微生物鉴定中的生理生化试验
一．实验目的
1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。二．实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下：
大分子水解试验 1.微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
2.糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
3．IMViC试验
IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methylredtest）、伏-普（Voges-Prokauertest）和柠檬酸盐（citratetest）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。
吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。
色氨酸水解反应：
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖）转变为红色pH6.3产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（，即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验（pH4.2）在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4 pH升至大约6，因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。如乙醇、丙酮酸等，使三．实验器材 1.菌种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌。 2.培养基和试剂；葡萄糖发酵培养基、（1）培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试乳糖发酵培养基试管（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）验）；葡萄糖蛋白胨水培养基。 2）溶液和试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、中性红试剂等。（ 3.仪器及其它用品酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、试管、烧杯、量筒、德汉氏小管、无菌操作台等。四．操作步骤 1.培养基的配制及灭菌在配置油脂培养基时不能使用变质油，配制培养基（注意：按附录所示配方称量各组分，在配置糖发酵培养基时将上述含指示剂的PH后最后加入中性红；油和琼脂及水先加热，调好）以及糖溶液分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使之充蛋白胨水培养基（PH7.6 。℃灭菌满培养基）。配制分装包扎完成后放入灭菌锅中11320min倒平板，接种及培养2.
）淀粉水解试验（1 ℃下的淀粉培养基倒平板并冷却至室温。①倒平板：无菌条件下将冷却至50②接种及培养：用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。将枯草芽孢（注：杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域点种由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发 37℃条件下培养两天。）生重叠，宜采用点种的方式，如下图1。接种完成贴好标签后在油脂水解试验接种示意图淀粉水解试验接种示意图1图2图）油脂（2水解试验℃下的油脂培养基倒平板并冷却至室温（注：倒平板时，①倒平板：无菌条件下将冷却至50 需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中）；②接种及培养：用记号笔在平板底部划成四部分，并标记各分区所接种的名称。将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在所标定对应的不同的区域划十字线。接种完成贴好标签后在37℃条件下培养两天。所示）接种（如上图2（3）糖酵解试验
①葡萄糖酵解的接种及培养：用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名
（大肠杆菌，普通变形杆菌）。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌，2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。接种完成后在37℃条件下培养两天。
②乳糖酵解的接种及培养：用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名（大肠杆菌，普通变形杆菌）。取盛有乳糖发酵培养基的试管5支，按编号2支接种大肠杆菌，2支接种普通变形杆菌，剩余的1支作为空白对照不接种。接种完成后在37℃条件下培养两天。
（4）IMViC试验
①吲哚实验的接种及培养：用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有蛋白
胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。接种完成后在37℃条件下培养两天。
②甲基红实验的接种及培养：用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。取盛有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管4支，按编号2支接种大肠杆菌，另2支接种产气肠杆菌。接种完成后在37℃条件下培养两天。
3.结果的检验
（1）大分子水解试验的检验
①淀粉水解试验的检验：观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板，观察水解圈，出现水解圈的为阳性，记录试验结果。
②油脂水解试验的检验：取出平板，观察各种细菌产生的菌苔颜色，出现红色菌苔的为阳性，记录试验结果。
（2）糖发酵试验的检验：取出各试管，与空白对照组对照观察培养基的颜色以及倒立的小管中气泡的有无，若培养基变成黄色则说明细菌分解糖类并产酸；若倒立的小管中有气泡存在，则说明细菌分解糖类并产气。产酸产气的为阳性。（3）IMViC试验的检验
①吲哚试验的检验：取出各试管，向培养基中加入3～4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。
②甲基红试验的检验：取出各试管，向培养基的培养物内加甲基红试剂2滴。培养基变黄为阴性，红为阳性。
五．实验结果及分析
1.实验结果（理论实验结果）
A．大分子物质的水解试验
（1）淀粉水解试验（我们的实验也得到了预期的结果）
表1淀粉水解试验结果(“+”表示阳性，“—”表示阴性)
菌种阴/阳性结论
可以水解淀粉大肠杆菌 +
可以水解淀粉枯草芽孢杆菌+
不可以水解淀粉 - 金黄色葡萄球菌不可以水解淀粉-
铜绿假单胞菌
（2）油脂水解试验
发酵试验（“+3表空白普通变形杆菌大肠杆菌样品
紫色黄色颜色变化黄色是是是否产气否-
+
阳性阴/ +
普通变形杆菌能分大肠杆菌可以分解葡萄糖，同时产解葡萄糖，同时产酸结论对照组
酸产气。产气。乳糖发酵试验（2）乳糖发酵试验（表4“+”表示阳性，“—”表示阴性）普通变形杆菌样品大肠杆菌空白
紫色颜色变化紫色紫色否否是否产气否-
/阴阳性-
-
普通变形杆菌不能大肠杆菌不能分解乳糖，故不产酸结论对照组分解乳糖，故不产酸
不气。产气。 C.IMViC试验（1吲哚试验）
吲哚试验（表5”表示阳性，+“—”表示阴性）“大肠杆菌样品产气肠杆菌是否产生红色环状物否是-
阴阳性/+
产气肠杆菌不能分解色氨酸为吲哚结论大肠杆菌可以分解色氨酸为吲哚甲基红试验 2（）”表示阳性，+“甲基红试验（6表“—”表示阴性）产气肠
2.实验结果分析
理想上的试验结果如上述表格所示，但是我们组的实验只有淀粉水解试验是成功的，其他的是失败的。
其中由淀粉水解试验可以得出枯草芽孢杆菌和大肠杆菌能产生淀粉酶的结论，枯草芽孢杆菌菌落周围的透明圈较大肠杆菌周围的透明圈大，可以大体判断前者较后者代谢利用淀粉的能力强。通过油脂水解试验，理想上的结果是铜绿假单胞菌能产生脂肪酶分解脂肪从而出现红色斑点状菌苔，但可能是培养基的原因，我们的实验失败了。
通过糖酵解实验，理想结果应为大肠杆菌和普通变形菌都能够分解葡萄糖，但是普通变形菌不能够分解乳糖。但实验结果却是普通变形菌不能分解乳糖，与事实相违背，实验失败。究其原因可能是菌种在接种时出现失误而接种失败或是菌种本身存在有问题，还有可能是接种量太少，培养时间不够等原因。
在吲哚试验中，理想结果是大肠杆菌具有分解色氨酸产生吲哚的能力，而产气肠杆菌不能分解色氨酸为吲哚。在甲基红实验中，理论上是大肠杆菌在培养期仍维持酸性pH，产气肠杆菌转化有机酸为非酸性末端产物，我们的实验也失败了，试验失败有可能是因为培养基配错或菌种的原因。
六．注意事项
1.淀粉水解试验中，观察各种细菌生长情况时，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，
应轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
2.油脂水解试验中，制备固体油脂培养基时，应充分摇荡，使油脂均匀分布。
3.接种前要用记号笔做好标记，接种时要对号接种。
4.糖发酵试验中，接种后要轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。否则会造成假象，得出错误的结果。
5.吲哚试验中，注意加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，再沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。否则就会观察不到在乙醚和培养物之间产生的红色环状物。
6.甲基红试验中，应该注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性。七．思考题
1.你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解，应该是细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。
2.不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。
3.假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
答：由于产生的CO溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。德汉氏小2管中有气柱。．
4.讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。
5.解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。
附录实验中用到的各种培养基配方
1．固体淀粉培养基
蛋白胨10g
NaCl5g
牛肉膏5g
可溶性淀粉2g
蒸馏水1000mL
琼脂15~20g
121℃灭菌20min。
2．固体油脂培养基
蛋白胨10g
牛肉膏5g
NaCl5g
香油或花生油10g
1.6%中性红水溶液1mL
琼脂15~20g
蒸馏水1000mL
pH7.2
121℃灭菌20min。
注：（1）不能使用变质油。
（2）油和琼脂及水先加热。
（3）调好pH后再加入中性红。
（4）分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。
3.葡萄糖发酵培养
蛋白胨水培养基 1000mL
NaCl5g
12.5g
葡萄糖1~2mL 溴甲酚紫乙醇溶液1.6%1000mL 蒸馏水pH7.6
。110℃灭菌30min 4.乳糖发酵培养基1000mL 蛋白胨水培养基
NaCl5g
乳糖12.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1~2mL
蒸馏水1000mL
pH7.6
110℃灭菌30min。
5．蛋白胨水培养基
蛋白胨10g
NaCl5g
蒸馏水1000mL
pH7.6
121℃灭菌20min。
6.葡萄糖蛋白胨水培养基
蛋白胨5g
葡萄糖5g
KHPO2g 42蒸馏水1000mL
将上述各成分溶于1000mL水中，调pH7.0~7.2，过滤。分装试管，每管10mL，112℃灭菌。30min
微生物的生理生化反应 日期：2016年5月12日指导老师：张霞 实验原理 微生物对大分子的淀粉，蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解发电物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。 一、大分子物质的水解实验 明胶由胶原蛋白经水解产生的蛋白质在25℃以上溶化，一下为凝胶。有些微生物可产生明胶酶水解该蛋白，明胶液化 二、糖发酵实验 绝大多数细菌都能利用糖类为碳源和能源，但是他们在分解糖类的能力上有很大差异。当发酵产生酸时，溴甲酚紫指示剂可以由紫色变为黄色。气体的产生可由倒置的德汉氏小管有无气泡来验证 三、IMVIC实验 吲哚实验 蛋白质中的色氨酸在某些细菌中与吲哚和对二甲基苯甲醛反应产生玫瑰吲哚为红色 甲基红实验 当细菌分解葡萄糖产酸且产酸量大时，加入甲基红指示剂由黄变红 伏普-实验 柠檬酸实验 某些细菌可以利用柠檬酸盐作为唯一碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐
实验器材 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，产期肠杆菌，待测菌株 淀粉培养基A，明胶培养基B，葡萄糖发酵培养基C，乳糖发酵培养基D，葡萄糖蛋白胨培养基E，蛋白胨培养基F，柠檬酸培养基G 酒精灯，接种环，接种针，试管架 卢戈氏碘液，甲基红，吲哚试剂，5%甲萘酚，40%氢氧化钾 实验步骤 1、在A中接种大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，待测菌株 2、在B中接种大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，待测菌株 3、在C，D中分别接种大肠杆菌，变形杆菌，待测菌株 4、在E中接种大肠杆菌，产期肠杆菌，待测菌种 5、在F，G中接种大肠杆菌，产气肠杆菌，待测菌株 培养 G培养一周，其他培养2-3天 观察 A中滴加1-2滴卢戈氏碘液，黑色深浅表示菌株利用淀粉能力的强弱 B在4℃下放置30min，取出后滴加甲基红1-2滴静置，观察明胶液化情况
微生物生理生化反应
实验原理 通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 实验材料和方法： 材料： 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基； 菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）； 试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素； 仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。 实验方法： 1.V-P反应 取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。若培养液呈红色，记录为V-P试验阳性反应；无色者为V-P试验阴性反应；粉红色者为弱阳性。 2.甲基红试验 分别从V-P实验中的培养物中取出2.5mL培养液，分别加入2～3滴甲基红指示剂，立即观察培养液颜色变化。若培养液变成红色，即为阳性反应，橘色或黄色为阴性反应，橘红色为弱阳性。 3.吲哚试验 取5只装有蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。在通风橱中向培养基中加入乙醚1～2mL，振荡使吲哚尽量被完全萃取至乙醚中，沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂，加入后不能摇动。若乙醚层呈现玫瑰红色，即为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 4.糖发酵试验 取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管个4支，内装有倒置杜氏小管，杜氏小管内
微生物鉴定中常用的生理生化试验 09级生科3班李雪彤（200900140061） 同组者：刘雯雯、娄峰、潘红芳、朴薇 一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC的原理。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种四种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。 （2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 三、实验材料 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn）， 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。 2.培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品 平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。 四、实验步骤
一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC的原理。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 三、实验材料 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn）， 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。 2.培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品 平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。 四、实验步骤 1.淀粉水解实验 （1）培养基制备 将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
实验六微生物的生理生化反应 一、实验目的 掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体个原理如下： 1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。 3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。 ①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。 ②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 ③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。 ④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基中含有胍基的化合物起作用生成红色化合物，即为VP试验阳性。 三、材料和器皿 ⑴ 菌种：1号—枯草杆菌，5号—大肠杆菌，7号—产气杆菌； ⑵培养基：淀粉培养基平板（1个），明胶培养基（2个），葡萄糖培养基（2个），葡萄糖蛋白胨水培基（4个），柠檬酸盐培养基斜面（2个）； ⑶试剂：卢氏碘液，溴甲酚紫指示剂，甲基红指示剂，溴麝香草酚兰指示剂，氢氧化钾，α—萘酚。 四、实验步骤
微生物鉴定的生理生化反应 各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。 一、碳水化合物的代谢试验 1．糖（醇、苷）类发酵试验 （1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。 (2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。 (3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。 (4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。 表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类 单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖 双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖） 多糖菊糖（多分子果糖）淀粉 醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇 非糖类肌醇 2．葡萄糖代谢类型鉴别试验 (1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。 (2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。。 (3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
常用生化试验 一．糖、醇发酵试验 1.糖、醇发酵试验原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气，有的仅产酸，而不产气。根据这些特点，可鉴别细菌。 培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。可根据试验的要求和细菌的特性来选择。 2.乙酰甲基甲醇试验（V-P 试验） 原理：某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的 a -萘酚为催化剂，可加速此反应，使反应颜色增加， 提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V-P 试验呈阴性。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 3.甲基红试验（MR 试验）原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH 降至 4.5 以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在PH6.2 以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 MUG 葡萄糖醛酸苷酶试验 原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4-甲基伞形酮-3 -D葡萄糖醛酸甘 （4-Methylumbelliferyl- 3 -D-glucuronide简称MUG ）的3葡萄糖醛酸甘键，使其水解，释 放的4-甲基伞形酮在366nm 紫外灯下产生蓝白色荧光。 培养基：MUG 培养基 4.3-半乳糖苷酶试验 原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和3-半乳糖苷酶两种不同的酶作用， 能水解邻硝酸酚-3-D 半乳糖苷（O-nitrophenyl- 3-D-galactopyranoside,ONPG ），而释放出黄色 的邻硝酸酚。发酵乳糖的细菌具有上述两种酶，可迅速分解乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌只有 3■半乳糖苷酶，而缺少半乳糖苷渗透酶或是其活性很弱，不能将乳糖很快运送到菌细胞内，
山东大学实验报告2017年12月4日 ___________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康 一、目的要求 1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的 酶系统。 2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、基本原理 1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。 （1）吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。 （2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 （3）伏-普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉
【实验题目】 微生物生理生化实验 【实验目的】 1.了解生理生化的意义。 2.掌握几种常用生理生化的实验方法。 【实验器材】 1、菌种： 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，变形杆菌，产气肠杆菌 2、试剂： 卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等 3、仪器和用具： 酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等 4、培养基 淀粉培养基、油脂培养基（大分子物质水解实验） 葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内附倒置的德汉氏小管）（糖发酵实验） 蛋白胨水培养基（吲哚实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红培养基） 【实验原理】 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以促进细胞外的化学反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。具体实验原理如下： 一、大分子物质的水解实验原理 1、淀粉水解 由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，所以必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶将淀粉水解为小分子的糊精,双糖和单糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉。已知淀粉遇到碘会显现蓝色，因此可通过在淀粉培养
基上滴加碘液来判断微生物是否能产生淀粉酶分解淀粉，菌落周围不呈蓝色，出现无色透明圈，则该菌种能够水解淀粉。 2、油脂水解 脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸，而产生的脂肪酸可改变培养基的PH,因此在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后可通过观察菌苔的颜色判断菌种是否能够水解油脂，若出现红色斑点，则说明这种菌可产生分解油脂的酶。 二、糖发酵实验原理 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细 菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 图1：糖发酵实验 三、IMViC 实验 1、吲哚实验 用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的 色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。 2、甲基红实验 某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸、乙酸和乳酸 等多种有机酸，使培养基的PH 值降低，加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转变为红色， A 培养前的情况 B 培养后 产酸不产气 C 培养后 产酸产气
微生物的生理生化反应 姓名：王雪学号：201500140130 班级：2015级四班2组同组者：张彬、田文娅 一、实验目的 1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不通过的酶系统。 2、掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3、了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 4、了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、实验原理 微生物的生理生化反应原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。 大分子水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的PH，使PH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。 糖发酵试验：是常用的鉴别微生物的生化反应。某些细菌能利用糖类作为碳源和能源，使糖类分解为产酸产气或产酸不产气。不同种的细菌对于各种糖类利用能力不同，分解产物也不同。大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；普通变形杆菌只能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（PH6.8）转变为黄色（PH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 吲哚实验：用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基氨基甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都
细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示： (一) 糖、醇发酵试验 原理： 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。 培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制： (NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。 测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意：以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果： 用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。 结果记录： 产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。 (二) 淀粉水解试验 原理： 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基配制： 牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法： 以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养
微生物鉴定中的生理 生化试验
微生物鉴定中的生理生化试验 一．实验目的 1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不 同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二．实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.大分子水解试验 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。 2. 糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3．IMViC试验
姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白 胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测 1 / 8
微生物鉴定中的生理生化试验 一．实验目的 1.证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不 同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 4.了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二．实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.大分子水解试验 微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输至细胞。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。如淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘液测定时，不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。 2. 糖发酵试验 糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能
分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、加完、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气。例如，大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌能分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3．IMViC试验 IMViC是吲哚（indol）、甲基红（methyl red test）、伏-普（Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水细菌学检查。硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。 吲哚试验是用于检测吲哚的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（红色）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 色氨酸水解反应： 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛反应：
山东大学实验报告2015年 12 月 7日 姓名黄新迪系年级2014级生科3班组别5 同组者高岩、国文洁、梁萧 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌 培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4. 糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测 的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。 （2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色转 变为红色，即甲基红反应。大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。 四、【实验步骤】