HEREDITAS (Beijing)
2008年5月, 30(5): 575―582 ISSN 0253-9772 https://www.doczj.com/doc/805397342.html,
研究报告
收稿日期: 2007?11?11; 修回日期: 2008?01?21
基金项目:国家自然科学基金项目(编号: 30671092)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 30671092)] 作者简介: 刘鹏(1982?), 男, 河北唐山人, 硕士研究生, 研究方向: 病原生物学。E-mail: panpan424@https://www.doczj.com/doc/805397342.html,
邓唯唯(1981?) , 北京市人, 研究实习员, 研究方向: 分子生物学。E-mail: vivian2003y@https://www.doczj.com/doc/805397342.html, 刘鹏、邓唯唯为本文并列第一作者
通迅简介: 张秀军(1966?), 男, 河北迁安人, 教授, 研究方向: 细胞生物学。E-mail: zhangxiujun66@https://www.doczj.com/doc/805397342.html,
石太平(1973?), 男, 湖北襄樊人, 助理研究员, 研究方向: 免疫学。E-mail: taipingshi@https://www.doczj.com/doc/805397342.html,
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00575
一个抑制AP-1活性的人类新基因AC3-33的克隆和初步功能研究
刘鹏1, 邓唯唯2, 高鹏2, 陆阳2, 孙博1, 李明1, 赵杰1, 石太平2, 张秀军1
1. 华北煤炭医学院生物科学系, 唐山 063000;
2. 国家人类基因组北方研究中心, 北京 100176
摘要: Activator protein-1(AP-1)是重要的转录因子, 其活性失调与肿瘤等多种疾病直接相关。本文运用“高通量高内涵细胞筛选技术(high throughput-high content cell-based screening technology)”对650个以未知功能基因为主的人类基因进行AP-1双荧光素酶报告基因筛选(Dual-Luciferase reporter gene screening), 获得了一个可抑制佛波酯(PMA)加离子霉素(Inonmycin)诱导的AP-1活性的人类新基因AC3-33(GenBank 中该基因名为C3orf33, No. FLJ31139)。生物信息学分析该基因序列全长1 931 bp, 由6 个外显子和5 个内含子组成, 定位于3q25.31, 从271~1026 有一个编码251 个氨基酸的可读框, 编码一个约29 kDa 的蛋白, 在肾上腺和宫颈等多种组织都有表达。AC3-33 与其他人类已知蛋白质没有明显的同源性, 亚细胞定位于细胞质中, 许多氨基酸序列高度保守。初步实验结果显示AC3-33是一个有重要功能的人类新基因。 关键词: AP-1; 基因克隆; 双荧光素酶报告基因筛选; AC3-33
Molecular cloning and preliminary function study of a novel human gene AC3-33 related to suppress AP-1 activity
LIU Peng 1, DENG Wei-Wei 2, GAO Peng 2, LU Yang 2, SUN Bo 1, LI Ming 1, ZHAO Jie 1, SHI Tai-Ping 2, ZHANG Xiu-Jun 1
1. Department of Biology , Northchina Coal Medical College , Tangshan 063000, China ;
2. Chinese National Human Genome Center , Beijing 100176, China
Abstract: Activator protein-1(AP-1) is an important transcription factor, and dysregulation of its activity has been associ-ated with many human diseases, including various cancers. A novel human gene AC3-33 (GenBank name: c30rf33, Acces-sion No. FLJ31139), which can suppress PMA and Ionomycin induced activation of AP-1, was identified from 650 human function-known genes by using the high throughput-high content cell-based screening technology. The gene whose full cDNA length is 1391 bp containing 6 exons and 5 introns is located in the human chromosome 3q25.31. The predicted pro-tein encoded by this gene contains 251 amino acids with a theoretical molecular weight of 29 kDa. Expression of the AC3-33 gene is widly found in adrenal glands and cervix. The amino acid sequences of AC3-33 is highly conserved, and has no homology to other known proteins. Subcellular localization studies show that the AC3-33 protein was localized in
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(Beijing) 2008第30卷the cytoplasm. Our preliminary results showed that AC3-33 is an important novel gene related to supress AP-1 activity. Keywords: AP-1; gene cloning; Dual-Luciferase reporter gene screening; AC3-33
人类基因组计划的完成为功能基因组的研究奠定了基础[1]。近几年, 以高通量和高内涵细胞筛选技术为基础进行功能基因组研究的文献报道逐渐增多, 从各自建立的包含大量独立的人类基因克隆表达文库中, 通过高效率的筛选, 发现了参与NF-κB、AP-1、p53、CRE、SRE等信号转导通路以及诱导产生细胞凋亡、增殖、分化等细胞表型改变的许多新基因[2]。高通量高内涵细胞筛选技术已广泛应用于人类功能基因组研究, 可以高效率地获得大量新基因的功能线索[3, 4]。
AP-1是一类重要的真核细胞转录因子, 主要由Jun、Fos、ATF 及JDP 亚家族组成, 亚家族单体以同源或异源二聚体形式结合DNA 靶序列, 参与靶基因调节。哺乳动物中AP-1的主要成分是Jun 和Fos, 通过碱性亮氨酸拉链(bZIP) 与DNA 结合[5]。AP-1 正常情况下活性很低或无活性, 但经细胞因子、生长因子、感染、致癌刺激等生理或病理信号刺激, 通过丝裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)等信号传导通路激活Jun N 末端激酶(JNK), 使JNK 从细胞质易位到胞核, 并使Jun磷酸化而激活AP-1, 活化后的AP-1 与DNA 序列结合, 启动多种与细胞分裂和增殖相关基因的转录, 从而参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程。AP-1 活性失调与炎症和肿瘤等多种疾病的发生和发展直接相关[6~8]。
虽然人们克隆了一些与AP-1活性相关的基因, 但迄今为止, 人们对AP-1活性调节的分子机制的了解有限, 因而克隆相关的新基因, 并研究其功能十分重要。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1 质粒和菌株
测序质粒pGEM-T Easy购自Promega公司; 真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his(-)和pcDNA3.1-topo- myc-his(-)购自Invitrogen公司; 荧光素酶报告质粒pAP-1-luc购自Clontech公司; 真核表达质粒pcDNA3.1-MEKK1由国家人类基因组北方中心提供。
650个人类基因全长ORF pcDNA3.1真核表达质粒由国家人类基因组北方中心功能基因组Ⅲ构建。大肠杆菌DH5α由本室保存。
1.1.2 主要试剂
限制性内切酶、修饰酶和其他工具酶购自NEB 公司。质粒大量提取试剂盒购自Qiagen公司, 质粒小量提取试剂盒购自(中美)优晶生物工程有限公司。
真核细胞转染试剂lipo2000 和High transfec-tion reagent阳离子转染试剂分别购自Clontech和Vigoras公司。PMA 和ionomycin购自Santa Cruz 公司。Dual Luciferase Reporter Assay System 购自Promega公司。DMEM培养基购自Gibco公司, Fetal Calf Serum购自Hyclone公司。DNA分子量标志DL-2000购自鼎国公司。
1.2方法
1.2.1 高通量细胞筛选
人类基因全长ORF真核表达载体文库构建: 用生物信息学方法结合RT-PCR方法, 共克隆了约有650个人类基因全长ORF及其剪接体, 主要以未知基因为主, 也包括部分已知基因, 全部构建到pcDNA3.1真核表达载体上, 总共有1 036个正向和反向克隆, 全部经正反向全长测序验证。
质粒提取: GAS-luc/pRL等荧光素酶报告基因质粒和对照质粒, 用Qiagen 大提质粒试剂盒提取。用于细胞筛选的待测文库质粒用Promega公司的Plasmid miniPre或V-Gene公司小提质粒试剂盒, 提取方法参照厂家说明。所有提取质粒均用1%琼脂糖电泳检测, 超螺旋形式质粒比例>80％, 检测260/280 nm吸光度比>1.70, 并计算浓度。然后用TE 缓冲液稀释到100 ng/μL, 按编号依次加入到96孔PCR板中, 4℃保存待用。
细胞培养: 293T细胞常规传代培养于含10％FBS 的DMEM中, 用0.25％胰酶＋EDTA消化细胞, 按1.5×106细胞/mL铺96孔细胞培养板, 每孔100 μL。37, 5
℃％CO2孵箱培养20～24 h, 使细胞密度达到40%～60%。
转染: 转染液(50 ng待筛基因真核表达质粒＋50 ng 荧光素酶报告基因质粒＋5 ng pRL质粒, 总质粒量105 ng加入生理盐水至总体积25 μL)。阳离
第5期刘鹏等: 一个抑制AP-1活性的人类新基因AC3-33的克隆和初步功能研究 577
子转染试剂0.5 μL, 生理盐水稀释到25 μL, 混匀, 室温放置 5 min, 将稀释的转染试剂加入到稀释的DNA溶液中, 混匀, 室温放置15 min。然后将5 μL 转染液加入到100 μL培养基/孔中, 37, 5
℃％CO2孵箱培养20～24 h。
刺激并收获细胞: 对AP-1筛选通路用100 ng/mL的PMA刺激, NFκB通路用1 ng/μL TNF-α刺激, 其他筛选通路均用100 ng/mL PMA和1 nmol/L 的ionomycin为刺激物。刺激后6～8 h收获细胞, 彻底弃上清, 每孔加入40 μL 1×1 PLB细胞裂解液, ?80℃保存待测。
检测: 将融解的10 μL细胞裂解液移入96孔荧光板, 自动加样25 μL /孔LAR-I液, FLUROSTAR检测萤火虫(Firefly)荧光素酶活性, 再自动加样25 μL /孔stop和glu液, 检测内对照海肾(Renilla)荧光素酶活性。用EXCEL软件进行数据处理。
每个96孔板检测9个样本, 每个样本设6个复孔, 其中3个孔加刺激物, 其余3个孔不加刺激物。阴性对照为pcDNA3.1空载体, AP-1筛选通路阳性对照为MEKK1。每批次筛选均设置阳性对照, 每一个96孔板均设阴性对照。阳性克隆经至少3次独立实验重复验证。
1.2.2 RNA提取与Northern blot
PCR扩增AC3-33基因的ORF, 琼脂糖凝胶电泳回收纯化使用随机引物标记试剂盒标记荧光素, 作为探针。使用Trizol试剂从子宫、宫颈、卵巢、睾丸、前列腺、肺等人正常组织提取总RNA。每种组织RNA取样20 μg, 电泳分离后转至尼龙膜。经预杂交后, 加入上述探针65℃杂交过夜。使用洗液I(300 mmol/L NaCl, 2×SSC, 0.1% SDS)室温洗涤3次, 每次30 min。再用洗液II(0.2×SSC, 0.1% SDS)50℃洗涤3次, 每次15 min。之后将膜与碱性磷酸酶标记的抗荧光素抗体孵育, 再经底物显色后采集图象。
1.2.3 RT-PCR分析AC3-33基因表达谱
收集细胞, 提取总RNA。每个样品取2 ng, 逆转录合成单链cDNA文库。使用人AC3-33上游引物P1(5′-TTGCTATCTTCTGGTGAGTAA-3′)与下游引物P2(5′-GCAGTTGTTCATGTTGTCTTT-3′)进行PCR扩增, 扩增条件为94 ℃ 5 min→94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 扩增30个循环→72℃ 7 min。使用GAPDH的上游引物(5′-TGAAGGTCGG- AGTCAACGGATTTGGT-3′)与下游引物(5′-CATGT- GGGCCATGAGGTCCACCAC-3′)扩增GAPDH作为内参, 扩增条件为94℃ 5 min→94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 40 s, 扩增30个循环→72℃ 7 min。将PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, SynGene软件进行拍照和分析处理。在进行定量分析时, 根据SYBR Green PCR Master Mix Kit的说明书中操作步骤执行real-time PCR, 利用ABI-PRISM 7000 Sequence De-tection System进行检测分析。
1.2.4 AC3-33基因亚细胞定位
构建pEGFP-C3-AC3-33真核表达质粒来表达AC3-33-GFP融合蛋白。转染293T细胞24 h后荧光显微镜观察。
2结果与分析
2.1高通量筛选的靶基因-人类ORF文库的构建
通过对NCBI的RefSeq数据库进行搜索, 得到大约 5 800个人类功能未知基因序列, 另外汇集其他来源的人类预测基因, 总计功能未知基因序列约6 900条。利用生物信息学对这些基因序列进行逐条的校正与分析, 挑出近3 000个EST支持较好的功能未知人类基因, 确定其ORF并设计引物进行PCR 扩增, 最终克隆到真核表达载体pcDB中, 共计得到了1 000多个克隆的人类ORF文库。在上述人类ORF 文库建立的基础上, 本实验选取其中650个基因及其剪接体的ORF克隆用于功能筛选研究。
2.2基于AP-1通路的相关基因筛选平台的建立与
鉴定
为了获得参与AP-1信号转导通路的新的调控基因, 我们以AP-1顺式双荧光素酶报告系统为基础, 建立了高通量的细胞筛选平台。报告质粒pFA-AP-1编码GAL4dbd和AP-1的融合蛋白, pFR-luc编码萤火虫(Firefly)荧光素酶分子, 其启动子区含有GAL4dbd的结合位点GAL4UAS, 所以萤火虫荧光素酶活性可以反映细胞内转录因子AP-1的活性(磷酸化形式)。
内对照质粒pRL-TK编码海肾(Renilla)荧光素酶分子, 由TK启动子调控。由于本系统将用于大规模筛选, 所以其可靠性非常重要。实验中使用pcDB 空载体作为阴性对照, pcDB-MEK1作为激活AP-1的阳性对照。实验结果显示阳性对照分子的活性与预期相符, 验证了实验系统的可靠性。
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2.3 抑制AP-1活性新基因AC3-33的筛选结果
用AP-1通路的相关基因筛选平台, 我们筛选出阳性基因AC3-33。图1中刺激因子PMA (50 ng/mL) + Ionomycin (1 μmol/L)作用时间为8 h, AC3-33基因正义表达载体对AP-1的活性有明显的抑制作用, pcDB 为空白对照。
2.4 AC3-33生物信息学分析
我们克隆的人类新基因AC3-33 Homo sapiens chromosome 3 open reading frame 33 ), 该基因又名C3orf33、FLJ31139。其RefSeq: NM_173657; GeneID: 285315; UniGene: Hs.350846。该基因序列全长1 931 bp, 由 6 个外显子和 5 个内含子组成, 定位于3q25.31, 从271～1026 有一个编码251个氨基酸的
可读框, 编码一个约
29 kDa 的蛋白(图2)。
图1 人AC3-33的正义表达载体对于AP-1的活化具有
明显抑制作用
Fig. 1
Significantly inhibiting effect of AC3-33 sense expres-sion vector on AP-1 activation
图2 AC3-33 cDNA 的核苷酸及推定的氨基酸序列
下划黑线表明AC3-33的编码区(ORF); AC3-33定位在3号染色体, 由6个外显子和5个内含子组成。 Fig. 2 The full-length cDNA of AC3-33 gene and its deduced amino acid sequence
The ORF of AC3-33 is underlined region; AC3-33 located on chromosome 3, with 6 exons and 5 introns.
第5期
刘鹏等: 一个抑制AP-1活性的人类新基因AC3-33的克隆和初步功能研究 579
2.5 AC3-33与其他物种的同源性分析
通过Ensembl 数据库BLASTn 比对, 可以检索到的AC3-33在人类(Homo sapiens )、猩猩(Pan troglo-dytes )、恒河猴(Macaca mulatta )、非洲象(Loxodonta africana )、牛(Bos taurus )、家猫(Felis catus )家犬(Canis familiaris )、大鼠(Rattus norvegicus )、小鼠(Mus musculus )等物种中存在同源物, 见图3、图4, 说明AC3-33是一个进化比较保守的基因。 2.6 AC3-33基因的表达谱分析
Northern blot 的结果证实了AC3-33 mRNA 的存在(图5), 在人正常脑、心、睾丸、肌肉、肺组织中可见特异性条带, 其大小约2.1 kb, 这与生物信息学分析的结果(1 931 bp)相吻合。另外, RT-PCR 结果显示AC3-33在多种人正常组织中表达, 在肌肉、脑、肺组织高表达, 在胎盘、心脏、肠组织中低表达; 在睾丸未见表达(图6)。在大多数人细胞系中有不同程度的表达, 其中在HeLa 、293T 、HT29、H1299细胞中呈中高表达, 在HepG2、MG63、293细胞中呈中等程度表达, 在Lncap 细胞中显著低表达(图7)。 图3 利用DNAMAN 软件进行不同物种AC3-33蛋白的
同源性分析
1: 人; 2: 猩猩; 3: 恒河猴; 4: 非洲象; 5: 牛; 6: 家猫; 7: 家犬; 8: 大鼠; 9: 小鼠。
Fig. 3 Homology comparison of AC3-33 gene among different species by DNAMAN
2.7 AC3-33蛋白的亚细胞定位分析
1: Homo sapiens ; 2: Pan troglodytes ; 3: Macaca mulatta ; 4: Loxodonta africana ; 5: Bos taurus ; 6: Felis catus ; 7: Canis familiaris ; 8: Rattus norvegicus ; 9: Mus musculus.
为了分析AC3-33在细胞内的定位情况, 我们构建了pEGFP-C3-AC3-33真核表达质粒来表达
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图4 AC3-33蛋白质序列同源性比对分析
1: 人; 2: 猩猩; 3: 恒河猴; 4: 非洲象; 5: 牛; 6: 家猫; 7: 家犬; 8: 大鼠; 9: 小鼠。
Fig. 4 Homology analysis of AC3-33 protein among different species
1: Homo sapiens;2: Pan troglodytes;3: Macaca mulatta;4: Loxodonta africana;5: Bos taurus; 6: Felis catus; 7: Canis familiaris; 8: Rattus norvegicus;9: Mus musculus.
第5期
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AC3-33-GFP 这一融合蛋白。转染293T 细胞并用细胞核特异性染料DAPI 染核后, 荧光显微镜观察。结果发现AC3-33 -GFP 融合蛋白分布在胞浆, 提示AC3-33是一个定位于细胞质的蛋白(图8)。
3 讨 论
图5 AC3-33的Northen blot 分析
功能基因组学研究的目的是阐述基因及其编码蛋白质的生物学功能。与20世纪80至90年代采用传统生物学途径研究人类功能基因不同的是, 目前对功能基因的研究大多采用“反向生物学研究”策略。这种研究策略是以克隆得到DNA 为切入点, 再
通过蛋白质表达研究其功能, 其优势就是现在基因信息越来越丰富, 基因克隆技术也日臻成熟。这种研究策略包括两条殊途同归的路线: (1)数据库DNA 序列→蛋白表达→细胞筛选→动物模型→人体内功能及疾病关联性; (2)疾病标本→DNA 标本→致病基因或易感基因分析→蛋白质分析→突变型基因对细胞表型影响→动物模型→人体内功能和疾病分子机
理 [9]。这两种技术路线均需要整合一系列的新技术, 如生物芯片、生物信息、蛋白质组学、结构基因组学、酵母双杂交、基因敲除及RNAi 等。而其中一个必不可少的关键技术是细胞水平的功能筛选技术,
Fig. 5 Analysis of AC3-33 gene expression by Northern blot
图6 AC3-33在人正常组织中的RT-PCR 分析
Fig. 6 Assay of the expression of AC3-33 in normal tissues by
RT-PCR
图7 AC3-33在人细胞系中的RT-PCR 分析
Fig. 7 Assay of the expression of AC3-33 in different human cell lines by RT-PCR
图8 AC3-33的亚细胞定位
Fig. 8 Sub-cellular localization of AC3-33
这一技术发挥了承上启下的作用, 可以看作是功能基因研究的枢纽环节, 特别是新药开发中应用的高通量(high throughput)和高内涵(high content)细胞筛选技术在功能基因研究中发挥越来越重要的作用。
AP-1 活性的调节十分复杂, 不仅受各组分表达差异、转录、翻译后调节, 还与癌蛋白及辅助蛋白跟AP-1 相互作用有关, 且AP-1 成员之间也存在着相互促进或拮抗作用。研究表明, 化学抑癌药物可通过抑制AP-1 活性对肿瘤形成的各个阶段起到
预防和抑制作用[10], 如川陈皮素(Nobiletin)和Ascochlorin(从真菌中提取的抗肿瘤药)通过降低AP-1 的DNA 结合活性下调MMP-7 和MMP-9 表达, 阻止肿瘤侵袭和转移[11, 12]; 染料木黄酮通过抑制NF-κB 和AP-1 活性来抑制uPA 分泌, 对乳腺癌细胞迁徙和浸润有抑制作用[13]。结果提示我们可通过抑制AP-1, 进而抑制其调节的相关基因表达来发现抗肿瘤新药。业已证实, 反义技术和基因敲除AP-1 可明显抑制细胞增殖和转化, 但对AP-1活性
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有调控作用的基因和蛋白研究却鲜见报道。发现抑制AP-1 活性的新基因及其蛋白, 无疑将为肿瘤等疾病的基因治疗提供新手段, 必将在疾病治疗中有重要的临床应用价值。
为筛选新的AP-1信号转导通路调节基因, 我们利用GAS/pRL双荧光素酶报告基因检测系统建立了AP-1高通量细胞筛选体系, 通过对表达文库中的650个克隆逐个筛选, 发现AC3-33这个未曾报道的AP-1信号通路调节基因。AC3-33是一个没有任何功能及机制方面研究报道的新基因, 通过对RefSeq数据库的搜索和Est拼接, 我们克隆得到其ORF, 成为我们新基因ORF文库中的一员。利用本文第一部分所建立的细胞存活相关基因的高通量筛选平台初步筛选结果显示, AC3-33可以明显抑制AP-1通路报告基因的活性。
AC3-33蛋白与其他人类已知蛋白质没有明显的同源性, 亚细胞定位于细胞质中, 在不同物种中其氨基酸序列高度保守。AC3-33在多种人正常组织中表达, 在大多数人细胞系中有不同程度的表达。AC3-33的过量表达导致AP-1活性失调, 这可能与肿瘤等多种疾病直接相关, 我们正在进行对该新基因的生理功能及作用机理研究, 以期有更多新的发现, 为疾病的临床诊断和治疗提供理论基础。
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绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/805397342.html,
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
基因图位克隆的策略与途 径拟南芥 Ting Bao was revised on January 6, 20021
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植 物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是 十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物 学及各国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的 功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆 的几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1 个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/805397342.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L