看到的植物和病原物就是处在这样一个动态的平衡当中理解了这点也就不难理解为什么在病原菌当中还会存在着avr和hrp这样的基因当然植物病理学家们在理解了这点后也为他们指明了一条新的研究和防治植物病害的途径目前以有美国的生物公司利用harpin Ea蛋白研制出了商品化的生物农药----Messenger?国内南京农业大学分子植物病理实验室也已经完成了对来自黄单胞菌Xanthomonas的harpin Xoo蛋白重组发酵的小试阶段如何通过更加细致的工作详细的了解植物与病原物互作的过程以及利用现有的研究转化为对实际生产有现实意义的产品是将来我们工作的重点
(Edited by yog)
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