第二军医大学硕士学位论文
ＡＹ９２７５４７ｗｅｒｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｎｄｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｓｉＲＮＡｍｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＡＹ９２７５４７Ｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆ
ｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，晰ｍＲＮＡ－ｐｕｌｌｄｏｗｎａｎｄＲＮＡｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
Ｍ２ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＡＹ９２７５４７ｃｏｕｌｄｃｏｍｂｉｎｅ谢ｔｌｌＰＫＭ２ａｎａｌｙｓｉｓ，ｐｙｒｕｖａｔｅｋｉｎａｓｅ
ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｔｓａｃｔｉｖｉｔｙ．
ＯｕｒｒｅｓｕｌｔｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔＩｎｃＲＮＡＡＹ９２７５４７ｗｅｒｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｙｃｒｕｃｉａｌｒｏｌｅｉｎｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＩｔｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｔｏｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＨＢＶ－ＨＣＣｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｎｅｔｗｏｒｋ．ＴｈｉｓａｌｌｏｗｉｎｇＵＳｔｏｂｅｔｔｅｒｃｌａｒｉｆｙｔｈｅｏｃｃｕｒａｎｃｅｏｆＨＣＣ，ＳＯａｓｔｏｇｅｔｅａｒｌｙｆｉｎｄｉｎｇ，ｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｅ，ａｎｄｅａｒｌｙｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＨＣＣ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｒｏｌｅｏｆｌｎｃＲＮＡ—ＡＫ９２７５４７ｉｎｈｅｐａｔｏｍａｇｒｏｗｔｈａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
ａｎｄｔａｒｇｅｔｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔＨＣＣ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｓＵＳｎｅｗｉｄｅａｓ
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ｔｈｅｒａｐｉｅｓｏｆｓｙｎｔｈｅｔｉｃｌｎｃＲＮＡｓ．
ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｌｏｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ＰＫＭ２
．４－
ＤＮＡ甲基化相关的ｌｎｃＲＮｋｓ在原发性肝癌发生过程中的功能及机制研究
２）肝脏原位种植瘤模型：将皮下荷瘤模型小鼠的肿瘤取出后，实验组与对照组分别切取约为２２ｌｍｍ３肿瘤小块，保存于添加了抗生素的生理盐水中备用。另取１０只４周龄雄性ＢＡＬＢ／ｅ免疫缺陷鼠，随机分为两组（５只／组）。将小鼠以戊巴比妥纳腹腔注射麻醉，固定于动物手术台（已消毒、铺巾），各皮消毒，取上腹部正中切口打开腹腔，暴露肝脏，将肝脏划一小口（以出血为标记），将已备好的肿瘤小块塞入切开的小口中，加压止血片刻，于腹腔滴加抗生素防止感染。关腹，依次缝合腹膜、皮肤，并消毒。术后裸鼠继续生长８周，随时观察腹部肿瘤生长情况。４８周后处死裸鼠并解剖，观察腹腔脏器和远处器官的肿瘤转移情况，统计转移灶数量及发生转移的小鼠数量，取肝脏组织（包括肿瘤组织和瘤旁正常组织）及疑似转移的脏器组织进行相关病理分析。
１１．ＲＮＡｐｕｌｌ．ｄｏｗｎ
１）表达载体的构建：
首先将ｌｎｃＲＮＡ．ＡＹ９２７５４７全长的ｃＤＮＡ序列构建到质粒载体ｐＳＰＴｌ８载体上，即ｐＳＰＴｌ８．ＡＹ９２７５４７。ｅＤＮＡ序列两端分别为ＥｅｏＲＩ和ＨｉｎｄｌＩＩ的限制性酶切位点。｝一２）ＲＮＡ生物素标记：
使用德国Ｒｏｃｈｅ公司的ＢｉｏｔｉｎＲＮＡＬａｂｅｌｉｎｇＭｉ）【试剂盒及ＳＰ６、Ｔ７ＲＮＡ聚合酶体外转录生物素标记的ＩｎｃＲＮＡ。
３）单链ＩｎｃＲＮＡ．ＡＹ９２７５４７模板的制备：
ＩｎｃＲＮＡ．ＡＹ９２７５４７正链模板：ＥｃｏＲＩ单酶切，ｐＳＰＴｌ８．ＡＹ９２７５４７质粒，３小时。
阴性对照链模板：ＨｉｎｄＩＩＩ单酶切，ｐＳＰＴｌ８－ＡＹ９２７５４７质粒，３小时。，
产物回收：使用ＱＩＡＧＥＮ公司的ＱＩＡｑｕｉｅｋＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＲｅｍｏｖａｌＫｉｔ试剂盒分别回
收正反义链单酶切后的ＤＮＡ模板。依照说明书操作，过程中注意ＲＮａｓｅ．ｆｒｅｅ操作。Ｎａｎｏｄｒｏｐ检测单链ＤＮＡ浓度与质量。
４）ｌ斟Ａ聚合反应：
ＩｎｃＲＮＡ．ＡＹ９２７５４７反应体系如下：３７℃，反应２小时。
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ２ｍ
ＢｉｏｔｉｎＲＮＡｌａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ２“ｌ
ＲＮＡ酶抑制剂ｌ“ｌ
单链ｐＳＰＴｌ８．ＡＹ９２７５４７模板１烬
ＳＰ６ＲＮＡ聚合酶１Ｉｌｌ
、，０ｌ２０ｐｌ
‘阴性对照反应体系如下：３７℃，反应２小时。
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ２山
－ｌ５－