辽宁省科学技术奖励申报书
（适用于自然科学奖、技术发明奖、科技进步奖）
一、项目基本情况
奖种：科技进步奖学科（专业）评审组代码：2093 序号：编号：
1
二、项目简介
三、项目详细内容
四、本项目曾获科技奖励情况
五、获得授权专利情况表
六、主要完成人情况表
10
七、主要完成单位情况表
八、推荐、评审意见
九、详细科学技术内容
（不超过15页）
（一）中医理法方药分析
缓慢性心律失常是以心率减慢为特征的一类心律失常，主要包括窦性心动过缓、病态窦房结综合征、窦房传导阻滞、房内传导阻滞、束支传导阻滞、室上性和室性逸搏等疾病。缓慢性心律失常辨证论治常属于中医学心悸、胸痹、昏厥、怔忡、眩晕等范畴。以眩晕、心悸、气短、胸闷甚至昏厥等症状为主，其脉证均以迟缓为特征，属于缓脉、迟脉、结脉等范畴。中国古代医家大多认为此类病证是由气虚血寒、阳虚阴盛、脏腑虚损所致，治疗常采用温补之法。查阅文献，现代医家一般参照“厥脱”“心悸怔忡”胸痹”“虚损”等病证门类的临床治疗思路进行辨证论治。认为其常见病因为外邪(如风、寒、暑、湿、燥、火或厉气等)侵袭，七情内伤（长期的情志抑郁或情志不舒），饮食失节，嗜好烟酒等辛辣之品等。本研究据古引今，认为心肾阳虚为缓慢性心律失常发病之本，血脉瘀阻为缓慢性心律失常发病之标，心肾阳虚、血脉瘀阻是缓慢性心律失常的基本病理变化。心肾阳虚可导致血脉瘀阻的病理改变的出现，血脉瘀阻会进一步加重心肾阳虚，二者互为因果，相互影响。只有将心肾阳虚和血脉瘀阻有机结合起来，才能正确反应缓慢性心律失常发生的病理变化，才能抓住治疗关键。
针对缓慢性心律失常心肾阳虚、血脉瘀阻的基本病机，建立温补心肾、活血祛瘀大法，中药复方由药物红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛、丹参、水蛭组成。
红参：味甘、微苦，温。归脾、肺、心经。《神农本草经》曰：“主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸。”《药性论》谓之：“主五脏气不足，五劳七伤，虚损痞弱，……补五脏六腑，保中守神。”《主治秘要》“补元气，止渴，生津液”。《本草经疏》云：“人参能回阳气垂绝，却虚邪于俄顷……益真气，则五脏皆补矣。”《遵生八笺》则云：“润肺生津，生气生脉。”《本草从新》“大补元气，生阴血，亦泄虚火。”《医学起源》云：“治脾肺阳气不足……补中缓中。”《得宜本草》：“能通行十二经。”《本草要略》言其“通经活血”。红
参有大补元气，复脉固脱，益气摄血。用于体虚欲脱，肢冷脉微，气不摄血，崩漏下血；心力衰竭，心源性休克。
淫羊藿：味辛、甘，温。归肝、肾经。《本草纲目》：“淫羊藿，性温不寒，能益精气，真阳不足者宜之。”《日华子本草》：“治一切冷风劳气，补腰膝，强心力，丈夫绝阳不起，女子绝阴无子，筋骨挛急，四肢不任，老人昏耄，中年健忘。”主治功能：补肾阳，强筋骨，祛风湿。
补骨脂：味辛、苦，性温。归肾、心包、脾、胃、肺经。《本草纲目》：治肾泄，通命门，暖丹田，敛精神。《本草经疏》：补骨脂，能暖水脏；阴中生阳，壮火益土之要药也。其主五劳七伤。主治功能：补肾助阳；纳气平喘；温脾止泻。主肾阳不足；下元虚冷；腰膝冷痛；阳痿遗精；尿频；遗尿；肾不纳气；虚喘不止；脾肾两虚；大便久泻。
枸杞子：味甘，性平。归肾、肝经。《药性论》：“能补益精诸不足，易颜色，变白，明目，安神。”《食疗本草》：“坚筋耐老，除风，补益筋骨，能益人，去虚劳。”王好古：“主心病嗌干，心痛，渴而引饮，肾病消中。”《纲目》：“滋肾，润肺，明目。”主治功能：滋肾，润肺，补肝，明目。治肝肾阴亏，腰膝酸软，头晕，目眩，目昏多泪，虚劳咳嗽，消渴，遗精。
细辛：味辛，性温，小毒。归肺、肾、心经。《本草纲目》：“细辛辛香性温而善走窜，开窍启闭，温通血脉而止痛。”《医林纂要?药性》云“润肾，直达命门之气，以窜达于九窍百骸，潜通咽后。”。《主治秘要》：“止诸阳头痛，诸风通用之。辛热，温阴经，散水寒，治内寒。”《医学启源》：“辛热，温阴经，散水寒，治内寒。”。《药性论》“开胸中滞”。《名医别录》：“温中下气，破痰，利水道，开胸中……安五藏，益肝胆，通精气。”细辛功可散寒祛风，通窍止痛，温肺化饮。
麻黄：味辛、苦，性温，入肺、膀胱经。《本草求原》：“气温入肝，味苦入心”。《日华子本草》：“通九窍，调血脉，开毛孔皮肤，逐风，破癥瘕积聚，逐五脏邪气。”《汤液本草》云：“气温，味苦甘而苦。气味俱薄，阳也，升也。甘热纯阳。手太阴之剂。入足太阳经，走手少阴经、阳明经药。”。麻黄功能发汗解表，宣肺平喘，利水消肿。
丹参：味苦，性微寒。归心、心包、肝经。《本草纲目》：“破宿血，补新血，调经脉”。《神农本草经》：“破癥除瘕，止烦满，益气”。《妇人明理论》“一味丹参散，功同四物汤”。《本草正义》“丹参专入血分，功在活血行血，达脏腑而化瘀滞”。《景岳全书》“能养血活血，生新血，行宿血，亦能养阴定志”。丹参功能活血通经、祛瘀止痛、养血安神。
水蛭：味咸苦，性平，有毒。入肝、膀胱经。《本经》：主逐恶血、瘀血、月闭，破血瘕积聚，无子利水道。《汤液本草》：水蛭，苦走血，咸胜血，仲景抵当汤用虻虫、水蛭，咸苦以泄畜血，故《经》云有故无殒也。《本草经疏》：水蛭，味咸苦气平，有大毒，其用与虻虫相似，故仲景方中往往与之并施。咸入血走血，苦泄结，咸苦并行，故治妇人恶血、瘀血、月闭、血瘕积聚，因而无子者。血畜膀胱，则水道不通，血散而膀胱得气化之职，水道不求其利而自利矣。堕胎者，以具有毒善破血也。功能主治：破血，逐瘀，通经。治蓄血，症瘕，积聚，妇女经闭，干血成痨，跌扑损伤，目亦痛，云翳。
组方配伍特点：（1）温阳活血同施。《素问·通评虚实论》“邪气盛则实，精气夺则虚”，“实则泻之，虚则补之”。方中以红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛温补心肾，以水蛭、丹参活血祛瘀。诸药合用，通补兼施，活血而不伤正，温阳而不凝滞，二法并用，相辅相成。（2）标本兼顾。《黄帝内经》：“间者并行，甚者独行”，“治病必求于本”。缓慢性心律失常为起搏传导系统退行性改变所致疾病，病情复杂，虚实夹杂，病情变化多端。但其核心病机仍以心肾阳虚为本，血脉瘀阻为标。治疗当标本兼顾，以治本为主，兼以治标。温阳益气与活血化瘀同用。
(二)、项目主要研究内容
第一部分动物实验
1 实验材料
1.1 实验动物
SPF级SD雄性大鼠48只（鼠龄9m、24m各24只），体重200～350g，许可证号：SLXK京2009-0004，北京华阜康生物科技股份有限公司提供。
1.2 实验药品
麻黄碱（南京泽朗医药科技公司，98.0%），β-细辛醚（Sigma，批号03124JRV，
70%），去甲乌药碱（南京泽朗医药科技公司，98.0%），胶原酶V（Sigma，美国）参仙升脉口服液：红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛、丹参、水蛭。厂家：山东步长制药有限公司，批号：国药准字Z20080183
1.3 主要试剂
10%水合氯醛：取10g水合氯醛溶于ddH2O，定容至100ml，室温保存。
0.1MPBS（DEPC水）：取30.8gNa2HPO4，2.8gNaH2PO4和8.5gNaCl溶于ddH2O，定容至1000ml，加1mlDEPC，搅拌混匀后过夜，次日高压消毒30min，室温保存。
4%多聚甲醛（DEPC-PBS）：取8g多聚甲醛溶于0.1MPBS（DEPC水），定容至200ml，现用现配。
兔抗大鼠Cx45一抗及SP、DAB显色试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供。
cAMP/cGMP、Na+-K+-ATP酶试剂盒：南京建成生物工程研究所提供
1.4 主要仪器及设备
数码显微镜，OLYMPUS BX41型。日本OLYMPUS公司生产。
生物显微镜，CHA型，日本OLYMPUS公司生产。
体温计本校实验动物中心提供
安图斯anthos2010型酶标仪奥地利产品
电热恒温培养箱，HH·B11·500型，上海跃进医疗器械厂生产。
微量移液器，美国热电公司生产。
全自动真空组织脱水机爱华TSJ-1天津航空机电公司
生物组织包埋机 BMJ-1 LEICARM 2135 德国原装
光学显微镜 OLYMPUSBHS CH-2 日本产品
美国百胜 Havmorlic Au-5
全自动五分类多物种血液分析仪 HEMAVET950 美国产品
脱水机，LEICA 300型，德国徕卡公司生产。
石蜡包埋机，EG1150型，德国徕卡公司生产。
切片机，LEICA RM2235型，德国徕卡公司生产。
心电图电脑软件PCLAB生物信号采集处理系统北京微信斯达科技发展有限责任公司
eppendorf微量称液器
离心机LDJ4-0.8 北京医用离心机厂
r自动计数仪 Packard公司生产5302型
激光扫描共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，日本OLYMPUS）
P-97 Flaming/Brown Micropipetter Puller（美国Sutter instrument company）MultiClamp700B（美国Axon）
pClamp9数据分析软件（美国Axon）
抛光器（MF-9，Narishige）
CF7D2型离心机（Hitachi Himac）。
心功能检测仪器：利用超声PHILIPS 7500，探头为高频经食管超声10MHz。
2 实验方法
2.1 实验动物的饲养
2.1.1 分组
SPF级SD雄性大鼠36只，体重200~250 g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SLXK京2009-0004?36只大鼠随机分为空白对照组?模型组和治疗组(参仙升脉口服液)，每组12只，单笼饲养?
2.1.2 饲养
SPF级SD雄性大鼠36只，体重200~250 g?每日8时给予模型组大鼠和治疗组大鼠普萘洛尔15 mg·kg-1·d-1，给予空白对照组大鼠淀粉片15 mg·kg-1·d-1?每日14时给予治疗组大鼠参仙升脉口服液0.2 ml/只灌胃，模型组及空白对照组大鼠给予生理盐水0.2 ml/只灌胃，连续7 d?第8天早晨测定各组大鼠心率后，乌拉坦麻醉取材并检测指标?
2.1.3心脏超声检测：采集心脏的二维、M型超声心动图像和脉冲多普勒检测血流频谱，测量评价心脏结构和功能的各项参数。每一测量点记录5个心动周期;由获得M型心动图测量心率(HR)，左室舒末期内径，左室收缩末内径，左室短轴缩短率(FS%)和射血分数(EF%)。利用经食管超声探头我们对2只大鼠图象不满意，其余大鼠均可获得反映心脏结构和功能的二维、M型超声心动图及反映心脏血流动力学的血流频谱。
2.2 实验步骤：严格按照试剂盒说明书进行
2.2.1 石蜡切片制备
2.2.2 HE染色
2.2.3 免疫组化步骤
2.2.4 Cx45灰度值测定
将切片染色后，选取染色良好区域，应用Leica Q550CW图象采集和分析系统，将每张切片在显微镜下(400倍)选取5个互不重叠视野，测定单位面积阳性细胞表达的灰度平均值作为其表达情况，取均值为一只大鼠该蛋白的表达结果。此系统将白色灰度值设定为255，将黑色灰度值设定为0，故灰度值越高，表达越弱。
2.2.5 心肌细胞离子电流变化测定
2.2.5.1急性心室肌细胞单离：
动物麻醉后迅速开胸取出心脏，置于4C预冷0.9%L氯化钠注射液中冲洗，剪开心包，经主动脉插管悬挂与改良的Langendorff灌流装置上，依次用正常台氏液（含(mM) 143 NaCl， 5.4 KCl， 0.30 NaH2PO4， 5 HEPES， 5.5 glucose，0.5 MgCl2， and 1.8 CaCl2 (NaOH 调pH 7.4)、低钙台氏液（Ca2+浓度为20-70 mol/L）经主动脉根部逆行灌流，当心脏跳动完全停止时，改用含胶原酶V （0.3mg/ml）的台氏液消化20-30min，再以Kraftbrune（KB）液（mM： KOH 70，Glutamic acid 50，KCl 40，KH2PO4 20，Taurine 20，MgCl2 3，Glucose 10，HEPES 10， CaEGTA 0.5， HCl调pH 7.4）灌流，除去胶原酶后，将心室取下在KB中缓慢吹打孵化，过滤离心后，将心室肌细胞置于KB液中稳定冷藏保存4-8h 内使用。整个灌流系统温度保持在37C，所有液体均用95% O2+5% CO2饱和。2.2.5.2荧光探针标记：
将急性单离心室肌细胞接种于经0.01%多聚赖氨酸包被的激光共聚焦测钙专用NEST细胞培养皿上静止30min。待细胞完全贴壁后移去培养皿内液体，将198 μL正常台氏液和2 μL Ca2+荧光探针染料Fluo-3/AM（终浓度为5μmol/L）混匀后加入培养皿小室中，37 ℃孵箱避光孵育45 min，使Fluo-3/AM与Ca2+充分结合。测定前用正常台氏液清洗3次，加入200 μL含钙或无钙台氏液待测。将培养皿置于激光扫描共聚焦显微镜（FV1000S-SIM/IX81，日本OLYMPUS）载物台上，在光镜下找到形态完整、横纹清晰的细胞，对其进行扫描（频率为0.2 Hz）。
2.2.5.3膜片钳全细胞记录技术：
根据Hamill等方法进行全细胞膜片钳记录实验。吸几滴细胞悬液加入细胞