第九章反常散射在确定蛋白质相角及绝对构型中的应用
9.1. 简介
反常散射已经不是一个新话题了，我们在第七章就已经介绍过。在第七章中我们了解到一个原子的反常散射是因为它的电子不能被视为一个完全自由的电子。这种效应跟波长有关，但是一般情况下，重原子比周期表中上面几行的轻原子效应要强。如果重原子在蛋白质
结构中存在，反常散射的结果就是衍射点h k l的强度和它的Bijvoet点对l k h不再相等。在第七章中，这种效应和同晶置换差值法结合，被用于搜索重原子的位置以及它们的位置修正。在本章中，会告诉你反常散射信息如何用于确定蛋白质衍射点的相角和蛋白质结构的绝对构型。而且还将讨论在多波长反常散射法中如何利用反常散射信息确定蛋白质的相角。
9.2. 反常散射法确定蛋白质相角
原则上讲，重原子反常散射对确定蛋白质相角的作用和同晶置换一样重要。如图9.1可以得到很好的解释。图中所示的三个半径分别为F P，F PH(+)和F PH(-)的圆；(+)(-)分别代表Bijvoet衍射点对。F P圆的圆心为O。F PH(+)的圆心在矢量-F H(+)的末端，F PH(-)的圆心在矢量-F H(-)的末端。F P圆和FPH(+)圆的交叉点是α1和α2表示两个可能的蛋白质相角。另外两个可能的相角在F P圆和F PH(-)圆的交叉点α’1和α’2。母体蛋白的衍射点（hkl）和（l k h）有相反的相角（4.11节），相角的正确选择是衍射点（h k l）为α1和衍射点（l k h）为α’1。图9.2用更简单的方法加以说明。在图上矢量-F H(-)用相反相角画出(以水平轴为对称的镜像)。这时假如数据没有误差的话，正确的相角就在三个圆环F P，F PH(+)和F PH(-)的交点上。这个结论是原则上可以用一个重原子同晶衍生物结合反常散射来解决蛋白质相角问题(SIRAS)。
图9.1
图9.2
9.3. 反常散射法改进蛋白质相角
在同晶置换法中，对每个衍射点都能够获得一条蛋白质相角的概率曲线： P iso (α)。假如从反常散射数据得到的信息也能表达为概率曲线P ano (α)，那么这些信息很容易和P iso (α)曲线结合 。该联合概率应为：P (α)= P iso (α)×P ano (α)。可以通过如下方法实现：
obs PH PH )()(PH F F ?=--+
在7.9.节中，它从等式7.28推得
)sin(2)()(H PH H PH PH αα-'''=
--+F f f F F
或 )sin(2
)()(H PH H H PH PH αα-=--+F k F F F (9.1)
这里 H
H F F f f k ''='''= ?PH calc 必须被表达为蛋白质相角αp 的函数。
在图7.12的三角形ABE 中，正弦定理给出
PH
P H P H PH )sin()(sin F F αααα-=--
或
)sin()(sin P H PH P H PH αααα-=
--F F
)sin(2)sin(2P H PH H
P H PH H
calc αααα-?-=-=?F k F F k F PH
理想情况下ΔPH calc =ΔPH obs 。实际上对每个衍射点calc obs ano )(PH PH ?-?=αε它与蛋白质相角αp 有关。该误差可与同晶置换法中的蛋白质相角三角形中的闭合误差ε相比。假设误差分布满足高斯分布：
??
????'-'=22ano ano )(2)(exp )(E N P αεα (9.2)
N'是归一化常数，(E’)2
是ε的方均值。因为反常散射的数据也来自同一晶体，不同晶不会导致)()(PH PH --+F F 值有误差。因此尽管这些差别很小，但)()(PH PH --+F F 的误差比PH PH F F -误差要小，E ’比E 也小很多，可以取为E /3。公式9.2现在可与P iso (α)结合(等式7.36)。反常散射数据和正确套的同晶数据结合时要小心，也就是说，给出正确蛋白质绝对构型（参见下一节）的电子密度的数据不要与错误的数据相合并。
如果多对同晶置换法包括反常散射信息，就被称为MIRAS 法。需要强调的是，在收集反常散射数据时，应该十分小心，因为Bijvoet 点对之间的强度差很小，一般收集Bijvoet 点对的数据时，在时间上要紧接着，以避免实验误差。
9.4. 怎样确定绝对构型
如果没有反常散射，同晶置换方法或者得到正确构型的蛋白质结构或它的对映体的结构(镜像)。如果电子密度的分辨率足够高的话，就可以看到氨基酸残基的C (α)的构型。氨基酸残基是L-构型，构型是耷正确很容易检查。如果在电子密度图中出现α螺旋，正确的蛋白质构型α螺旋应该呈现右手螺旋。然而，蛋白质的绝对构型还可以从Bijvoet 点对二者之间强度差中直接获得。这将在此讨论。
图9.1和9.2中描述的是重原子位置放置正确且|F PH (+)|>|F PH (-)|的情况。图9.3描述的是正确选择的一组轴， |F PH (+)|>|F PH (-)|的情况，但重原子位置选择是不正确的。因为从差值Patterson 函数图中选取了两个同等可能的中心对称相关的位置中的错误位置 (参见7.6节)。结果导致矢量F H (+)，-F H (+)，F H (-)， -F H (-)对水平轴产生反映。这导致圆F PH (+)和F PH (-)绕FP 圆中心O 旋转2ω的角度。通常得到不正确的F p 相角与正确值差2ω。如果反常散射信息同两个同晶置换数据中的每一个结相合,其正确结合给出的蛋白质电子密度图优于从不正确结合得到的电子密度图。
图9.3
另外一种确定绝对构型的方法如下，采用带反常散射的单对同晶置换法(SIRAS)，如前面所描述，两套相角对应于两套中心对称相关的两套重原子位置。由这两套蛋白质相角计算出第二个重原子衍生物PH(2)的差值Fourier 图，：
1. 振幅PH PH(2)F F -及一套SIRAS 相角及；
2. 振幅PH PH(2)F F -及另一套SIRAS 相角。 用正确相角（正确重原子位置）计算得到的差值Fourier 图将出现最高峰。这样就可以确认得到正确的绝对构型。
一种相对更简单的采用反常散射法确定绝对构型的方法叙述如下。根据公式9.1，H F 可以用下式表达：
[])()()sin(2PH PH H PH H --+-=F F k
F αα (9.3)
|F PH (+)|和|F PH (-)|是观察值，)(H PH αα-能从没有反常散射的同晶置换数据得到。|F H |用公式9.3计算得到一个正值。如果是重原子套的倒反映像被选取了，H α和PH α以及)(H PH αα-的值就会是正确值的相反数，获得的|F H |就成了负值。假如|F H |是用重原子贡献相对强的衍射点计算的，这就更容易选择了。这也可以用所有衍射点计算Fourier 图， |F H |振幅用公式(9.3)计算，相角值早同晶置换法得到。如果重原子位置选择正确，就会在相应的重原子位置上得到值为正的峰。如果重原子位置选反了，相应的位置就会得到值为负的峰。在计算Fourier 图时所采用的系数为：
[][][]H PH PH H PH H H exp )()()sin(2exp ααααi F F k i F --+-=
另外一种方法采用系数： ()[]PH PH PH exp )()(2
1αi F F --+
在该表达式中(与公式7.29相比)：
())sin(1)()(21H PH H PH PH αα-=--+F k
F F (9.1) 其中)(H PH αα-的符号正确或者错误决定了Fourier 图在相应的重原子位置的峰是正还是为负。
9.5. 多波长反常散射(MAD)
图9.4
如果蛋白质分子中有反常散射原子，则能利用Bijvoet 点对强度|F h (+)|2和|F h (-)|2之间的差值测定蛋白质相角。在多波长法中利用了反常散射对波长的依赖关系。这种方法的原理很早就有，直到可调同步辐射光源的产生才使得这种方法在蛋白质结构测定中成为技术上行得通的方法。Hendrickson 和他的同事（Hendrickson 等，1988；Krishna Murphy 等，1988）首先考虑了这一方法的优点,并采用这种方法解得蛋白质结构（见Guass 等，1988）。当然，蛋白中应该包含产生足够强的反常散射信号的元素。因此，元素周期表上部几行的元素是不合适的。Hendrickson 证明对不大于150个残基的蛋白中存在一个Se 元素（原子序列34）对于成功地用MAD 法解析结构已经足够（Hendrickson 等，1990；Leathy 等，1992）；然而，主要还是取决于收集到衍射数据的质量。Se 原子越多，蛋白质分子当然可以更大。一种往蛋白质分子中引入Se 原子的方法是以Se-甲硫氨酸底物代替含甲硫氨酸的底物生长微生物。运用该方法的条件是谨慎选择各种波长使Bijvoet 点对之间强度差最佳,也使在被选各波长衍射之间的强度差最佳。这里讨论最常见的只有一种反常散射原子的情况。这一讨论是基于Karle 对问题的处理 (参见Karle ，1980 )，它的优点是结构中所有原子的非反常散射与同波长有关的部分分开。每个反常散射原子都有原子散射因子f i f f f ''+?+=0( 7.8节)。图9.4中F B 是非反常散射原子贡献的结构因子，F A 是反常散射原子的非反常散射部分对结构因子的贡献，F AB = F B +F A 是完整的非反常散射部分。反常散射贡献的结构因子是 a F F =?''+??A 0
A 0f f i f f
φBA 是F AB 的相角，φA 是矢量F A 的相角,φa 是矢量a 的相角。Δφ=φ
BA +(180°– φ
a )=( 180°+ (φBA –φa ))。
把|F (h)|写成|F |，应用余弦定理： ?Φ??-+=cos 2BA 2
2BA 2a F a F F
和
2A 2
0222
)()(F f f f a ?''+?= 2A 20
222BA 2)()(F f f f F F ?''+?+= )cos(cos 2BA A BA 0
a F F f f Φ-Φ??+δ )cos(sin 2BA A BA 0a F F f f Φ-Φ?''+δ φa = φA +δ； cos(φBA –φa ) = cos(φBA –φa –δ)
因为φBA 与φA 和波长λ无关，而δ取决于λ，余弦可被分割成
cos(φBA –φa )cos δ+sin(φBA –φa )sin δ
2A 20222BA
2)()(F f f f F F ?''+?+= {}{}
)sin(sin )cos(cos sin 2)sin(cos sin )cos(cos 2A BA 2A BA A BA 0
A BA A BA 2A BA 0Φ-Φ+Φ-Φ??''+Φ-Φ+Φ-Φ???+δδδδδδF F f f F F f f
把cos(φ
BA –φA )项和sin(φBA –φA )项归并在一起，得到
2A 2
0222BA 2)()(F f f f F F ?''+?+= })sin(sin 2cos sin 2)cos(cos sin 2cos 2A BA 200A BA
A BA 020A BA Φ-Φ??????''+???+Φ-Φ??????''+???+δδδδδδf f f f F F f f f f F F
因为 000cos sin cos f f f f f f ?=???
?
??''+?δδδ 和 000sin sin cos f f f f f f ''=???
?
??''+?δδδ
我们最终得到 [])sin()cos(A BA A BA BA BA 2A 2BA 2Φ-Φ+Φ-Φ??++=r q F F F p F F
这里
()()2022f f f p ''+?=，02f f q ?=，0
2f f r ''= p ，q 和r 是λ的函数可从原子吸收系数推得。Friedel 点对的|F |2值不同，但可以实验测定。未知量是| F BA |，| F A |和(φBA -φA )，它们都与λ无关，除了(φBA -φA )的符号外，对Friedel 点对来说, 这三个量是相等的。因此，一个λ值对应的数据套给出两套计算这三个量的公式，原则上说，在两个不同波长的测量已经足够用于测出每个衍射点的| F BA |，| F A |和(φBA -φA )了。要计算蛋白质的电子密度图还需要φBA 。这可从解A-结构来获得，也就是说从用|F |2作系数的Patterson 图中确定反常散射原子,或用直接法确定反常散射原子。从A-结构可以计算出φA ，从而与已知的(φBA -φA )值解得φBA 。Terwilliger （1994a ）指出|FA|的估计值高得不可信。他引入| F A |期望值的概率函数, 并且与MAD 信息结合，他得到了| F A |的加权平均值作为改进的| F A |的值。而且他把色散差)()(j i F F F λλ-=?看作同晶置换信息。(Terwilliger ，1994b)。
因为在计算A-结构时，反常散射没有被考虑，得到的是真实结构或对映体结构。解决这个问题的方法是计算两个结构的φA 值。于是得到两个φBA 值和两套蛋白质电子密度图，在其中选择最好的图。这种方法的好处是不同晶在这里不产生影响。如果晶体的衍射寿命足够长的话，所有衍射数据都可以从同一个晶体中获得。
从实践的观点来看，MAD 法在进行X 射线衍射强度收集和处理过程中需要特别小心，因为其产生的强度差是很小的。波长的选择应该使|F (h k l)和|F (h k l )之差以及色散差)()(j i F F F λλ-=?为最佳。)(i F λ是|F (h k l)和|F (h k l )在波长λi 的平均值。
反常散射对原子散射因子的贡献是反常散射元素的原子吸收系数的函数，它可以从原子吸收系数的实验值求得。吸收系数要在元素的吸收边及离吸收边一小段距离上进行测量。因为吸收边的精确位置取决于元素的化学环境，原子吸收系数光谱作为X 射线波长(或光子能量)的函数的应从晶体本身测量。通常通过测量元素被入射线激发产生的荧光来完成测量。荧光是吸收的产物，因为在吸收时一个电子从它的原子轨道跃迁，当另一电子占据了这一空位置时发出荧光辐射。荧光辐射的波长是辐射元素的特征。在将荧光光谱转换为原子吸收光谱时，要进行背景修正和比例修正，以使原子吸收系数的实验值与理论值相吻合。理论值无法在吸收边区域内精确计算，只能在吸收边区域外进行精确计算。
)(2?+?+-?=c b a R s a μ
a μ是原子吸收系数，R 是荧光比)()(0fl E I E I 。)(fl E I 是荧光强度，)(0E I 是入射线强度。E 是入射光能量，Δ=E - E 0，E 0对应在吸收边的光子能量。S 是比例因子，它与E 无关。根据实验值和理论值尽可能靠近的原则选择s ，a ，
b 和
c 。
反常散射对原子散射因子的贡献可以应用文献所给的关系式，例如James(1965)和Hendrickson(1988) 通过原子吸收系数μa 求得。
有关MAD 的结论：原则上MAD 是一种非常好的确定相角的方法。它需要在蛋白质分子中有一个反常散射的原子。尽管这种方法已经成功地应用于好几种结构的解析，但它不是一个方便的方法。因为它的复杂性,如可调同步辐射光源，费力的数据测量。采用这种方法必须谨慎。因此，它不像MIR ，MIRAS 或分子置换方法那样普及。它最大的优点在于所有测量可以仅在一个晶体上进行，可以达到完全同晶的要求。
小结：
原子中结合最为紧密的电子产生可测量的X 射线的反常散射。对轻原子（C ，N 和O ）这一效应可以忽略不计。但较重原子（对于普通波长的X 射线，S 以后的元素）会产生可测量的影响，引起Friedel 点对的强度有了差别。因为这一强度差本身很小，更精确地测量强度是很重要的。
从反常散射数据中可以得到两种信息：
1．真实结构和对映体的选择；
2．相角信息：它可以加到同晶置换信息中去, 如果蛋白质晶体中有反常散射原子，选择合适的X射线波长收集数据,它能提供母体蛋白质晶体的相角信息。
免疫学的临床应用有两个方面：一是应用免疫理论来阐明许多疾病的发病机制和发展规律；二是应用免疫学原理和技术来诊断和防治疾病。本章内容主要是后者。此外，免疫学不仅应用于传统的传染病中，而且在肿瘤、自身免疫病、免疫缺陷病、器官移植、生殖免疫等中均广泛应用。 免疫学防治是指应用免疫制剂或免疫调节药物调整机体的免疫功能，对疾病进行预防和治疗。特异性免疫的获得方式有自然免疫和人工免疫两种。自然免疫主要指机体感染病原体后建立的特异性免疫，也包括胎儿或新生儿经胎盘或乳汁从母体获得抗体而产生的免疫。人工免疫则是人为地使机体获得免疫，是免疫预防的重要手段，包括人工自动免疫、人工被动免疫和过继免疫。 人工自动免疫是给机体接种疫苗或类毒素等抗原物质，刺激机体产生特异性免疫。国内常将用细菌制作的人工主动免疫的生物制品称为菌苗，而将用病毒、立克次体螺旋体等制成的生物制品称为疫苗，而国际上把细菌性制剂，病毒性制剂及类毒素统称为疫苗。经人工自动免疫产生的免疫力出现较慢，但免疫力较持久，故临床上多用于预防。人工自动免疫制剂其主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、类毒素、以及各种新型疫苗。 人工被动免疫是给机体输入抗体等制剂，使机体获得特异性免疫力，输入抗体后立即获得免疫力，但维持时间短，约2~3周，临床上用于治疗或紧急预防。人工被动免疫的生物制品主要有抗毒素、抗菌血清与抗病毒血清、胎盘球蛋白和血浆丙种球蛋白。 过继免疫治疗是指给患者转输具有在体内继续扩增效应细胞的一种疗法。如给免疫缺陷病患者转输骨髓细胞；给肿瘤患者输入体外激活扩增的特异肿瘤浸润淋巴细胞或非特异性的LAK细胞等。应用时应考虑供者与受者之间HLA型别是否相同，否则输注的细胞会被迅速清除，或者发生移植物抗宿主反应。再如造血干细胞移植：取患者自身或异体骨髓或脐血输入患者，移植物中的多能干细胞可在体内定居、增殖、分化、使患者恢复造血功能和形成免疫力。造血干细胞移植可用于治疗再生障碍性贫血、白血病以及某些免疫缺陷病和自身免疫病等。 在医学制剂影响免疫功能的制剂主要有两类：免疫增强剂和免疫仰制剂。免疫增强剂是指通过不同方式，达到增强机体免疫力的一类免疫治疗药物。临床上常用于治疗与免疫功能低下有关的疾病及免疫缺陷病。免疫增强剂种类很多，按其作用的先决条件可分为三类：一是免疫替代剂，用来代替某些具有免疫增强作用的生物因子的药物。按其作用机制可分为提高巨噬细胞吞噬功能的药物，提高细胞免疫功能的药物，提高体液免疫功能的药物等；按其作用性质又可分为特异性免疫增强剂和非特异性免疫增强剂；按其来源则可分为细菌性免疫增强剂及非细菌性免疫增强剂。二是免疫恢复剂，能增强被抑制的免疫功能，但对正常免疫功能作用不大。常用的免疫增强剂如：卡介苗、短小棒状杆菌、内毒素、免疫核糖核酸、胸腺素、转移因子、双链聚核苷酸、佐剂等。免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物。能抑制与免疫反应有关细胞的增殖和功能，能降低抗体免疫反应的制剂。常用的免疫抑制剂主要有五类：（1）糖皮质激素类，如可的松和强的松、泼尼松龙等；（2）微生物代谢产物，如环孢菌素和藤霉素等；（3）抗代谢物，如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等；（4）多克隆和单克隆抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白和OKT3等；（5）烷化剂类，如环磷酰胺等。 免疫学诊断是指应用免疫学原理和方法对传染病、免疫性疾病等进行和免疫功能进行测定。由于免疫学检测具有高特异性和敏感性，因此常用临床诊断的一种重要手段。目前常用的免疫诊断方法具有体液免疫试验。细胞免疫试验和皮肤试验三种。 抗原抗体反应在体内表现为溶细胞、杀菌、促进吞噬、中和毒素或引起免疫病理损伤等；在体外可出现凝集、沉淀、细胞溶解和补体结合等可见反应。由于抗体主要存在于血清中，临床上多用血清标本进行试验，故体外的抗原抗体反应曾被称为血清学反应。但随着免疫学
【实验目的】 了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。 【实验原理】 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。 如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。 经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。 2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。 由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。 对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系
统和125I标记系统。 【实验操作】 ⒈.蛋白质的分离 根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。 分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。 ⒉.电转移 ⑴准备PVDF膜
早在1000多年前，人们就发现了免疫现象，并由此发展起来对传染病的免疫预防。中国人首先发明了用人痘痂皮接种以预防天花，并且在十五世纪中后期的明朝隆庆年间有较大改进，并得到广泛的应用。后来，这一伟大发明传播到日本、朝鲜、俄国、土耳其和英国等许多国家。后英国医生琴纳据此研究出用牛痘菌预防天花的方法，为免疫学对传染病的预防开辟了广阔的前景。全世界能在20世纪70年代末消灭天花，接种牛痘菌发挥了巨大作用。[1] 19世纪末，法国化学家、微生物学家巴斯德于研究人和动物的传染病时，分析了免疫现象。并在琴纳的启发下，他发明用减毒炭疽杆菌苗株制成疫苗，预防动物的炭疽病；用减毒狂犬病毒株制成疫苗，预防人类的狂犬病。 著名动物学家梅契尼科夫在长期研究昆虫和动物细胞吞噬异物的现象后，于1883年指出体内的白细胞和肝、脾组织中的吞噬细胞具有吞噬和消化细菌的能力。德国细菌学家、免疫学家贝林于1890年发现免疫血清中有抗白喉毒素的抗毒素存在，日本细菌学家北里柴三郎也发现抗破伤风毒素的抗毒素，两人共同研究血清疗法成功，对治疗白喉和破伤风患者取得良好效果。 从此，人们开始探讨免疫机制，把细胞的吞噬作用和抗毒素的中和作用看成是特异性免疫的根据，并逐步开展细胞免疫和体液免疫两大学派的争鸣。 细胞免疫学派的首领是梅契尼科夫，体液免疫学派的首领是德国细菌学家埃尔利希。埃尔利希用生物化学方法研究免疫现象，特别是以蛋白质化学和糖化学作为基础，探讨抗原和抗体的本质及其相互作用，于1896年提出抗体形成的侧链学说，这一学说直到今天还具有实际意义。两大学派的争鸣促进了免疫学的发展。 到20世纪60年代，对体液免疫的研究已经达到分子生物学的水平，已经弄清抗体的分子结构和功能。同时，对细胞免疫的研究也取得了明显的进展，过去认为小淋巴细胞是处于衰老终末期，而现在
蛋白印迹法（Western-blot） 一、基本原理 细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。 本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。WB的原理如下。 Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS—PAGE）法分离蛋白质。SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为1.4：1g 。同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和?-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。
分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱. Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。为此人们设计了能与一抗结合的抗体，成为第二抗体（简称二抗）。二抗是将一抗的FC段作为抗原的，而每一物种的抗体FC段氨基酸序列都较为保守，这使得二抗能够大量生产，因而对二抗进行标记也就较为容易了。二抗与一抗能通过抗原抗体特异性结合后，以一定的方法对二抗上的标记进行检测便可检出靶蛋白。 二、器材 电热水浴箱、玻璃匀浆器、冷冻离心机、滤纸、水平摇床、电转移装置、醋酸纤维素膜（NC膜）、电泳仪、试管、微量移液器、Tip头、Epp管（2ml、5 ml、1.5 ml） 三、试剂配制： 1）、1.5M Tris—Hcl, pH8.8：18.16g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至8.8，定容至100 ml，4℃保存。 2）、1.0M Tris—Hcl, pH6.8：12.12g Tris溶于60 ml ddH2O，用浓盐酸调节PH至6.8，定容至100 ml，4℃保存。 3)、10％SDS：10g SDS溶于90 ml ddH2O，轻柔搅拌，溶解后加水
生物质谱技术在蛋白质组学中的应用（北京大学药学院 杨春晖 学号：10389071） 一、 前言[1，2] 基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道，也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组研究中发挥重要作用。 目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点，第一向在pH梯度胶内等电聚焦，然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展，生物质谱当上了主角，蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF，其分析容量大，单电荷为主的测定分子量高达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS 联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术，并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。 二、 生物质谱技术[3，4] 1．电喷雾质谱技术（ESI）[5] 电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 2．基质辅助激光解吸附质谱技术（MOLDI）[5-7] 基质辅助激光解析电离（MOLDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹烘干形成共结晶，放入离子源内。当激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配，因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少，可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞
《蛋白质工程》课程教学大纲 赵艮贵 课程名称：蛋白质工程 课程类型: 专业基础课 总学时：讲课学时：36 学分：2 适用对象: 生物技术专业 先修课程：生物化学，细胞生物学，分子生物学，基因工程 一、课程性质、目的和任务 蛋白质工程是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学等的发展密切相关，是融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。由于蛋白质工程学科的边缘性，所以本课程在介绍蛋白质基本内容的同时，兼顾学科发展动向，旨在使学生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 二、教学基本要求 通过本课程的学习，使学生掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在蛋白质工程上的应用及典型研究实例，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，为未来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。
重点内容包括蛋白质分子基础、分子设计、折叠、理化性质、结构解析与预测以及蛋白组学、生物信息学在蛋白质工程中的应用、蛋白质的分离纯化鉴定技术和现代生物技术在蛋白质工程中的应用。难点蛋白的分子设计和结构解析。 五、实践环节 独立开课六、参考性教学时间安排 4 蛋白质分子设计 4 蛋白质的修饰和表达2 蛋白质的物理化学性质3 蛋白质结构解析 3 生物信息学在蛋白质工程中的应用 4 蛋白质的分离纯化与鉴定4 现代生物学技术在蛋白质工程中的应用4 蛋白质组学 蛋白质工程的应用3 七、考核方式 期末笔试 八、推荐教材和教学参考书 教材： 《蛋白质工程》（第二版），汪世华主编，科学出版社，2008. 普通高等教育十一五规划教材
不同的.构成DNA分子的基本单位是脱氧核苷酸,许许多多脱氧核苷酸通过一定的化学键连接起来形成脱氧核苷酸链,每个DNA分子是由两条脱氧核苷酸链组成.DNA分子结构的特点是：①DNA分子的基本骨架是磷酸和脱氧核糖交替排列的两条主链；②两条主链是平行但反向,盘旋成的规则的双螺旋结构,一般是右手螺旋,排列于DNA分子的外侧；③两条链之间是通过碱基配对连接在一起,碱基与碱基间是通过氢键配对在一起的 蛋白质的结构：（氨基酸-多肽-肽链-蛋白质） 一级结构：构成蛋白质的单元氨基酸通过肽键连接形成的线性序列,为多肽链. 氨基酸在蛋白质分子中的连接方式 1．肽键 蛋白质分子中的氨基酸之间是通过肽键相连的,—个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合,即形成肽键(酰胺键,图2-1-2). 2．肽与多肽链 图2-1-2 肽与肽键 氨基酸通过肽键(-CO-NH-)相连而形成的化合物称为肽(peptide).由两个氨基酸缩合成的肽称为二肽,三个氨基酸缩合成三肽,以此类推.一般由十个以下的氨基酸缩合成的肽统称为寡肽,由十个以上氨基酸形成的肽被称为多肽(polypeptide)或多肽链. 氨基酸在形成肽链后,氨基酸的部分基团已参加肽键的形成,已经不是完整的氨基酸,称为氨基酸残基.肽键连接各氨基酸残基形成肽链的长链骨架,即…Cα-CO-NH-Cα…结构称为多肽主链.各氨基酸侧链基团称为多肽侧链.每个肽分子都有一个游离的α-NH2末端(称氨基末端或N端)和一个游离α-COOH末端(称羧基末端或C端).每条多肽链中氨基酸顺序编号从N端开始.书写某多肽的简式时,—般将N端书写在左侧端. (二)蛋白质分子的一级结构 1．蛋白质分子的一级结构 多肽链中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构.氨基酸排列顺序是由遗传信息决定的,氨基酸的排列顺序是决定蛋白质空间结构的基础,而蛋白质的空间结构则是实现其生物学功能的基础.1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,这是世界上第一个被确定一级结构的蛋白质(图2-1-3).同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构.生物化学由此迈向了一个更高层次——分子生物学时代. 图2-1-3 人胰岛索的一级结构 (三)蛋白质分子的空间结构 蛋白质分子井非如一级结构那样是完全展开的“线状”,而是处于更高级的水平.天然蛋白质可折叠、盘曲成—定的空间结构(三维结构).蛋白质的空间结构指蛋白质分子内各原子围绕某些共价键的旋转而形成的各种空间排布及相互关系,这种空间结构称为构象.按不同层次,蛋白质的高级结构可分为二,三和四级结构. 1．蛋白质的二级结构 多肽链主链中各原子在各局部的空间排布,即多肽链主链构象称为蛋白质的二级结构. (1)形成二级结构的基础——肽键平面：20世纪30年代末,Pauling L和Corey R开始对肽进行x线结晶衍射图研究,以探索蛋白质的精细结构.他们测定了分子中各原子间的标准键长和键角,发现肽单元(主链的-CαCN-)呈刚性平面(rigid plane),即肽键平面(图2-1-4). 图2-1-4 肽键平面和Cα“关节”示意图 由于C-N键具有部分双键性质,因此C＝O和C—N均不能自由旋转.所以整个肽链的主链原子(-CαCN-CαCN-)中只有N-Cα和Cα-N之间的单键可以旋转,N -Cα之间的旋转角为φ (phi),Cα-C之间的旋转角为ψ(psi).φ和ψ的大小就决定了Cα相邻两个肽键平面之间的相对位置关系,于是肽键平面就成为主链构象的结构基础.如每个氨基酸的ψ和φ已知,整个多肽链的主链构象就确定了. (2)蛋白质二级结构的基本形式：蛋白质的肽链局部盘曲、折叠的主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和不规则卷曲等几种形式. 1) α-螺旋：肽链的某段局部盘曲成螺旋形结构,称为α-螺旋(图2-1-5).α-螺旋的特征是：①—般为右手螺旋；②每螺旋圈包含3.6个氨基酸残基,每个残基跨距为0.15nm,螺旋上升1圈的距离(螺距)为 3.6×0.15=0.54nm； = 3 \* GB3 ③螺旋圈之间通过肽键上的>C＝O和-NH-间形成氢键以保持螺旋结构的稳定；④影响α-螺旋形成的主要因素是氨基酸侧链的大小、形状及所带电荷等性质. 图2-1-5 α-螺旋示意图 2)β-折叠：为—种比较伸展、呈锯齿状的肽链结构.两段以上的β-折叠结构平行排布并以氢键相连所形成的结构称为β-片层或β-折叠层.β-片层可分顺向平行(肽链的走向相同,即N、C端的方向一致)和逆向平行
蛋白质质谱分析研究进展作者：汪福源蛋白质质谱分析研究进展摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。1．质谱分析的特点质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。2．质谱分析的方法近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。3．蛋白质的质谱分析蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
《蛋白质工程的应用》教案 教学目标 1、举例说出蛋白质工程崛起的缘由。 2、简述蛋白质工程的原理。 3、尝试运用逆向思维分析和解决问题。 教学重难点 (1)为什么要开展蛋白质工程的研究？ (2)蛋白质工程的原理。 课时数 本节教学建议用1课时。 教学过程 (1)采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步，学习内容较少。如何学得充实，又让学生悟出些终身学习的道理，建议采用“问题—探究—新问题—再探究”的教学模式。 新课一开始，可以带领学生回忆原有知识：要想让一种生物的性状在另一种生物中表达，在种内可以用常规杂交育种的办法实现，但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流，就显得力不从心了。基因工程的诞生，为克服这一远缘杂交的障碍问题，带来了新的希望。于是取得了丰硕成果：大肠杆菌为人类生产出了胰岛素，牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物，烟草植物体内含有了某种药物蛋白……至此，人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了，生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的，它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识，可调动学生从书中找实例(干扰素例子、工业用酶的例子)加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造，制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索，蛋白质工程应运而生了。 (2)建议加强与已有知识的联系，用逆向思维的方法解决新问题。 学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图1-4所示。 遗传信息的流动方向
蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 已有2975 次阅读2008-6-19 10:43 |个人分类:生活点滴 蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化 抽滤 抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。 点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。 另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。 当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面： 去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。 样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。 含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。而粘性样品要用缓冲液稀释。 Western印迹 Western印迹含一系列步骤，包括： ?? 用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。 ?? 将胶上的蛋白转移到膜上。 ?? 鉴定膜上特定蛋白。 下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。 用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物 印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维（1-D）SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。有时用非变性电泳分离天然蛋白质。尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。 二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。 分子量标准 在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。 聚丙烯酰胺浓度 凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
《蛋白质工程》教学大纲 Protein Engineering 课程编码：27A11714 学分：1.5 课程类别：专业任选课 计划学时：24 其中讲课：24 实验或实践：0 适用专业：生物技术专业 推荐教材：刘贤锡著，《蛋白质工程原理与技术》，山东大学出版社，2002年。 参考书目：汪世华著，《普通高等教育"十一五"规划教材-蛋白质工程》，科学出版社，2008年。 课程的教学目的与任务 通过本课程的学习，掌握蛋白质工程的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及蛋白质工程的应用，熟悉从事蛋白质工程的重要方法和途径。形成科学的思维方式、培养学生科学思维能力和勇于探索、善于思考、分析问题的能力，激发学生对蛋白质工程的学习热情，为将来的学习和工作奠定坚实的理论和实践基础。 课程的基本要求 本课程的教学目的是使学生掌握蛋白质和蛋白质工程的概念，并在此基础上通过对蛋白质分子设计、蛋白质的热力学和动力学、蛋白质的修饰和表达、蛋白质的结构的学习，加深蛋白质的功能和应用的掌握,通过蛋白质组学的学习了解蛋白质工程的原理。同时兼顾学科发展动向，着重涉及当今蛋白质工程的应用。旨在使本科生了解现代蛋白质工程理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。 各章节授课内容、教学方法及学时分配建议（含课内实验） 第一章：绪论建议学时：2 [教学目的与要求] 了解蛋白质工程发展的历史及理论基础、基本研究内容与研究程序，掌握蛋白质结构与功能的关系，了解蛋白质工程的发展方向。 [教学重点与难点] 本部分教学重点也是难点为蛋白质结构与功能的关系。 [授课方法] 以课堂讲授为主，课堂讨论和课下自学为辅。 [授课内容] §1.1 蛋白质工程概论 蛋白质工程的理论基础 蛋白质工程的研究内容 蛋白质工程的基本程序 §1.2蛋白质工程的应用 研究蛋白质结构与功能的关系 改变蛋白质的特性 生产蛋白质和多肽类活性物质
蛋白质的空间结构和功能 1．构象(conformation)指的是，一个由多个碳原子组成的分子，因单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基或原子的空间排列，只需单键的旋转即可造成新的构象。多肽链主链在形式上都是单键。因此，可以设想一条多肽主链可能有无限多种构象。然而，一种蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和pH下只有一种或很少几种构象，并为生物功能所必需。这种天然的构象是什么样的因素促成的? 答：①由于肽键因共振结构而使C—N键具有部分双键的性质，不能自由旋转，因而使得一条多肽主链构象的数目受到了极大限制。②与位于相邻刚性平面交线上的Cα相连接的侧链基团的结构、大小和性质对于主链构象的形成及稳定有很大的影响，使多肽链主链构象数目又受到很大的限制。因为Cα与两个刚性平面连接的单键的旋转度不同程度受到侧链的限制。③各种侧链基团相互作用所形成的各种力使蛋白质在热力学上达到了一种最稳定的构象 2．假若一条多肽链完全由丙氨酸构成，什么样的环境促使它很可能形成α–螺旋，是疏水环境还是亲水环境? 答；一条多肽链呈α-螺旋构象的推动力是所有肽键上的酰胺氢和羰基氧之间形成的链内氢键。在水环境中，肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部(α-螺旋内)的氢键，也能与水分子形成氢键。如果后者发生，多肽链呈现类似变性蛋白质那样的伸展构象。疏水环境对于氢键的形成不能提供任何竞争，因此，更可能促进α-螺旋结构的形成。 3．以nm为单位计算α-角蛋白卷曲螺旋（coiled coil）的长度。假定肽链是由100个残基构成。 答：α-角蛋白的每条肽链呈α-螺旋构象，而每个α-螺旋含 3.6个残基。在α-角蛋白中，每轮螺旋的长度为0.51nm。因此, α-角蛋白卷曲螺旋（coiled coil）的长度是： （100残基÷3.6个残基/轮）×0.51/轮＝14.2nm 4．一种叫做Schistosoma mansoni 寄生虫的幼虫能感染侵入人的皮肤。这种幼虫分泌出能裂解的-Gly-Pro-X-Y-（X和Y可能是几种氨基酸中的任何一种）顺序中的X和Y之间肽键的酶。为什么该酶活性对这种寄生虫侵入是重要的。 答：-Gly-Pro-X-Y-顺序频繁出现在胶原蛋白分子中，在身体的各部位都存在，包括皮肤。由于该幼虫酶能催化胶原蛋白多肽链裂解，故该寄生虫能进入宿主皮肤而生存。 5．①是T rp还是Gln更有可能出现在蛋白质分子表面？②是Ser还是Val更有可能出现在蛋白质分子的内部？③是Leu还是Ile更少可能出现在α-螺旋的中间？④是Cys还是Ser更有可能出现在β-折叠中？ 答：蛋白质氨基酸残基在蛋白质结构中出现的位置与这些氨基酸残基的亲水性或疏水性
蛋白印迹实验报告 篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验十二Western印迹鉴定目标蛋白 实验目的 1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法； 2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。 实验原理 Western印迹法简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位
素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。 试剂与器材 试剂 1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL； 2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中； 3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL； 洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20； 5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。 6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,
用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。高压灭菌20 分钟，室温保存。用前稀释至1x 。 7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。 器材 电泳装置一套; 2.电转移膜装置 3.抗体-酶反应摇床 操作方法 〈一〉电转移 1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。 2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。 3．剥胶，并将凝胶裁成合适大小，切角以做记号（2）。 4．按下图示制备“夹心饼”，打开电极板，在一边放上一块纤维垫，再依次往上叠加3-4张滤纸，将凝胶轻放于滤