摘要：世界范围内抗生素的使用比较混乱，细菌的耐药日趋严重，合理针对性的使用抗生素成为必然，因此必须了解细菌类型和其药敏情况。痰细菌检查的诊断价值是人们一直关注的问题，为了快速而准确的获取痰的细菌情况，国内外学者进行了不断的探索，本文就此进行综述，以利于获取合格的痰标本和快速而准确的细菌学证据。
自从1940年发现青霉素以来，人类就在不断地开发新的药物以治疗细菌感染。尤其近20余年来，头孢菌素和新的氟喹诺酮类及大环内酯药物的出现，为临床医师应用抗生素提供了许多选择，大大地提高了感染患者的治愈率，同时也选择出了许多的耐药菌株。正是因为抗生素的多样化和临床选择抗生素的随机性，人们对于抗生素存在着滥用的情况，尤其在急诊科，存在流水作业，不同的医生对同一个病人会选择不同的抗生素，这同时也选择了细菌，导致了细菌的耐药率的逐年上升。在欧洲，80%以上的下呼吸道感染应用抗生素治疗，大多数医生对急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区获得性肺炎、和病毒性呼吸道感染不加以鉴别就应用抗生素，不同的国家抗生素的选择不一样。据美国
1994-1995年30个医疗中心的统计显示：约24%的肺炎链球菌对青霉素不敏感，14%为中度耐药，10%为高度耐药。非典型流感嗜血杆菌的耐药已高达36.4%，而在80年代仅为15%。有一374例下呼吸道感染的患者的前瞻性研究表明：耐药肺炎链球菌感染同先前应用β—内酰胺类抗生素有关。因此合理使用抗生素成为防止细菌耐药的一大重要策略。要合理的使用抗生素，除了加强规范化的经验性治疗外，最重要的是明确感染患者的病原菌及其药敏情况，以便针对性的使用抗生素。因此快速而准确的细菌培养是急需解决的问题。
下呼吸道感染是指声门以下的呼吸道的感染。包括社会获得性和医院内获得性，在临床上极为常见，其病原菌种类繁多，院内感染者多以革兰氏阴性杆菌多见，混合感染也较多。临床表现也多种多样，通过胸片和症状体征难以鉴别感染的细菌类型，因此病原学检查非常重要。准确获取病原学证据有利于及早明确诊断，根据药敏及时地进行抗菌治疗。获取病原菌的方法多种多样，如血培养，痰涂片和痰培养及经气管吸引术采痰、纤支镜保护性毛刷及肺泡灌洗和肺活检等。血培养阳性率低，其临床应用价值有限，而经气管吸引术采痰、纤支镜保护性毛刷及肺泡灌洗和肺活检均为有创检查，一般患者难以接受，限制了其在临床中的广泛使用。而痰为下呼吸道的分泌物，其病原菌的情况最能真实的反应下呼吸道的感染情况，因此痰涂片镜检和痰培养一直受到临床上的关注，且常规用以指导临床治疗。对此国内外学者为快速而准确的获取病原学证据作了大量的工作，本文就此进行综述，以利于获取合格的痰标本和快速而准确的细菌学证据。
一、痰细菌培养存在的问题
细菌培养的过程包括临床痰标本的流取和试验室的接种培养及鉴定，二者均直接影响细菌培养的结果，必需同时加以改进，才能提高培养的准确性。几十年来，对于痰标本的临床价值一直存在着争议，其原因主要有：(1)、大多数的下呼吸道感染患者有咳嗽咳痰的症状，但咳痰量因人而异，临床上约有10-30%的患者干咳无痰或咳痰无力，通过自主咳嗽无法获取痰标本;(2)、人体口咽部寄居有大量的正常菌群，尤其是长期住院患者，口腔中的革兰氏阴性杆菌的数量明显增多，咳出的痰液在口腔中停留易被污染，从而影响检查结果;(3)、约15-30%
的患者在痰标本留取前已经使用过多种抗生素，一些比较脆弱的细菌如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌在应用抗生素后，取任何呼吸道的标本的检出率为0，实际上检出的细菌很大程度上是对所应用的抗生素耐药的细菌，从而使药敏结果对临床用药的指导意义大大降低;(4)、目前绝大多数的医院采用的培养基为2种，即血平板和伊红—美兰平板，使得许多导致呼吸道感染的病原菌不能被分离出来。流感嗜血杆菌是慢性阻塞性肺疾病急性发作期第1位常见的致病菌，其培养需要巧克力培养基和CO2培养箱，但一般试验室都不进行该培养基的培养，从而使得许多常规培养为阴性，这样痰培养对指导临床用药的帮助大大降低。(5)、对于常规痰培养而言，试验室多采用白金耳环取痰中极少一部分在培养基中划线培养由于痰中细菌的数量和种类的分布不均匀，接种时可能所取的部位没有致病菌或只接种了一部分致病菌，这使培养的阳性率大大降低。尽管如此，痰液毕竟是下呼吸道的分泌物，其病原菌情况最能真实地反应感染的细菌，因此提高痰培养的准确性是临床医生和细菌学工作者极其关注的问题，并对此作了许多改进，从而更有效地指导临床用药。
二、痰细菌培养的改进措施
痰诱导的方法现已成功地应用于研究哮喘的气道炎症，其诱导成功率约为76-100%，这是一种简单、安全的获取下呼吸道痰液的方法。近年来有人建议应用此方法对干咳无痰的患者进行诱导，然后进行痰培养，这使得痰培养的应用范围扩大了，但有的患者基础肺功能差，根本不能耐受诱导或诱导后患者病情加重，在一定程度上限制了其应用。为了消除口腔寄生菌的污染，有人应用0.1%的洗必泰或0.1%的新洁尔灭或H2O2漱口然后留痰，结果能明显减低污染率。同时对咳出的痰液用0.9%的盐水洗痰3-4次，然后应用痰液消化液如1.8%的NH4CL或N-乙酰半胱氨酸钠进行消化，使痰液均匀化，接种的阳性率大大的提高。口腔寄生或唾液中含有的杂菌浓度可高达106-9/ml，Bartlett将冲洗后的痰做细菌定量培养，可降低标本的污染平均浓度为103-4/ml，其阳性菌株与经气管所获标本结果一致。Dixon报告稀释10000倍的痰培养结果并显著降低致病菌的阳性发现率，但可降低因污染引起的假阳性率(可降低到21%)。作者曾应用显微镜观察漱口前后咳出的痰液和用0.9%的盐水冲洗后的痰液，发现涂片中鳞状上皮细胞明显减少，这样获取的痰标本90%以上能达到合格：鳞状上皮细胞〈10个/低倍视野，白细胞〉25个/低倍视野。因此必需强调漱口和消化痰液的重要性。对于采取的痰液消化剂而言，必须具有消化痰液的能力，同时又不能抑制细菌的生长。许多人采用的1.8%的NH4CL或N-乙酰半胱氨酸钠对大多数细菌无抑制作用，但对比较脆弱的细菌如肺炎链球菌的生长抑制比较明显，这不利于准确地进行痰培养，因此寻找合适的消化液是消化痰液必需解决的问题。培养基的选择也是影响痰培养的很重要的原因，余国华等人设计了“全痰系列分离法”，应用7种培养基对慢性阻塞性肺疾病患者的痰分离菌群和口腔分离菌群相对照，成功的评价了慢性阻塞性肺疾病患者急性加重期的致病菌情况，同时指出：只有痰细菌浓度较唾液同种细菌高100倍以上，方能确认其在支气管内丛生。除了对常规留痰方法进行改进外，国内外学者都在为获得无污染的下呼吸道分泌物而努力。进气管吸引术，可避免口腔正常菌群的污染，主要用于肺部厌氧菌的感染、免疫受损的患者和非典型肺炎的病原菌检查，但其副作用大，患者不易接受，目前已很少应用。侯显明等人通过经气管穿刺吸引痰培养和经口痰菌定量培养的比较，得出定量培
养的判断标准：菌群>107cfu/ml可认定为致病菌;菌群〈107cfu/ml，
但>104cfu/ml且当两次培养结果相同时，也具有临床意义;如菌群〈104cfu/ml 其菌属与对照吸引痰培养不一致时，提示为口腔菌群污染。纤支镜的检查不但可以目视三级以上支气管的内壁情况，同时也可以通过灌洗和保护性毛刷采样而获取下呼吸道分泌物进行培养，定量培养后，菌群>103cfu/ml可有临床意义。目前保护性毛刷采样进行定量培养被认为是痰细菌培养的“金标准”，其敏感性可达80%，特异性达90%。单套管和双套管保护性毛刷采样进行培养其结果无显著性差别。它最适合于没有进行抗生素治疗和停用抗生素48小时以上的患者。但这些为有创检查，一般患者难以接受，其临床的广泛应用受限，但对于复杂肺炎的患者，明确病原菌的类型和药敏情况具有重要作用。
对于特殊细菌如结核杆菌的检查是人们比较关注的问题，其培养一般需要
4-6周，很不利于指导临床用药，尤其近年来结核杆菌的耐药问题日趋严重，临床急需根据药敏指导用药，因此快速准确地检测结核杆菌及其药敏情况是必须解决的问题。国内外学者对此也进行了大量的研究。应用聚合酶链反应(PCR)的方法快速检测痰中的结核杆菌，Kolk AH等人的研究表明：对于所检测出的35例结核患者临床资料大都支持。对于无痰的患者可采取痰诱导的方法解决，并且对诱导痰进行PCR对于诊断结核非常有用，PCR的结果和痰培养的结果互相补充。但是PCR的影响因素很多，其假阳性很高，目前国内仅限于科研而少应用于临床诊断。
三、细菌鉴定的准确性和速度提高
细菌的鉴定经历了由手工到自动的过程。传统的分离与鉴定细菌的方法十分麻烦，并且都依赖于细菌的生长，现已有不依赖于细菌生长的鉴定技术和方法。目前已有细菌和药敏的成套的鉴定系统，如手工(Apc)鉴定系统、自动(ATB)鉴定系统和UTTEK—全自动微生物鉴定系统，其鉴定速度快，准确性提高，免除了繁琐的手工操作，以往痰培养结果一般为7天，目前3-4天就可以出来，为及时准确地指导临床用药提供了方便。Vitek—AMS自动鉴定系统是国内全自动系统应用最广泛的一种，全世界也有4246家实验室应用该系统，它既能进行鉴定又能进行药敏实验。美国最普遍使用的MicroScan系列可鉴定近500种细菌，鉴定速度快。ATB Expression半自动细菌鉴定系统可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验，可进行苛氧细菌、嗜血杆菌、奈瑟菌、厌氧菌、真菌和支原体的药敏。但传统药敏实验的基本方法并无大的改变，如琼脂培养基法包括琼脂稀释法、有限琼脂稀释法和滤纸片扩散法，肉汤培养基法包括用于自动化测定的微量肉汤稀释法和肉汤滤纸片稀释法，均为目前大多实验室采用的药敏方法。
有的细菌如肺炎球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌具有典型的形态，在痰涂片时就能识别出来。因此痰涂片也可以及时地明确部分典型细菌，(对于金黄色葡萄球菌希氏内科学(第20版)未列为此类典型细菌)为指导经验性的临床用药提供帮助，正确使用抗生素，但其药敏情况及是否混合其它病原菌感染有待于痰培养后明确，因此二者不可偏废，彼此验证，更正确而迅速地为临床提供帮助。
常用抗生素 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 常用培养基 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨10g 酵母提取物5g 氯化钠10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。(实验室一般都不调PH) SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨20g 酵母提取物5g 氯化钠0.5g 1 mol/L 氯化钾2.5ml
临床细菌学检验的质量控制流程 1、质量的概念和质量保证 影响检验结果质量的因素很多,实验过程中,仪器、试剂和操作等均会引起试验结果的误差,衡量检验结果的质量常用准确度和精确度,或特异性和灵敏度。具体采用哪一种指标应根据实验的性质决定,目前临床细菌学检验的工作内容大致有3类,衡量起质量的技术指标不完全相同。 第一类是检出细菌的实验,包括标本直接涂片检查和细菌分离培养。现代的细菌感染,混合菌较常见,一份标本中,会有2种以上细菌存在。无论标本直接涂片还是分离培养,检验结果必须如实反映感染病灶中细菌的真实情况。这类实验的质量,应该用细菌检出率或细菌分离率来衡量。 第二类是鉴定细菌的实验。通过一系列生理生化及形态学、血清学的手段来鉴定病原菌。对分离到的病原菌都做出准确的鉴定,是反映细菌事工作质量的一个重要方面。 第三类是药敏实验。有稀释法和纸片法,前者是半定量的实验,可以用准确度和精密度来衡量,后者以敏感或耐药的形
式报告,属于定性的实验,但实验过程中测量抑菌环是定量的指标。也应以准确度和精确度衡量。 所以实验室人员必须清楚认识到以上这一点,在实验室的设计和管理方面就应该主动设置误差检测系统,实验中一旦出现误差及时发出警报,查明原因及时纠正。 2、室内质量控制 2.1在职人员 2.1.1须受过细菌学检验的专门基础教育以及相关的生物交全防护知识,并以细菌检验为专业,及时终结并积累工作经验。 2.1.2作人员必须具有严谨的工作态度,技术操作须完全遵守操作规程,并直接参与质量控制工作。 2.1.3工作人员应不断加强自身的业务学习,及时了解本领域的新进展,将所掌握的新知识应用到实际工作中。 2.1.4实验室管理人员应注意利用一切机会培养技术人员,积极参加国际、国内学术会议、专业培训班,获取新信息。因为细菌学检验,投资人员培训远比投资与仪器设备更重要。 2.2操作手册及参考书
普通细菌培养鉴定操作规程 1 检验目的 做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。 2 原理 人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出细菌则视为致病菌。并排除采样及操作污染。 3 标本要求 （1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。 （2）标本采集：见标本采集手册 （3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。 （4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。 4 容器和添加剂类型 均使用灭菌器皿盛放标本 5 试剂 （1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。 6仪器设备： （1）接种针、接种环、酒精灯 （2）梅里埃ATB药敏鉴定仪 （3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平 7 校准程序 (送市计量质量检测研究所校准) 8操作步骤
（1）所有标本按照培养目的增菌培养12-18小时后盲目接种，血培养发现阳性立即进行接种。 （2）接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。 （3）涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色； （4）纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/柯玛嘉或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。 （5）鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，细菌的鉴定见梅里埃ATB微生物鉴定系统 9质量控制： 参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动 10 生物参考区间 血液，尿液，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。 11 患者检验结果的可报告区间 细菌鉴定到种或属；菌群调查报告比例。 12 临床意义： 为医生提供病原学诊断，并为进一步药敏实验提供依据。
痰标本前处理对细菌培养结果的影响性分析 发表时间：2014-05-13T14:22:08.373Z 来源：《医药前沿》2014年第3期供稿作者：孙玉红 [导读] 临床治疗呼吸道感染疾病通常要取患者的痰液检验，然而受到正常菌群污染，通常情况下，痰标本的细菌学检验结果不太准确。孙玉红 （河南省洛阳市汝阳县人民医院检验科 471200） 【摘要】目的探讨痰标本前处理对细菌培养结果的影响。方法选取我院收治的呼吸道感染患者为研究对象，对患者送检的痰标本检筛，分别对合格的和不合格的痰标本进前处理，对比两种痰标本阳性菌的分离率，同时探究预处理对细菌学检验结果的影响。结果合格痰标本的阳性菌分离率约为50.9%，不合格的分离率为3%。经前处理的痰标本可以提高阳性菌株的检出率，且预处理时间对流感嗜血杆菌检出率有影响。结论痰标本前处理有助于细菌学检验结果的准确性，值得临床推广和应用。 【关键词】痰标本预处理细菌学检验结果 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）03-0200-02 临床治疗呼吸道感染疾病通常要取患者的痰液检验，然而受到正常菌群污染，通常情况下，痰标本的细菌学检验结果不太准确。我院选取2011年2月至2012年2月我院收治的呼吸道感染患者为研究对象，取痰标本，探究痰标本前处理对细菌学检验结果的影响，现报告如下。 1 资料 1.1 一般资料：选取我2012年2月至2013年2月院收治的呼吸道感染患者为研究对象，共取送检痰标本1000例。1000例痰标本均是患者清晨起床，清水漱口后，尽力从气管内咳出的第一口痰，收集置于无菌器皿中，送检。 1.2 送检痰标本质量鉴定：送检的痰标本采用无菌接种环进行革兰染色，之后，置于细胞学显微镜下观察并记录鳞状上皮细胞和白细胞总数，鳞状上皮细胞和白细胞每低倍视野下分别小于10个、大于25个，该痰标本判定为合格[1]。反之，为不合格痰标本。 1.3 痰标本接种及前处理：痰标本接种：根据《检验操作规程》，选痰标本带血丝或者脓性部分，接种血平板、万古霉素、麦康凯平板，在高温35°下培养24至48小时后观察[2]，对比合格和不合格两种痰标本下细菌学检验结果。 1.4 痰标本的前处理：取合格痰标本，取等量消化液，在高温35°下孵育15min和30min后接种在血平板、万古霉素、麦康凯平板，对比合格痰标本在预处理前后对细菌学检验结果的影响。 2 结果 对比合格痰标本预处理前后的细菌学检查结果对合格痰标本进行预处理，对比预处理前后可得，预处理前的阳性菌分离率为59%，而预处理后的为62%。与带血丝的痰标本相比，脓性痰标本经预处理后更容易接种，且阳性菌落数目明显增加。另外，预处理后孵育时间对苛氧菌有较大影响，如流感嗜血菌，孵育15min检出率为9%，孵育30min检出率为4%。 3 讨论 我院选取2011年2月至2012年2月收治的呼吸道感染患者为研究对象，采用自然咯痰法取得痰标本，其中55%（550/1000）为合格痰标本。因此，在研究痰标本预处理对细菌学检验结果前，一定要筛选合格痰标本。临床经验表明，自然咯痰收取的痰标本势必会受到正常菌群的污染，这种情况下不利于进行细菌学检验，因此本文对痰标本进行前处理，研究痰标本前处理下对细菌学检验结果的影响。通过本文研究可发现，痰标本前处理具有以下几个优点：①可以有效诊断是否存在真菌感染，随着真菌感染患者的增多，尤其是呼吸道真菌感染患者的增多，同时采用培养法和涂片法可以提高细菌阳性检出率。②有助于判断痰标本质量。根据《全国临床检验操作规程》中的相关标准判定痰标本质量。进行革兰染色，在细胞学显微镜下根据细菌染色性、排列和形态来判断菌种、细菌量及吞噬细胞中是否含细菌等[3]。③有效提高了细菌学检验结果的可靠性，同时采用革兰染色还可确定感染的病原菌。本文取得的痰标本具有非均质性，且细菌分布浓度也不均匀，这种痰标本不利于致病菌培养，遇到这种情况应该向痰标本中放入等量消化液，置于35°高温，这样可以促使痰标本从胶冻的状态变为液体状态，使得痰标本涂抹时易于分开，同时可以促使胶冻痰块下致病菌长出单个菌落，最终有利于提高致病菌培养阳性[4]。 综上所述细菌学检验结果很大程度上受痰标本的影响，临床感染菌种种类、耐药性及抗菌药物的应用等与痰标本细菌学检验有着密切的联系，因此，收取合格痰标本，控制痰标本质量，进行消化液预处理对临床呼吸道感染患者有极为重要的意义。临床上为了提高痰标本对细菌学检验结果的可靠性，必须在控制痰标本质量的同时，进行消化液处理，只有这样才能最大程度地保障痰标本对细菌学检查结果的积极影响。 参考文献 [1] 柯俊，陈媛，陶治洲，等.痰标本预处理对细菌学检验结果的影响[J].检验医学与临床，2008，07（13）：814-815. [2] 宣瑞红，胡朝晖，王娟，等.临床标本军团菌分离方法研究[J].国际检验医学杂志，2010，31（06）：593-594. [3] 潘武宏，曾霞芳.1393例痰标本细菌培养基药敏分析[J].使用预防医学，2009，16（03）：926-927. [4] Rico F，Roya Z，Jeannine H，et al.Clinical predictors for Legionella in patients presenting with community acquired pneumonia to the emergency department[J].BMC Pulm Med，2009，09（04）：1-9.
临床标本的细菌学检验 临床标本的细菌学检验，从各种标本中查找病原菌及其对抗生素的敏感性，在明确诊断、指 导用药、预防和流行病学调查等方面具有重要意义。对各种标本，应根据实际要求和标本特 点选择适当的检验步骤及方法，准确、快速地检测病原菌，分析检验结果并报告，同时应注 意低耗和安全防护。分离细菌的目的是查找与疾病相关的病原体及其对抗生素的敏感性，对 临床诊断、治疗、预后和流行病学调查很有价值。 1临床标本的采集与送检 临床标本的质量对于细菌学检验的结果至关重要，严格按操作规程的要求进行标本采集、运送、保存和处理，才能保证检验结果准确、可靠。 1.1临床标本的采集 1.1.1细菌学检验申请单的检查与登记：应仔细检查检验申请单上的内容，如标本类型、来源、送检目的、患者姓名、性别、年龄、临床诊断(如未明确，应注明主要症状)及是否已用 抗生素等，并及时登记。 1.1.2标本盛放容器：采集的标本，尤其是采自无正常菌群寄居部位的标本如血液、脑脊液、穿刺液等，必须盛放于无菌容器内[1]。容器灭菌应采用干热、湿热等物理方法灭菌。容器上 应贴上标签，注明待检患者姓名、床号等信息。 1.1.3无菌操作：在采集血液、脑脊液、穿刺液、骨髓时，应严格进行无菌操作，避免杂菌 污染标本。采集粪便、痰液、咽拭子、肛拭子等标本，虽无需严格无菌操作，但也应尽量避 免杂菌污染。 1.1.4采集时间和部位：选择合适的采集时间是很重要的，一般情况下，标本应尽量在疾病 早期或在症状、体征明显时，在抗生素治疗之前采集，一些特殊检验的标本应按规定的时间 采集。根据感染的具体情况，选择适当的部位采集标本。 1.1.5安全防护：采集的标本可能含有病原菌，因而采集、运送、保存和处理过程中必须注 意安全，防止标本中的病原菌溢出导致污染甚至传播；同时还需防止自身感染。 1.2标本的送检与保存 采集标本后，在盛装标本的容器上应贴好标签，并在标签上写明相关信息，立即将标本送至 检验室。标本收集时间应加以准确记录，使检验人员接种时能判断标本是否延误。如不能及 时送检，应根据病原菌的生物学特性，采用冷藏或保温等措施，以及将标本放入相应的保存 液或培养基中保存运送。常规细菌学检验的标本在采集后，应于1 h内送交实验室，否则可 能影响病原菌检出。若需保存于4℃，也不能超过24 h，否则会影响病原菌的检出率。包括 厌氧菌培养的临床细菌检验标本，运送时间与原始标本的量有关，标本的量少应加快运送， 可在15～30 min内送达，否则必须于厌氧环境中25℃存放，不超过20～24 h。不得冷藏及 冷冻。如怀疑淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌感染标本应立即处理。脑脊液、生 殖道、眼睛、内耳标本绝对不可以冷藏[2]。任何临床标本，包括拭子、体屑、体液或组织块，已知或可能含有被分离的致病菌，都应视为生物危险材料。运送时，无论距离远近都必须严 格执行有关病原微生物标本的运送管理规定，注意安全防护，且标识清楚、包装完整且符合 要求，然后安排专人运送。 2 临床标本的细菌学鉴定与报告 对标本进行直接涂片镜检、快速检测病原体成分或特异性抗原、直接药敏试验，同时进行病 原菌的分离培养、菌种鉴定和纯菌药物敏感试验，最后报告检验结果。
[沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂，沙堡弱培养基，SDA] （一）组成 葡萄糖40.0g 蛋白胨10.0g 琼脂12.0～15.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后加入200mg氯霉素，121摄氏度10分钟灭菌后备用。（三）目的 是常用的分离或保存菌种的培养基。 [沙氏液基，SDB] （一）组成 葡萄糖40.0g 蛋白胨10.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后加入200mg氯霉素，121摄氏度10分钟灭菌后备用。[加抗生素沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂基，SDA with antibiotic] （一）组成 葡萄糖40.0g 蛋白胨10.0g 琼脂12.0～15.0g
蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后加入200mg氯霉素。250mg放线菌酮，121摄氏度10分钟灭菌后备用。[改良沙氏葡萄糖蛋白胨琼脂基，modified SDA] （一）组成 葡萄糖20.0g 蛋白胨10.0g 琼脂12.0～15.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 上述混合后121摄氏度10分钟灭菌后备用。 （三）目的 保存菌种培养基。 [马铃薯葡萄糖琼脂，PDA] （一）组成 马铃薯200.0g 葡萄糖20.0g 琼脂12.0～15.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 先将马铃薯洗净去皮切片，加水180ml，煮沸30分钟后过滤，再加葡萄糖、琼脂，将过滤
液补足到1000ml，121摄氏度灭菌后备用。 （三）用途 此培养基是培养真菌较好的培养基，同时也是鉴定真菌较好的培养基之一。鉴定皮肤癣菌一般不用此培养基。 [玉米吐温80琼脂，CMA with T w80] （一）组成 玉米粉40.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000ml 吐温80 10ml （二）制法 先将玉米粉混于水中，65摄氏度水浴一小时，过滤，再补足水量，然后加入琼脂和吐温80，121摄氏度10分钟灭菌后备用。 （三）用途 用于观察白念珠菌厚壁孢子及假菌丝；红色毛癣菌在此培养基产色素较好。 [米饭培养基rice grain medium] (一)组成 大米300.0g 蒸馏水1000ml （二）制法 将3g大米放入试管中，加入10ml蒸馏水，高压121摄氏度10分钟灭菌后备用。
痰液标本细菌学检验（一） 关键词：细胞库菌株培养中心 atcc 北京标准物质网 一、检验程序 痰及呼吸道标本的细菌学检验程序见图34—1。 二、检验方法 (一)显微镜检查 1．一般细菌涂片检查挑取标本中脓性或带血部分涂片进行革兰染色镜检，描述观察到的细菌的染色性、形态及排列等特征，可发出初步报告。 2．结核分枝杆菌涂片检查挑取标本干酪样或脓性部分做抗酸染色和金胺“O”荧光染色，前者用油镜，后者用荧光显微镜检查。具体操作详见第十五章分枝杆菌属检验。
3．放线菌及诺卡菌涂片检查将痰液用生理盐水反复洗涤数次，挑取黄色颗粒(硫黄颗粒)或不透明着色斑点，置玻片上并覆以盖玻片，轻压后置高倍镜下观察。如见中央为交织的菌丝，其末端粗杆呈放线状排列时揭去盖玻片，待干后做革兰染色及抗酸染色镜检。 4．下呼吸道其他标本检查支气管肺泡灌洗液等直接取自下呼吸道的标本，不易受上呼吸道杂菌的污染，涂片检菌的意义较大。可取离心沉淀物进行革兰染色与抗酸染色检查。 (二)培养和鉴定 1．痰培养标本的前处理于痰标本中加入一定量无菌生理盐水，剧烈振荡5～10秒后，将沉淀于管底的脓痰小片取出，置于另一试管中，同法再处理2次，可洗去痰中的正常菌群。然后向洗涤过的痰液中加入等量pH 7. 6的1％胰酶溶液，放置35℃环境90分钟，使痰液均质化后备用。 2．培养基与培养环境 (1)血琼脂平板：适用于分离多种细菌，需氧环境，可分离β-溶血性链球菌，葡萄球菌；置于5％CO 环境培养，分离肺炎链球菌和β-溶血性链球菌。根 2 据血琼脂平板生长的菌落特征及镜检形态，得出初步结果，再按各类细菌特性做进一步鉴定。 (2)巧克力色琼脂平板：置于5％CO 环境培养，常用于分离嗜血杆菌和脑膜 2 炎奈瑟菌等有特殊营养需求的细菌。 (3)中国蓝琼脂平板／麦康凯平板：需氧环境培养，常用于分离肠杆菌科细菌。 (4)TTC-沙保弱培养基：需氧环境培养，用于分离白假丝酵母菌及其他酵母菌、诺卡菌、放线菌以及烟曲霉菌等。 (5)厌氧血平板：厌氧环境培养，用于培养厌氧菌。 (6)结核分枝杆菌培养基：需氧或5％～10％CO 环境培养，改良罗氏培养基、 2 米氏7H10培养基或其他合适的培养基，用于培养结核分枝杆菌。 环境培养，药用炭酵母琼 (7)军团菌专用培养基：置于2．5％～5. 0％CO 2 脂(CYE)培养基、F-G琼脂，用于培养军团菌。 3．标本的培养
【项目名称】痰细菌培养 【检验报告】 1.痰细菌培养时间一般为3天，在此之前明确 诊断的要及时通知医生。 2.未检出致病菌时，应报告“正常菌群”。 3.对于机会致病菌，一般仅当其数量超过正常 菌群时才可报告鉴定结果及药敏试验结果。 4.检出致病菌时，除报告该菌的鉴定名称外， 还需同时报告正常菌群的情况。 5.通常以报告草绿色链球菌和奈瑟菌作为正 常菌群存在的指标。 【检验方法】 1.细菌培养：下呼吸道的病原菌种类繁多，一 般须用以下几种分离培养方法。 ①.血平板：适用于分离各类细菌， 特别是β－溶血性链球菌、葡萄球 菌、肺炎链球菌等。 ②.巧克力平板：于CO2环境下分离 嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌。 ③.中国蓝/麦康凯平板分离革兰氏 阴性杆菌。 ④.沙保罗培养基用于分离念珠菌及 其他酵母菌、奴卡菌等。 2.细菌鉴定：常用的有手工微量生化管法，API 细菌鉴定板条，Vitek、mini vital等自动化 鉴定仪。 【临床意义】
1.呼吸系统感染患者的痰液标本中分离出病 原菌的机会相当多，对细菌学结果的正确解 释并非容易，只有区别是病原菌还是上呼吸 道的正常菌群．才能判断被检标本中是否有 病原菌存在。 2.上呼吸道的正常菌群有αγ链球菌、微球 菌、奈瑟菌、嗜血杆菌、表皮葡萄球菌、棒 状杆菌、拟杆菌、梭杆菌和厌氧球菌等，其 中奈瑟菌、嗜血杆菌和棒状杆菌也可以是致 病菌。 3.痰液中常见的病原菌有：肺炎链球菌、金黄 色葡萄球菌、化脓性链球菌、假单胞菌属细 菌厌氧球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、结核分支杆菌、放线菌、卡他莫拉菌、脑膜 炎奈瑟菌、奴卡菌、假丝酵母菌、白喉棒状 杆菌、炭疽杆菌、奋森螺旋体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、百日咳鲍特菌及其它肠杆菌科 细菌等。 4.肺炎链球菌：寄居于人的上呼吸道，一般 不致病，致病物质主要靠荚膜的侵袭作用， 当机体抵抗力下降时，如寒冷刺激、感冒或 麻疹之后，可引起大叶肺炎或支气管肺炎。 肺炎链球菌引起的大叶肺炎占82．48％， 在支气管肺炎中占65．79％。此外还可引 起中耳炎、乳突炎、脑膜炎、败血症等。近 年来耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP) 及多重 耐药株的增加，给临床治疗带来一定困难。
穿刺液标本细菌学检验标准操作规程 1.目的 规范穿刺液标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2.适用范围 穿刺液标本培养。 3.标本 3.1 标本类型胸水、腹水、心包液、关节液、鞘膜液等。 3.2 标本采集采用无菌方法采集体内可疑感染部位的液体约2ml，注入无菌试管，或抽取穿刺液1-2ml注入多功能液体培养瓶，或抽取穿刺液2-5ml注入血培养瓶，混匀，立即送检。如怀疑厌氧菌感染，应做床边接种或接种运送培养基。 3.3 标本拒收标准 3.3.1 标本标识与化验申请单不符。 3.3.2 标本不是无菌留取，容器不符合要求。 3.4 标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不超过2小时。 4.试剂、仪器 4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、
巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。 4.2 VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。 4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。 5. 细菌鉴定和药敏质控 参见《质量管理程序》 6. 检验步骤 接收标本后，立即对标本进行编号、登记。 6.1 涂片检查脓性标本直接涂片。浆液性标本先离心（3000r/min）15分钟，取沉淀物涂片作革兰染色，观察有无细菌，以及细菌的形态。 6.2 分离培养 6.2.1 一般细菌培养接种于接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置于5%-10%CO2环境中，35°C培养18-24小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断。 6.2.2 增菌-分离培养法将多功能体液培养瓶颠倒混匀使液体覆盖整个固体面，然后置35°C孵育培养箱（固体面在
血培养是如何从标本中获得细菌培养及药敏报告的？ 1、常规的血培养标本需采集两管，一份为需氧菌培养，一份为厌氧菌培养。血培养瓶为密封装置，其底部含有培养基、显色剂。当血液标本中有细菌生长时，细菌会产生二氧化碳，二氧化碳可造成密封样本内气压和PH值的改变，显色剂也会变色。因此血培养中获得阳性结果。若培养5天后显色剂没有变化，则提示样本中没有细菌生长，血培养获得阴性结果。 2、血培养标本出现阳性结果后，采集少量血培养样本，在玻片上进行图片进行革兰染色进行初步鉴定，并向临床出具初步报告。同时在培养皿中进行接种。接种方法为分区划线法。其原理是，在一个培养皿中，通过划线的方式将样本进行充分的不定量的倍比稀释，使得培养皿中生成可分离的单个细菌生成的单克隆菌落。若不进行分区划线，培养皿中的菌落会非常密集，不便于挑取菌落进行鉴定，鉴定后向临床出具二级报告。我院采用三区划线，某些医院要求高会采用五区划线，通常三区划线后就可获得有效的单克隆菌落。 培养皿中所使用的培养基会根据细菌的特征进行选择，常用的有普通“血琼脂培养基”、“巧克力培养基”。某些特殊细菌需要特殊的培养基。 3、培养皿中获取单克隆菌落后，需要根据经验鉴定哪种细菌为优势菌，哪种细菌为致病菌，哪种细菌为定植菌。选择致病菌进行再次培养，并将其定容为1个“麦氏浓度”。此时开始进行药敏鉴定。经典的药敏方法有2种。1、倍比稀释法：将某种抗生素进行精确的倍比稀释，观察在哪种浓度的抗生素培养基中细菌会出现生长与不生长的交界。此浓度为该种抗生素对该细菌的“最低抑菌浓度（MIC）”。该方法虽然精确定量，但耗时耗力，一种抗生素需要配置多个浓度，一种细菌需要选择多种抗生素进行药敏鉴定，在此基础上，发展出“纸片法”。2、纸片法：在固态培养皿中均匀进行细菌接种，以培养皿中心为界进行扇形分区。将含有某种抗生素的纸片放在一个区域中，多个区域可以放置多种抗生素纸片，因此在一个培养皿中就可以对多种抗生素进行药敏鉴定。要求每个抗生素纸片距离边界不少于10mm，每两个纸片间的距离，不少于14mm。经过一段时间培养，细菌生长至肉眼可见的菌落。若细菌对某种抗生素敏感，则在某种抗生素纸片的周边形成一个没有细菌菌落生长的圆形空白区域。该圆形空白区域的大小与该抗生素对于该细菌的最低抑菌浓度成负相关。最低抑菌浓度越低，空白区域越大。采用纸片法可以获得半定量的药敏结果，“敏感、中介、耐药”。本院采用的药敏鉴定方法为自动化的药敏鉴定卡。药敏鉴定卡的模式如下图，一个纵列中含有多种抗生素海绵，一个药敏鉴定卡含有多个纵列，即一个药敏鉴定卡可以对多个菌株同时进行药敏鉴定。1个麦氏浓度的菌液均匀的接种于每个抗生素海绵中，机器可以自动感知某种抗生素海绵中细菌的生长情况，从而获得药敏结果。
表皮葡萄球菌 产气肠杆菌 鼠伤寒沙门氏菌 单核增生李斯特氏菌 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 表面接触碟/表面接触皿 https://www.doczj.com/doc/849828800.html, 金黄色葡萄球菌 酿酒酵母菌 脑心浸出液肉汤(BHI) 品红亚硫酸钠液体培养基 MFC肉汤 CFU培养基基础 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基蛋白胨 胰蛋白胨 胰酪蛋白胨 酵母浸粉 大豆蛋白胨 酸水解酪蛋白 明胶蛋白胨 马铃薯浸粉 琼脂粉 琼脂粉 动物组织胃蛋白酶消化物 肉胃酶消化物 牛肉浸粉 牛肝浸粉 牛肝浸粉 牛心浸粉 多价蛋白胨(多聚蛋白胨) 月示蛋白胨 玉米浸出粉 一次性培养皿 表面接触碟 一次性培养皿（密理博浮游菌采样）表面接触碟/表面接触皿 https://www.doczj.com/doc/849828800.html, 金属玻璃培养皿（可重复使用） 金属玻璃表面接触碟
嗜热脂肪肝菌芽孢菌片（ATCC7953 枯草杆菌黑色变种芽孢菌片（ATCC9372）121度高压灭菌化学指示卡 132℃压力蒸汽灭菌指示卡 葡萄糖 氯化钠 L-半胱氨酸盐酸盐 氧化酶试剂 三磷酸腺苷二钠盐（ATP） 费尔休林（无吡啶） SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 SDS-PAGE电泳液 SDS-PAGE上样缓冲液5倍 考马斯亮蓝R-250染色套装 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 大肠埃希氏菌 大肠埃希氏菌 产气肠杆菌 乙型副伤寒沙门氏菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 表面接触碟/表面接触皿 https://www.doczj.com/doc/849828800.html, 黑曲霉 生孢梭菌 大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉汤) 大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉汤) 无菌大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉? 大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉汤) 大豆酪蛋白消化液培养基 大豆酪蛋白琼脂培养基 大豆酪蛋白琼脂培养基 无菌大豆酪蛋白琼脂培养基 卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基基础 胰化大豆坚固绿琼脂(TSFA) 营养肉汤(NB) 营养琼脂(NA) 0.5%葡萄糖肉汤培养基 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 三糖铁琼脂培养基(TSI) 三糖铁琼脂培养基 R2A琼脂
院感细菌培养操作 20813
1.目的: 医院是病原微生物较集中,抵抗力低的人群密集的地方,加之化疗、放疗等手段的采用，影响病人免疫机能下降，大量使用抗生素，引起耐药菌株增多，菌群失调，以及先进医疗仪器广泛应用等原因，增加消毒灭菌的难度，致使院内感染已成为当前医疗实践的严重障碍，直接影响医疗效果。进一步规范院内感染监测标本的程序，更好、更快检测病原微生物的生长情况，预防医院感染的发生。 2.设备、试剂与材料 2.1 VITEK 2 compact鉴定药敏分析系统 2.2 VITEK 32鉴定药敏分析系统 2.3美国FORMAⅡ级生物安全柜 2.4显微镜 2.5酒精灯 2.6接种环 2.7恒温培养箱 2.8各种培养基 2.9 革兰氏染色液 2.10触酶试剂 2.11氧化酶试剂 2.12移液器 2.13无菌吸嘴 3.院感标本采集 3．1空气的采样 3．1．1采样时间选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。 3．1．2采样高度与地面垂直高度80-150CM。 3．1．3布点方法室内面积＜30m2，设一条对角线上取三点，即中心一点，两端各距墙1m处各取一点；室内面积＞30m2，设东、西、南、北、中5点，其中东、西、南、北点均距墙1m。 3．1．4采样方法用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5min后送检。 3．2物体表面采样 3．2．1采样时间选择消毒处理后4小时内进行采样。
3．2．2采样面积被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面＞100cm2，则取100cm2。3．2．3采样方法用5×5 cm2的标准来灭菌规格板，放在被检物体表面，用无菌规格板，放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1-4个规格板面积，剪支手接触部位，将棉拭子放入装10ml采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。 3．3医护人员手采样 3．3．1采样时间在接触病人、从事医疗活动前进行采样。 3．3．2采样面积及方法被检人五指并拢，将浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子一枝在双手指曲面从指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30 cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10ml采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米（cm2）计算。 3．4医疗用品采样 3．4．1采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。 3．4．2采样方法右用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、注射器和注射针等，取其中的一部分放培养液中培养。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面≥100cm2，取100cm2。 3．5使用中消毒剂的采集 3．5．1采样时间采取使用中的消毒剂。 3．5．2采样方法在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml被检样品，加入10ml稀释液混匀。（对于醇类与酚类消毒剂稀释液用灭菌生长盐水；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.1%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季铵盐类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80和0.3%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3%（w/v）吐温80，以中和被检样液的残效作用。） 3．6内镜的采样 3．6．1咽喉镜、支纤镜用10ml戊二醛中和液冲洗内镜后，送检实验室。 3．6．2胃镜、消化镜、宫腔镜用10ml0.1%硫代硫酸钠中和液冲洗内镜后，送检实验室。 3．6．3鼻咽镜、过氧化氢消毒的腔镜类用10ml生理盐水中和液冲洗内镜后，送检实验室。 3．7透析液的采样用灭菌的空试管取透析液10ml送检。 4.院感标本的运送及交接签收 4．1标本的采集
常用培养基的配制 （一）营养琼脂培养基 【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。 【成分】牛肉膏 3g NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼脂 20g 【pH值】7.2±0.2 【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基 【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃20min高压灭菌备用。 （三）半固体培养基 【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g 【pH值】7.6 【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。 （四）营养肉汤培养基 【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 牛肉粉（牛肉浸汁） 3g 【pH值】7.2±0.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，分装小试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min 高压灭菌备用。 （五）葡萄糖蛋白胨水培养基 【用途】供甲基红试验及V-P试验之用。 【成分】蛋白胨5g 葡萄糖5g K2HPO4 (K2HPO4·3H2O) 5g (0.65g) 【pH值】7.0～7.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装试管，每管2～3ml，经112.6 ℃ 20min高压灭菌备用。 （六）伊红美蓝培养基（EMB培养基）
微生物学检验题库及答案
《微生物学与检验》题库及答案 一.名词解释 1.医院感染 2.肥达反应 3.内基小体 4. 噬菌体： 5.血浆凝固酶 6.败血症 7.灭菌 8.药物敏感试验 9.外 - 斐氏试验 10.L 型细菌 11.菌群失调： 12.微生物 13.细菌 14.最小抑菌浓度 15.菌落 16.汹涌发酵 17.无菌操作 18.流感杆菌“卫星现象” 19.培养基 20.包涵体 21.正常菌群 22. 内毒素 23. 干扰现象： 24.菌血症 25菌丝： 二.填空题 1 L 型细菌是指（）。 2 杀灭物体上所有微生物的方法称为（）。 3 细菌 H-O 变异是指（）。 4 药敏试验所用标准培养基是，所用菌液相当于（）个细菌／ ml ，细菌接种采用（）划线接种法。 5 细菌致病因素包括（）、（）和（）。 6 细菌引起的全身感染包括（）、（）、（）和（）四种类型。 7 不染色标本检查主要用于观察细菌的（）。 8 影响革兰染色结果的关键步骤是（）。 9 有动力细菌在半固体培养基中的生长现象是穿刺接种线（），无动力细菌穿刺接种线（）。 10 糖发酵试验用于观察细菌分解糖是否产（）和（）。 11 靛基质试验的原理为，细菌产生的色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸而生成（），此代谢产物与加入的试剂反应，生成（）。 12 链球菌根据溶血现象分为（）、（）和（）三种类型。 13 葡萄球菌触酶试验结果为（）性，链球菌触酶试验结果为（）性。 14 呈现脐窝状菌落的球菌是（）。 15 抗 O 试验是测定病人血清中（）抗体效价的试验，用于风湿热等疾病的辅助诊断。 16 血平板上呈现草绿色溶血环的病原性球菌是（）和（）。 17 IMViC 试验包括（）、（）、（）和（）四项试验。 18 分解乳糖的细菌在肠道选择平板上呈现（）菌落，不分解乳糖则为（）菌落。 19 KIA 斜面红色表明，底层黄色、有气泡表明（）、（），有黑色沉淀表明（）试验阳性 20 霍乱弧菌生物型包括（）和（）。 21 AIDS 的传染源是（）和（），传播途径主要有（），（）和（）。 22 真菌菌落有（）、（）和（）三种。 23 病毒培养方法有（）、（）和（）。 24 病毒的基本结构由（）和（）组成，有些病毒还具有（）。 25 流感病毒根据抗原结构不同分（）、（）、（）三型，其中容易引起流感大流行的是其中的（）型。
呼吸道标本细菌学检验标准操作程序 1.检验目的 规范呼吸道标本细菌学检验操作规程，确保检验结果准确可靠。 2.适用范围 呼吸道标本培养和涂片检查。 3.标本采集与运送 3.1 采集时间以晨痰为好。 3.2 采集方法 3.2.1 自然咳痰法用清水反复漱口后从气管深部咳出痰，吐入无菌容器内。 3.2.2 气管镜下采集法在病灶附近用导管吸或用支气管刷直接取得标本。 3.2.3 气管穿刺法在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。 3.2.4 呼吸机采集法使用呼吸机的病人，可利用呼吸机吸取深部痰入专用采集器内送检。 3.2.5 为了明确扁桃体炎、会厌炎、鼻咽部化脓性感染的病原体，可以采集拭子送检。首先拭子用无菌生理盐水沾湿，然后用力在感染部位擦拭，采集标本与无菌管送检。 3.3 标本运送 3.3.1 采集标本后立即送到实验室，放置时间不应超过2h。 3.3.2 延迟送检或待处理标本应置于4℃冰箱保存（疑为肺炎双球菌、流感嗜血杆菌等苛氧菌感染除外），以免杂菌生长，但必须在24h内处理。 3.3.3 对可疑烈性呼吸道传染病的患者检验标本，在采集、运送及保存过程中必须注意生物安全防护。 4.检验步骤 4.1接种：用无菌拭子蘸取脓性部分，接种于血平板和巧克力平板第一区，再用一次性接种
环分区划线接种。 4.2 涂片在接种的同时进行涂片。用铅笔在磨砂部位编号，每片只涂一份标本。 4.3 培养：血平板、巧克力平板置35℃二氧化碳培养箱培养18-48h。 4.4 涂片染色镜检：涂片革兰染色，自然干燥后镜检。先用低倍镜浏览整片，计数平均每个低倍视野WBC、上皮细胞的数量。标本合格与否参考表1，合格标本再用油镜观察，主要观察片中主要细菌类型、WBC内吞噬什么细菌等，以作为看板时决定什么细菌要做的依据。 表1 痰液标本分级 4.5 培养结果观察 4.5.1 口咽部正常寄生的需氧菌主要是腐生的奈瑟菌、草绿色链球菌， 4.5.2 有明确意义的病原菌： A群溶血性链球菌(咽炎)、流感嗜血杆菌（b型5y以下儿童急性会厌炎、急性支气管炎）、肺炎链球菌（急性支气管炎常继发于病毒感染、大叶性肺炎）、百日咳鲍特菌（咳嗽、支气管扩张）、金黄色葡萄球菌（肺炎）、军团菌（肺炎）、白喉棒状杆菌。 4.5.3 机会致病菌：肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、肠杆菌属细菌、铜绿假单胞菌、洋葱博克霍尔德菌、星型诺卡菌、衣氏放线菌、卡他莫拉菌等。机会致病性真菌：球孢子菌（明确的致病性真菌）、曲霉菌、毛霉菌、卡式肺囊虫、酵母样真菌。 4.5.4 结合痰涂片，对于合格的痰，做如下处理： 4.5.4.1 镜下未见明显优势菌的，血平板正常菌群生长、巧克力上无嗜血杆菌生长，可延长培养至48h，或做DNA酶筛选卡他莫拉菌。如DNA酶阴性，48h培养板无有明确意义病原菌生长，报告“正常菌群生长”。 4.5.4.2 镜下见WBC内有吞噬菌的，分离相应的细菌鉴定药敏。
临床医生如何解读培养结果 严重感染及其并发症是ICU中危重病患者的主要死亡原因，针对重症感染，早期充分的经验性抗生素治疗是降低病死率的关键。相关指南推荐，在应用抗生素之前，应当留取培养以便鉴别致病微生物。通常，在经验性抗生素治疗2 ~3 天后，即可得到培养结果包括细菌鉴定和药敏。此时，临床医生应当根据培养结果，结合临床疗效，考虑对经验性抗生素进行升阶梯或降阶梯治疗，在确保抗生素疗效的同时，尽量减少细菌耐药的风险。因此，正确解读培养结果是正确实施抗生素治疗策略的重要组成部分。以下仅就痰培养和外周血培养结果的解读进行探讨。 1 痰培养结果的正确解读 患者发生医院获得性肺炎时，临床医生通常留取患者自行咯出的痰标本进行培养。为排除上呼吸道正常定植菌的污染，要求显微镜检每个低倍镜视野下鳞状上皮细胞<10，白细胞>25。但是，即便符合上述标准，痰培养结果对于诊断医院获得性肺炎致病菌的准确性仍然非常低。因此，相关指南以及专家认为，传统意义的痰培养对于确定和(或)排除致病菌均无任何帮助，不应作为调整抗生素的参考。对于机械通气患者而言，其下呼吸道标本可以通过吸痰管经人工气道直接留取，从而最大程度避免了上呼吸道定植细菌的污染。此时留取的标本应当称为气管(内)吸取物(endotracheaiaspirate，ETA)。严格意义上，气管内吸取物与痰标本有着本质区别。 多项临床试验表明，根据气管内吸取物培养结果诊断医院获得性肺炎的敏感性为82%，特异性0~33%. 换言之，82%的医院获得性肺炎患者气管内吸取物培养结果阳性，其余18%的患者培养结果为阴性；在并未罹患医院获得性肺炎的患者中，0~33%气管内吸取物培养结果为阴性，而67% ~100%培养结果为阳性。由此可见，无论患者是否罹患医院获得性肺炎，其气管内吸取物培养结果阳性的比例并无显著差异。究其原因，患者留置人工气道一旦超过4 ~5 天，其下呼吸道通常会发生细菌定植，而常规非定量培养方法并不能可靠鉴别定植细菌或致病菌。值得注意的是，在有关医院获得性肺炎的各种临床诊断标准中，培养结果阳性从来不是必要条件。上述结果提示，临床医生不应当单纯根据气管内吸取物的阳性培养结果选择或调整抗生素。最为典型的例子是下呼吸道念珠菌培养阳性。临床研究证实，对于非中性粒细胞缺乏患者，下呼吸道标本培养出念珠菌通常为定植菌而非致病菌。因此，相关指南和专家共识均不建议此时应用抗真菌药物。 既然培养结果阳性无助于确定致病菌，那么为何还要进行气管内吸取物的培养呢? 如前所述，气管内吸取物培养结果诊断医院获得性肺炎的敏感性为82%，即培养结果为阴性者仅有18%。因此，对于医院获得性肺炎患者而言，连续3 次气管内吸取物培养结果均为阴性的概率为18%>18%>18%即0.6%。这一结果提示，如果连续3 次气管内吸取物培养结果为阴性，临床医生可以较为可靠地排除医院获得性肺炎的诊断。事实上，临床医生可以将上述结论进行谨慎的推广。例如，若连续多次培养未分离到革兰阳性球菌，则可以停用针对耐药金黄色葡萄球菌的抗生素。另外，如果高度怀疑患者罹患医院获得性肺炎，而连续数次培养结果均为同一种细菌，则可以判定这种细菌应当为致病菌。综上所述，对于具有人工气道的医院获得性肺炎患者，气管内吸取物培养的阳性结果并不能确定致病菌，而阴性结果有助于排除病原菌。当然，这一策略并不适用于免疫功能缺陷尤其是中性粒细胞缺乏的患者，也不适用于那些无法通过常规培养分离的致病微生物如病毒、卡氏肺囊虫、结核分支杆菌和非典型病原体等。 2外周血培养结果的正确解读 相对于痰培养而言，血液中虽然不可能有细菌定植，但仍然会受到细菌污染的影响。需要说明的是，这里强调的血培养标本为外周血而非导管血。只有当留置中心静脉导管操作结