10株镰刀菌r DNA 内转录间隔区(I TS )序列分析
陈玉玺,张利平*,吕志堂 (河北大学生命科学学院,河北保定071002)
摘要 [目的]探索镰刀菌菌株间的系统发育关系。[方法]采用氯化苄法从分离的10株镰刀菌菌株中提取基因组D N A,对其内转录间隔区(IT S )序列进行P CR 扩增和序列测定。采用B la st 方法将测序结果在G enB an k 中进行同源搜索,采用邻接法构建其与相关菌株的IT S 序列系统发育树。[结果]供试菌株分别位于系统发育树的3个分支上,7株与腐皮镰刀菌为一个分支,序列相似性为98.61%～100%。菌株F 94与尖孢镰刀菌为另一个分支,序列相似性为100%。菌株F 83和F 97与Fu sari um incar natu m 为另一个分支。各分枝内序列相似性均较高,为97.61%～100%,而不同分枝间菌株序列相似性较低。[结论]IT S 序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供参考依据。关键词 镰刀菌;IT S;系统发育分析
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)12-04886-02
A n a ly s is o f th e In te rn a l T ra n sc rib e d Sp a c e r (I T S)S eq ue n c e s in r D NA o f 10S tra in s o f Fusariu m sp p.CHEN Y u -x i e t a l (C o lle ge o f L ife S cien ce ,H ebe i U n iv er sity ,
B aod in g ,H ebe i 071002)A b s tra c t [O b je ctive]T h e a i mo f th e re se a rch w as to e xplo re th e ph y logen e tic co r re la tion s am on g th e stra in s o f Fu sari um spp.[M e th od]T h e g en o m ic D N A s w a s ex tracted from10iso la ted s tra in s o f Fusarium spp.by u s i n g ben zy l ch lo r ide m e th od an d P CRam p lifica tion an d sequ en cin g w ere m ade onits in -tern a l tran scr i bed space r (IT S )sequ en ce.T h e sequ en cin g re su lts w e re se arch ed fo r th e h o m o lo gy on G enB an k w ebs ite by u s in g B las t m e th od and th e IT S ph y logen e tic tree w ith th e re la ted stra in s w a s con stru cted by n e igh bor -jo in in g m e th od.[R esu lt]T h e te sted stra in s w e re loca ted i n3clade s o f th e ph y lo ge-n e tic tree.S ev en stra i n s an d Fu sarium so lani w e re cla ss ified in to on e clade ,w ithth e sequ en ce si m ila rity o f 98.61%～100%.S tra in F 94an d Fusarium oxy spo ru m w e re classifiedi n to an o th e r clade ,w ithth e sequ en ce si m ilar ity o f 100%.A n d s tra in s o f F 83,F 97and Fusariumincar natu m w e re cla ssified in -to th e th ird clade.T h e sequ en ce si m ila rityin side each c lade w ere a ll h igh e r ,be in g 97.61%～100%.B u t th e sequ en ce s i m ila r ity o f stra in s am on g d iffer-en t clade s w e re low e r .[
C on c l u sion ]T h e ph y logen e tic an a lys is o f IT S sequ en ce cou ld p rov ide th e i m por tan t re fe ren ce ba sis for th e gen u s iden tifica tion o f Fu sarium spp .K e y w o rd s Fusariu m spp.;IT S;P h y log en e tic an a lys is
作者简介 陈玉玺(1982-),男,河北石家庄人,硕士研究生,研究方
向:真菌分类学。*通讯作者,E -m a il :zh lp ing @m a il https://www.doczj.com/doc/8f3914181.html, 。
收稿日期 2008-02-26
镰刀菌属(Fu sa rium )是一类重要的真菌,分布范围广,对环境适应力强,变异迅速,其鉴定分类一直为人们所关注。它包括很多农业上的重要植物致病菌,由禾谷镰刀菌(Fu sa r-i um gra m i nearum S chw ab e)引起的赤霉丝疫病(FH B )[1]是1993年以来美国中西部地区大麦的一个主要病害。镰刀菌可产生玉米赤霉烯酮、伏马菌毒素等多种真菌毒素,食用受其污染的农产品对人畜均有较强的毒害作用。此外,近年来随着广谱抗生素和免疫抑制剂的大量使用,尤其是免疫缺陷疾病的流行,人类感染镰刀菌的病例也越来越多。常见的有皮肤感染,镰刀菌角膜炎等[2]。因此,对镰刀菌快速、准确的鉴定变得尤为重要。
传统的镰刀菌鉴定技术主要以形态学特征为基础,但由于该属的种类较多,形态复杂且变异较大,有些种还需结合其宿主关系才能准确鉴定,使得菌种的鉴定具有一定的难度。近年来,探针检测技术[2]、核酸序列分析[3]、RA PD 等分子生物学手段已越来越多地被用于真菌的分类鉴定。分子生物学方法的引入减少了鉴定过程中主观因素的影响,不但鉴定结果更加客观,还使种间同源性和系统发育关系研究成为可能。
笔者通过对分离的10株镰刀菌菌株核糖体RN A 基因内转录间隔区(In tern a l tran scribed spa cer)进行PC R 扩增,经测序分析其核酸序列差异,对菌株间的系统发育关系进行研究。1 材料与方法
1.1 菌株 10株真菌系采自保定地区农田土壤中分离出的菌株,由河北大学河北省微生物多样性研究与应用重点实验室保藏。
1.2 r DNA I TS 系统发育分析
1.2.1 菌体的收集。将活化好的菌株接种到马铃薯液体培养基(去皮马铃薯200g 、葡萄糖20g 、蒸馏水1000m l),28℃、160r/m in 摇床培养至对数生长期,经镜检验纯后,离心收集菌体,然后用无菌去离子水洗涤2次,再用TE 缓冲液洗涤1次,-20℃保存备用。
1.2.2 基因组DN A 的提取。采用氯化苄法[4-5]。10m g 菌丝体加入100μl 提取液(100m m o l/L T r is-H C l ,pH 值9.0,25m m o l/L E DT A ,pH 值8.0),冰上研磨,加入400μl 50℃预热的提取液,振荡混匀。加入100μl 10%SD S,300μl 氯化苄,剧烈振荡,使呈乳状,50℃保温1h 。每隔10m in 振荡混匀1次。300μl 3m ol/L 醋酸钠(pH 值5.2),冰浴15m in 。6000r/m in 、4℃离心15m in ,取上清液。等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻颠倒混匀,9000r/m in 4℃离心10m in 。重复抽提。取上清,加入等体积异丙醇,室温沉淀20m in 。10000r/m in 、4℃离心15m in ,取沉淀。70℃乙醇洗涤2次,自然晾干后溶于100μl TE,置-20℃备用。
1.2.3 PC R 扩增ITS 序列。PCR 扩增IT S(包括IT S 1、5.8S rDN A 、IT S 2),序列采用通用引物[6],正向引物IT S 1为5′-TC -CG T AGG TGAAC C TGCGG -3′,反向引物IT S 4为5′-TC C TCC GC T -T A T TGA TA TGC -3′。
扩增程序为:94℃预变性5m in ,然后取出样品冰浴5m in ,加入T aq DN A 聚合酶后,离心混匀进入循环:94℃变性1m in ,55℃退火1m in ,72℃延伸1m in ,进行35个循环后72℃延伸10m in 。PC R 扩增产物送三博远志公司进行测序。1.2.4 系统发育树的构建。将所测的IT S 序列用B la s t 方式与G enB ank 数据库中所有已测定的真菌IT S 序列进行检索,采用C lus ta l X 1.81软件进行多序列匹配排列[7],系统发育树采用邻接法(N e ig hbor-join ing)构建,应用自展法(B oo ts t rap)检验系统树,重复次数为1000次,进化距离使用K i m u ra 两参数
安徽农业科学,J ou rn a l o f A n hu i A g r i .S c i .2008,36(12):4886-4887 责任编辑 孙红忠 责任校对 马君叶
模型进行计算。2 结果与分析
共测定了10株镰刀菌的IT S 序列。实验菌株与G enB ank
中相关菌株的ITS 序列进行比较,所构建的系统发育进化树见图1。
由图1可知,供试菌株分别位于发育树的
3个分支上。
图1 根据镰刀菌rDNAI T S 序列构建的系统发育树F ig.1 Po ly g e n e t ic tre e ba s e d on F u s a r iumrD NA -IT S
菌株F 84、F 90、F 92、F 93、F 95、F 99、F 100相互之间的序列同源性在97.61%～100%,与系统发育关系最近的腐皮镰刀菌(Fu sa r ium solan i AM 412642)的序列相似性分别为99.80%、98.61%、98.61%、99.21%、100%、100%、99.01%,此腐皮镰刀菌分枝各菌株间变异较大,可能属于不同的生理小种。菌株F 94与尖孢镰刀菌(F u sa rium oxyspo rum )的序列相似性为100%。菌株F 83和F 97之间的相似性为100%,属于同一个种,与同一大分枝上的Fusari um incarnatu m 序列相似性为99.21%。而不同分枝间菌株序列相似性均低于95.76%。3 讨论
镰刀菌IT S 包括两个可变区ITS 1与ITS 2,且变异较快,能提供足够的信息量和可变位点。通过对IT S 序列的系统发育分析,可从遗传上准确地获得该属真菌菌株间的系统发育关系。对构建的系统发育树进行分析可知,7株镰刀菌与腐皮镰刀菌(Fu sa riumsolan i)位于同一发育分枝,1株与尖孢镰刀菌(Fu sa riumoxy sp orum )位于同一分枝,2株与Fu sari um incarnat u m 进化关系最近,要进一步确定其分类地位还需结合形态、生理生化、生态的特征,并进行DN A -DN A 杂交分析。
各分枝内部相似性均较高,为97.61%～100%,而分枝间相似性均较低,表明IT S 序列系统发育分析可为镰刀菌属种的鉴定提供重要的参考依据。参考文献
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(上接第4873页)
来去除糖的原理,只要1h 就可以提取到试验所需要的RN A ,不失为一种简单、有效的方法。TR lzo l 试剂和C o lum n k it 试剂盒用于其他植物材料或木薯的叶子时,可提取到高质量、高产量的总RN A,但用于棉花、葡萄、茶树等富含次生物质的植物材料时难以取得满意的效果[7-8]。根据已发表的序列设计1对引物,采用RT -PCR 技术扩增出木薯淀粉分支酶的基因片段,说明P la n t RN A R ea g en t k it 提取的RN A 质量可以满足试验的基本要求。参考文献
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88436卷12期 陈玉玺等 10株镰刀菌rD N A 内转录间隔区(IT S )序列分析