紫杉醇的性质及色谱分析方法
摘要
紫杉醇是从紫杉(Taxus brevifolia)树皮中所提得，是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。已成为目前全球销售量排名第一的抗肿瘤药物。综述紫杉醇的发现历史、来源、性质及色谱分析方法。
Abstract
Paclitaxel is extracted from Taxus brevifolia bark,whichnot only is one of the plants of the genus Taxus chinensis complex secondary metabolites, also is the only kind of antitumor drugs that can promote microtubule polymerization and stable microtubule polymerization till now. It has become the top sales in the worldwide . Review of Paclitaxel history, origin, nature and chromatographic methods.
关键词：发现历史；来源；性质；紫杉醇；色谱
Keyword：Discovery history; Source; Properties; Paclitaxel; The chromatographic
1.紫杉醇简介：
1.1发现历史
1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。
1.2来源
由于野生红豆杉资源有限且紫杉醇含量极低，限制了紫杉醇制药业的发展，全世界紫杉醇的需求量约为4000公斤/年，而总产量只有到300-400公斤/年。所以，从天然的红豆杉中提取紫杉醇的方法远远不能满足人们对紫杉醇日益增长的需要。因此，采用各种手段积极寻求紫杉醇新药源生产途径，扩大紫杉醇原料供应能力，已成为紫杉醇产业发展的重点研究方向之一, 目前已取得了一定的进展, 其途径可归结为以下几种：
1.2.2天然红豆杉植物提取
紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种树皮和叶片中中提取。但由
于红豆杉数量极少,自身繁殖率低，生长缓慢，且紫杉醇的含量又极低。在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物中提取必将给红豆杉属植物的在自然界中的生存带来极大的威胁。但由于从红豆杉中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化。因此,人们可利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题。规模化、集约化营造红豆杉人工原料林, 是目前解决紫杉醇原料短缺的最现实、最快捷解决紫杉醇原料紧缺的方法。近年来，我国红豆杉人工种植发展迅速，云南农科院高山经济植物所繁育了5万株，成活率达94.3%，湖南绥宁县林业局繁殖幼苗3000多株,现已移栽大田，黑龙江中医药大学人工育苗也获成功。人工植物栽培的成功,为紫杉醇的获取开辟了广阔的前景[1]。据不完全统计, 我国现有红豆杉种植企业140多家, 现已在云南、福建、湖南、四川、黑龙江等地拥有一定规模的红豆杉种植基地, 种植面积近15万亩。红豆杉人工种植对保护野生资源和满足紫杉醇制药工业的发展发挥了积极的作用。
1.2.3化学合成
1.2.3.1 紫杉醇的全合成
1994年初,Holto和Nicolaou几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得成功[2-3]。此后紫杉醇全合成又在不同的研究小组获得成功[4-5]，但由于紫杉醇是分子结构复杂的化合物,全合成途径都包括25-40步化学反应,合成路线极其复杂,反应条件极难控制，所用化学试剂昂贵且收率低, 产品成本极高、效率低，目前尚未进入产业化。
1.2.3.2 紫杉醇的半合成
半合成法指的是将红豆杉属植物中所含的紫杉醇类似物经过某些化学反应,将其转化为紫杉醇。目前紫杉醇半合成法是为从天然红豆杉针叶中提取分离10-去乙酰基巴卡亭III(10-deacetylbaccatin III)或巴卡亭III (baccatin III)原料, 通过选择性保护7位羟基, 然后再酰化10位羟基，得到7位保护的巴卡亭III, 然后与侧链缩合,最后去掉保护基团得到紫杉醇。由于10-去乙酰基巴卡
亭III和巴卡亭III在红豆杉属植物枝叶中含量较高，而且红豆杉枝叶量大,再生能力强，为紫杉醇半合成提供了丰富的原料。现在紫杉醇的半合成方法已比较成熟，国外紫杉醇生产的主要企业如美国Bristol-Myers Squibb Co.，现已利用半合成法进行工业化生产紫杉醇。目前,半合成紫杉醇被认为是除人工种植外,扩大紫杉醇来源的有效途径。半合成法可以更大限度地利用植物资源, 但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别,需要消耗大量红豆杉树木，仍然不能从根本上解决植物资源的匮乏问题。
1.2.4 植物组织细胞培养
利用植物细胞培养法生产紫杉醇，是各种研究方向中十分有吸引力的一个方向，细胞培养能够连续均匀生产，受外界条件影响不大，而且可以在反应器中大规模培养，易于提高产量和进行产物的提取纯化。美国农业部于1991年就批准了Christen和 Gibson 等用细胞培养法生产紫杉醇及其类似物的专利[6-7]。1994年ESCAgenetics(CA, USA)也宣布用细胞培养的方法生产紫杉醇，用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮的2-5倍[8]，但这个工作的细节没有报道。中国的甘烦远等发现云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达到12 g/L，紫杉醇含量为0.119%，约为成年树树皮中含量的12倍，为栽培植株的40倍[9]，但未见实际应用的报道，短期内成功应用的可能性较小。目前，虽然红豆杉细胞培养生产紫杉醇取得了很大的进展，紫杉醇生物合成途径基本清楚，细胞的生长和紫杉醇的产量已基本得到解决，有的已经得到生物反应器放大阶段，如美国一公司现在已经完成4000 L的培养技术，正在进行20000 L规模的工业放大研究[10]，但植物细胞遗传与生理的不稳定性、细胞间的不一致性使得在培养工程中高产细胞系不能实现高产率，而且易发生遗传变异产生其它代谢产物。另外，植物细胞培养技术较复杂，对反应器要求较高，也阻碍了通过细胞培养工业化生产紫杉醇的实现[11]。
1.2.5微生物发酵法
1993 年 Stierle 与 Stroble 首次报道了从太平洋紫杉树中分离出 200 多个内生真菌，对培养产物运用了 TLC、HPLC、ELISA、MS 和同位素标记等多种手段分析研究，发现一个真菌新种在培养 3 周后具有稳定地产生紫杉醇的能力，被命名为Taxomyces andreanae，紫杉醇含量为 24-50 ng/L[12], 随后一系列产紫杉醇内生真菌被分离到[13-19]，为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径。除已经报道的内生真菌外，加拿大的科研人员还从加拿大红豆杉(Taxuscanadensis)的针叶中分离出一株产紫杉醇的内生细菌 Brawinia taxi，其紫杉醇的产量为 200-1000 ng/L，该菌株已经被保存在 ATCC (American Type Culture Collection)，遗憾的是目前分离到的内生真菌紫杉醇产量都不高，尚达不到产业化的要求。但是真菌的遗传操作比植物更简单，通过发酵条件和应用现代生物技术，可望提高紫杉醇的产量，降低紫杉醇的价格来满足市场的需求。所以筛选产高产紫杉醇内生真菌，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是目前解决药源问题的有效途径之一。
1.2.6 从山榛等植物中提取紫杉醇
榛子为桦木科(Bet ulaceae)、榛属(Coryl us linn), 坚果树种，世界有15个种, 广泛分布在亚洲、欧洲、北美洲的温带地区。被学术界确认的有9个种，即美洲榛(C.America)、欧洲榛(C. avellana)、土耳其榛(C. colurna)等。榛子原产于我国，我国北方主要有两个种，即平榛(C. heterophylla Fisch)和毛榛(C. mandshurica Maxim)，其分布范围广，遍布黄河、秦岭以北地区。1998年美国俄勒岗大学化学系Angela Hoffman博士等人发现从欧洲榛子中可以提取紫杉醇，她们发现至少从12个榛子树中提取到紫杉醇，特别是Gasaway, Halls Giant, Lewis and Willamette这四个品种紫杉醇含量较高[20-25]。2006年意大利科学家Federica Bestoso等人也从欧洲榛子的愈伤组织提取到紫杉醇且在
愈伤组织中紫杉醇水平与红豆杉相当[26]。尽管山榛中的紫杉醇含量只有红豆杉的1/10，但是山榛是被子植物，世界上被子植物的种类比裸子植物要大数百倍。另外，山榛生长十分迅速、资源极其丰富，且不怕任何病虫害，更可贵的是山榛不仅枝叶、树皮中能够分离出了紫杉烷和紫杉醇等活性成分，它的果实-山榛子壳中也含有紫杉醇。他们的发现为紫杉醇药用新资源开发带来了新的希望，既可降低紫杉醇的价格，又有助于保护红豆杉这一珍稀植物资源。1999年美国科学家Roy Stahlhut等人从东非罗汉松(Podocarpaceae)中提取到紫杉醇，但含量较低(0.54 mg/kg 干重)[27]。张长河等对可能与红豆杉有共同的起源的三尖杉(Cephalotaxus fortunei Hook.F.)的当年生幼茎和未成熟假种皮诱导出愈伤组织，HPLC分析发现含有紫杉醇和合成紫杉醇的前体10-去乙酰基巴卡亭III等物质[28]。周荣汉等从白豆杉(Pseudotaxus chienii)中分离到了紫杉醇和短叶醇的存在[29]。这些发现可望为扩大紫杉醇原料来源的途径之一。如果上述几种紫杉醇技术开发的成功，将可大大缓解人们对红豆杉的依赖，避免人为造成红豆杉属植物的物种的生存危机，有效降低紫杉醇应用成本，为临床的广泛应用提供可能。
1.2.7 基因工程
随着基因工程技术的飞速发展和广泛应用，利用现代生物技术提高植物或微生物中紫杉醇及其前体含量的研究成为近年来科研工作者研究的一个热点。将紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入植物或微生物中，获得转基因的细胞系、组织、再生植株，转基因的真菌或细菌，并进行大规模的培养，有可能从根本上改变紫杉醇供应不足的局面，最终实现紫杉醇的商业化生产。
利用基因工程方法增加红豆杉中紫杉醇的含量取决于两个条件：一是分离红豆杉中与紫杉醇生物合成相关的酶和基因；二是红豆杉遗传转化和再生体系的建立。美国华盛顿州立大学的 Rodney Croteau 院士领导的研究小组对紫杉醇在植物体内合成代谢机制的研究已经取得一些重大意义的进展，目前除了有限的几步反应尚不清晰外，其中编码大部分催化反应的关键酶基因已经被克隆并做了功能验证[30]。
红豆杉遗传转化比较困难，目前为止还没有成功的再生植株文献报道。但在这方也取得了一些重要进展，Richard等1993年用发根农杆菌转化太平洋红豆杉获得发根并检测到了紫杉醇[31]。Ermanno等的专利则是用发根农杆菌ATCC15834转化东北红豆杉叶片, 获得发根并提取到紫杉醇。但是这个专利没有透露发根生长状况和紫杉醇含量。Hamada等利用发根农杆菌转化红豆杉获得发根,发根中紫杉醇含量比愈伤组织中增加50倍[32]。黄遵锡等报道用发根农杆菌
A4感染短叶红豆杉芽外植体,30-35天后诱导发根, 诱导率达到30%，红豆杉发根在无激素的B5培养液中悬浮培养20天，生物量增加9倍，是同等条件下短叶红豆杉愈伤组织的2.9倍[33]。Han等利用根癌农杆菌使太平洋红豆杉和欧洲红豆杉无菌茎段产生冠缨瘤，并用Southern杂交检测到T-DNA的存在，从而首次证明红豆杉可被农杆菌转化[34]。盛长忠等用土壤农杆菌C58感染东北红豆杉(T. cuspidate)的外植体、愈伤组织, 结果,处于对数生长期的愈伤组织感染5min 时, 冠瘿诱导率较高[35]。罗建平等用根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体转化而实现插入诱变。所有这些研究结果为今后将目的基因导入红豆杉细胞奠定了一个良好的基础[36]。
目前部分微生物全基因组测序的完成, 促使人们利用基因工程技术, 将合成紫杉醇的基因簇转移到宿主微生物里，实现工业化生产成为可能。Huang 等的研究报道将紫杉醇合成途径中编码三个酶——异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合成酶和紫杉二烯(taxadiene)合成酶的基因转到大肠杆菌Escherichia coli.中，使之过量表达来合成紫杉二烯—一种非常重要的紫杉醇的前体物。结果表明，本不产紫杉二烯的 Escherichia coli.中紫杉二烯的产量达 1.3 mg/l[37]。最近，Jennewein 等(2005)报道，将红豆杉中的细胞色素 P450 还原酶与细胞色素 P450氧化酶基因转到酵母中共表达，均在转化菌中检测到了它们的活性[38]。
1.3主要性质
【英文名称】 Paclitaxel
【别名】泰素，紫素，特素
【化学名称】 5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异
丝氨酸酯]
【分子式】
【分子量】 853.92
【CA S NO】 33069-62-4
【产品来源】为红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶以及树皮。
【规格含量】 99.5%
【物理性质】白色结晶体粉末。无臭，无味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。
2.色谱分析方法
2.1反相HPLC法分析红豆杉树皮和树叶中紫杉醇及其类似物含量的研究[39]
色谱条件：
(l)等梯度洗脱:流动相为乙睛+水(45+55),流量1.0ml/min,紫外227nm检测;每个样品的分析时间为20mim。(2)梯度洗脱:流动相A为乙睛+水(25+75),B为乙睛+水(60+40)。流量1.0ml/min,紫外227nm检测。梯度程序为:从0min到35min,B 的浓度从100%0%到;从35min到min,B的浓度保持在100%;从45min到46min,B 的浓度从100%下降到O%,回到起始状态;继续洗脱10min至色潜柱平衡和基线稳定后进行下一次分析,整个分析时间约60min。
2.2 高效液相色谱法测定南方红豆杉中紫杉醇的含量[40]
色谱条件:
色谱柱：Kromasil ODS C18色谱柱；流动相：水- 甲醇- 乙腈（40：30：30）；检测波长：227 nm ；流速为 1 mL?min-1；柱温为35 ℃；进样量10 μL。理论板数按紫杉醇峰计算不得低于 2 000。
测定波长的确定取紫杉醇对照品适量，加甲醇制成对照品溶液，置紫外分光光度计记录紫外吸收图谱，结果显示在227 nm 处有最大吸收。
2.3高效液相色谱-质谱联用技术测定毛榛中的紫杉醇含量[41]
色谱条件：
色谱柱：Waters XBridge C18高效液相色谱柱(250 mm×4．6mm，5μm)；洗脱梯度：流动相A为甲醇乙腈混合溶液(甲醇+乙腈=1+1)，B为含0．1％乙酸铵的水溶液。0～0．5min，90％A，10％B；3．0～3．5 min，A相从90％升至100％；4．5min 90％A，10％B。流速为0．4 mL·min～；进样量5斗L；柱温35℃。
2.4苯基-硅胶色谱介质的合成及其在紫杉醇提纯中的应用[42]
紫杉醇的定性定量分析:采用4.6mmi.d×250mm的C18柱，流动相为甲醇-乙腈-水（体积比为25:45:30）溶液，等度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为227nm。用紫杉醇标准品对照定性，外标法定量。
2.5 HPLC法测定加拿大紫杉中紫杉醇的含量[43]
色谱条件：
色谱柱为Agilent ZOBAX C
(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇：水(65：
18
35)；流速：lmL／min；检测波长：227nm；进样量：20μL：柱温为室温。
2.6 D4020大孔树脂提纯发酵液中紫杉醇的研究[44]
采用高效液相法(HPLC)进行检测，色谱条件：
)柱(D 4．6 mm 日本岛津HPLC 2010CHT高效液相色谱仪，固定相：VP-0DS(C
18
x 150 mm；5μm)；流动相：V(乙腈)：V(甲醇)：V(水)=35：20：45；体积流量0．7 mL／mim检测波长227 rim；灵敏度：0．1AUFS；柱温35℃；进样量lOμL。
2.7 HPLC测定比较曼地亚红豆杉和南方红豆杉不同部位的紫杉醇含量[45] Chromatographic conditions:
Chromatographic Colum: Phenomenex-C18( 250 mm×4.6mm,5μm), flow rate:
0.8 mL/min, mobile phase:MeOH-water( gradient elution: 0 ~ 10 min, 65%methano;13~25 min, 67% methano; 26~75 min,100% methano;76~80 min, 65% methanol), wave length: 227 nm, column temperature: 30e, injection volume: 20μL.
2.8 HPLC法测定南方红豆杉种子中紫杉醇的含量[46]
色谱条件：
色谱柱：Whatman C18(250×4.6mm，5μm).流动相：乙腈-水（35:65-80；20）梯度洗脱，运行时间30min。柱温：30℃。流速：1mL/min。紫杉醇检测波长为227nm。进样量为20μL。
2.9 HPLC法测定紫杉醇血药浓度条件的筛选[47]
色谱条件:
色谱柱：C18(150minx4．6mm，5μm)；检测波长：227 nm；柱温：25 ℃；流速：1．0 mL·min-1；流动相：分别用甲醇一乙腈一水(16：40：44 V/v)，甲醇一乙腈一磷酸盐缓冲液(pH分别为3.0和4.0)(16：40：44V/v)，乙腈一磷酸水溶液(pH=3.0)(50：50V/v)和乙腈一磷酸盐缓冲液(pH=4．0)(50：50V/v)为流动相，比较紫杉醇、多西紫杉醇及地西泮的出峰时间和峰形以及三者的分离度。
2.10 RP－HPLC 法测定新乡种植红豆杉树皮中的紫杉醇[48]
色谱条件:
Agilent色谱柱(型号TC—C18 250 mm×4．6 mm，5 μm)，流动相V(乙腈)：V(水)=50：50，流速1.0 mL/min，紫外检测波长227 nm；进样量为10μL；柱温为35℃。
2.11 SPE-HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量[49]
色谱条件：
岛津HP 2010C高效液相色谱仪，VP-ODS C18柱(150mm ×46mm)；流动相为甲醇：(v)水：(v)：乙腈(v)=20：45：35；流速0.7ml／min，检测波长227 nm，灵敏度，0．1 AUFS，柱温35℃，进样量20μL。
2.12 高效液相色谱法测定不同生长年限南方红豆杉中紫杉醇的含量[50]
色谱条件：
柱(200 mm×4.6mm，5 μm)，流动相色谱柱为大连伊利特Hypersil BDS C
18
为甲醇一水(58：42)，流速1．0ml.min-1，检测波长为227nm，柱温为25℃。理论板数经紫杉醇峰计>3 000，与相邻杂质峰的分离度>1．5。
2.13 云南红豆杉枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的测定[51]
色谱条件:
色谱柱：Angilent Hypersil ODS2柱（46mm×250mm×5μm）；流动相：甲醇-乙腈-水（20:30:50）；柱温：30℃：流速：1.0ml/min;检测波长：227nm；进样量：10μL
2.14 正相和反相柱层析组合分离纯化紫杉醇[52]
色谱分析：
采用HPLC对紫杉醇进行分析，检测波长为227nm，4.6mm×250mm的C18柱（BECKMAN公司），同溶剂洗脱（Isocratic elution),流动相为甲醇/乙腈/水（25:35:40），流速为1.0mL/min.
2.15 正相色谱法分离纯化紫杉醇工艺过程的研究[53]
分析检测用TLC法结合HPLC法，
TLC法采用EMERCK公司生产的铝制60F254硅胶板，板上硅胶厚度0 . 2 mm，HPLC为岛津SCL—14Avp液相色谱仪，检测器型号SPD—10Avp .流动相（体积比）甲醇：水（65 ：35），流速1 . 0 mL / min .
2.17 中性氧化铝固相萃取-HPLC法测定紫杉醇含量[54]
色谱条件:
Hypersii C18柱（250mm × 4 . 6mm，5μm）；流动相：甲醇-水-乙腈（22：
45：33）；流速：1mL/ min；检测波长：230nm。
2.18 紫杉醇高产菌发酵产物的分离、纯化和鉴定[55]
HPLC法测定纯度及含量:
Waters1525液相色谱仪，大连依利特C18柱(150mm×4．6mm，5μm)，流动相：甲醇一水(70：30)，流速0．7mL／min，检测波长227nm。
3.结论
本文对紫杉醇进行了简单概述，介绍了紫杉醇的发现历史、来源、性质。并对相应的检识方法进行了简单介绍，同时，还对紫杉醇的分布及存在形式进行了简略描述。此外，对紫杉醇的提取方式进行了一定的归纳，主要叙述了几种提取方法。最后，讨论了紫杉醇的色谱分析，主要高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、固相萃取-高效液相色谱法、正相和反相柱层析组合法、反相高效液相色谱等几种方法进行了探讨。
References:
[1].王正平. 天然抗癌药物-紫杉醇. 应用科技, 2004, 31(1): 56-58.
[2].Nicolaou KC, Yang Z, Liu JJ, et al. Total synthesis of taxol. Nature, 367(6464):630-634.
[3]. Holton RA, Somoza C, Kim HB, et al. First total synthesis of Taxol. J Am Chem Soc, 1994, 116(14): 1597-1602.
[4].Danishefsky SJ, Master JJ, Young WB, et al. Total synthesis of Baccatin III and Taxol. J Am Chem Soc, 1996, 118(12): 2843-2859.
[5]. Morihira K, Hara R, Kawahara S, et al. Enantio-selective total synthesis of Taxol.J Am Chem Soc, 1998, 120(49): 12980-12981.
[6]. Christen AA, Bland J, Gibson DM. Cell cultures as a means to produce Taxol.Proc Am Assoc Cancer Res, 1989, 30: A2252.
[7]. Christen A A, Gibson DM, Bland J. Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture. US Patent, 1991, No. 5019504.
[8]. Kingston DG. Taxol: the chemistry and structure-activity relationships of a novel anticancer Agent. Trends Biotechnol, 1994, 12(6), 222-227.
[9].甘烦远，郑光植，彭丽萍，等. 云南红豆杉细胞的悬浮培养. 植物生理学报,1997, 23(1): 43-46.
[10].刘本叶, 叶和春. 利用生物技术生产紫杉醇的研究进展.生物学通,1999, 34 (7):5-7.
[11]. 马玺, 马英, 刘威, 等. 红豆杉细胞培养生产紫杉醇. 药物生物技术, 2004, 11(6): 401-405.
[12]. Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae, an endophytic fungus of pacific yew. Science, 1993, 260(5105):214-216.
[13]. Strobel G, Yang XS, Sears J, et al. Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallachiana. Microbiology, 1996, 142: 435-440.
[14].Li JY, Stroble G, Sidhu R, et al. Endophytic Taxol producing fungi from bald cypress, Taxodium distichum. Microbiology, 1996, 142: 2223-2226.
[15].Li JY, Sidhu RS, Ford EJ, et al. The induction of taxol production in the endophytic fungus—Periconia sp from Torreya grandifolia. J Indust Microbiol Biotechnol, 1998, 20: 259-264. [16].Metz AM, Haddad A, Worapong J, et al. Induction of the sexual stage of Pestalotiopsis microspora, a taxol-producing fungus. Microbiology, 2000, 146:2079-2089.
[17].Wang JF, Li GL, Lu HY, et al. Taxol from Tubercularia sp. strain TF5, an endophytic fungus of Taxus mairei. FEMS Microbiol Lett, 2000, 193(2): 249-253.
[18].Shrestha K, Strobel GA, Shrivastava SP, et al. Evidence for paclitaxel from three new endophytic fungi of Himalayan yew of Nepal. Planta Med, 2001, 67(4):374-376.
[19]. Guo BH, Wang YC, Zhou XW, et al. An endophytic Taxol-producing fungus BT2isolated from Taxus chinensis var. mairei. Afr J Biotechnol, 2006, 5(10): 875-877.
[20].Hoffman A, Khan W, Worapong J, et al. Bioprospecting for Taxol in Angiosperm Plant Extracts. Spectroscopy, 1998, 13(6): 22-32.
[21]. Boone RB, Hoffman A, Daley L, et al. How Taxol was found in hazelnut trees. Australian Nutgrower, 2000, 14: 36.
[22]. Service RF. Hazel Trees Offer New Source of Cancer Drug. Science, 2000,288(5463): 27-28.
[23].Susman E. Hazelnut trees found to produce Taxol. Oncology Times XXII No,2000, 6/June.
[24].Zheng P, Zhang J, Hoffman A, et al. The American Society of Pharmacognosy.Interim meeting Alisomar, California November 8 to 11, 2001.
[25].Zhang J. Degradation Kinetics of Taxol Using Mass Spectroscopy, the thesis for the degree of Masters of Science in Horticulture presented on September 22, 2005.
[26]. Bestoso F, Ottaggio L, Armirotti A, et al. In vitro cell cultures obtained from different explants of Corylus avellana produce Taxol and taxanes. BMC Biotechnol, 2006, 6: 45. doi:10.1186/1472-6750-6-45.
[27]. Stahlhut R, Park G, Peterson R, et al. The occurrence of the anti-cancer diterpene taxol in Podocarpus gracilior Pilger (Podocarpaceae). Biochemical Systematics and Ecol, 1999, 27: 613-622.
[28]. 张长河, 廖衍慧, 罗鹏. 三尖杉的组织培养－紫杉醇来源的新途径. 生物技术,1996, 6(5): 17-18.
[29].周荣汉, 朱丹妮, 高山林, 等. 紫杉醇及短叶醇在白豆杉中的存在. 中国药科大学学报, 1994, 25(5): 259-261.
[30].Guo BH, Kai GY, Tang KX, et al. Taxol synthesis. Afr J Biotechnol, 2006, 5(1):015-020.
[31]. Richard N. Cultured Taxus tissues as a source of Taxol, related taxanes and othernovel anti-tumorl anti-viral compounds. WO Patent, 1993, No. 23555.
[32].Hamada H, Mikuni K, Takahasi H, et al. Transformation of callus of Taxus brevifolia. Jpn Kokai Tokyo JP, 1995, Patent No. 289248.
[33]. 黄遵锡, 慕跃林, 周玉敏, 等. 发根农杆菌对短叶红豆杉的转化及毛状根中紫杉醇的产生. 云南植物研究, 1997, 19(3): 292-296.
[34]. Han KH, Fleming P, Walker K, et al. Gentic transformation of mature Taxus: An approach to genetically control the in vitro production of the anticancer drug:Taxol. Plant Sci, 1994, 95: 187-196.
[35].盛长忠, 王淑芳, 张心平, 等. 土壤农杆菌C58 遗传转化东北红豆杉的初步研究. 南开大学学报, 1999, 32: 27-30.
[36]. 罗建平, 姜绍通, 潘丽军. 根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化. 世界科学技术-中医药现代化, 2003, 5(3): 49-52.
[37].Huang QL, Roessner CA, Croteau R, et al. Engineering Escherichia coli for the Synthesis of Taxadiene, a Key Intermediate in the Biosynthesis of Taxol. Bioorg Med Chem, 2001, 9: 2237-2242.
[38].Jennewein S, Park H, DeJong JM, et al. Coexpression in yeast of Taxus cytochrome P450 reductase with cytochrome P450 oxygenases involved in Taxol biosynthesis. Biotechnol Bioeng, 2005, 5: 588-598.
[39].牟德海等,反相HPLC法分析红豆杉树皮和树叶中紫杉醇及其类似物含量的研究.分析测试学报,1997(16):第8-11页.
[40].黄旭梁, 刘开生与徐垒柱, 高效液相色谱法测定南方红豆杉中紫杉醇的含量. 现代中药研究与实践, 2010. 24(4): 第60-62页.
[41]. 罗凡等,高效液相色谱一质谱联用技术测定毛榛中的紫杉醇含量.林业科学研究,2011(24):第779-783页.
[42].田桂莲等,苯基-硅胶色谱介质的合成及其在紫杉醇提纯中的应用,色谱,2001(19):第47-50页.
[43].李西林等, HPLC法测定加拿大紫杉中紫杉醇的含量. 中国实验方剂学杂志, 2006(03):
第9-10页.
[44].李勇超等, D4020大孔树脂提纯发酵液中紫杉醇的研究. 食品与生物技术学报, 2010(05): 第710-714页.
[45].董权锋, 刘晶晶与于荣敏, HPLC测定比较曼地亚红豆杉和南方红豆杉不同部位的紫杉醇含量(英文). 中药材, 2010(07): 第1048-1051页.
[46]. 张俭俭，吴叶红，HPLC法测定南方红豆杉中紫杉醇的含量.中国执业药师,2011（08）:第35-37页.
[47]. 孟素蕊等, HPLC法测定紫杉醇血药浓度条件的筛选. 天津医科大学学报, 2011(01): 第6-9页.
[48]. 赵俊宏等, RP-HPLC法测定新乡种植红豆杉树皮中的紫杉醇, 2011. 第288-290页.
[49].李勇超等, SPE-HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量. 生物技术通报, 2009(12): 第180-183页.
[50]. 曾志平与王实强, 高效液相色谱法测定不同生长年限南方红豆杉中紫杉醇的含量. 中南药学, 2008. 6(1): 第56-57页.
[51]. 刘莉与罗佳波, 云南红豆杉枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的测定. 时珍国医国药, 2006. 17(5): 第754-755页.
[52].张志强等,正相和反相柱层析组合分离纯化紫杉醇.生物工程学报,2000(16):第69-73页.
[53].刘莹等, 正相色谱法分离纯化紫杉醇工艺过程的研究. 哈尔滨商业大学学报：自然科学版, 2003(5): 第517-521页.
[54]. 戴承兵, 熊丽蓓与何倩琼, 中性氧化铝固相萃取柱在三氯蔗糖测定中的应用. 上海预防医学, 2006. 18(1): 第21-22页.
[55].程首先等, 紫杉醇高产菌发酵产物的分离、纯化和鉴定. 中国药科大学学报, 2011(06): 第570-572页.
紫杉醇的提取和性能 姓名：高海艳 学号：51151300057 专业：种子植物分类学
紫杉醇的提取和性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇（T axol）是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1]（结构如图一所示），是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）和东北红豆杉（Taxus cuspidata）的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用，主要用于治疗卵巢癌和乳腺癌[2]，被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉（Taxus cuspidata）幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材，幼苗的紫杉醇含量高低依次则是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外，对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究，结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉，再次为红豆杉；而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]： 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取
细胞密度 确定接种细胞培养时间 确定培养基 细胞悬浮培养配制培养基 2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]： 三、紫杉醇药用功能及体制液—液萃取 己烷沉淀 硅胶柱层析 结晶 TLC检测高效液相色谱检测 诱导愈伤组织 配制培养基添加植物激素 制备及接种外植体红豆杉幼茎30 天 转 接 继代培养筛选抗褐化剂 柠檬酸 VC 活性炭 确定愈伤组织 直接继代 剥离后继代 分离检测紫杉醇TLC-紫外分光光度法 多次继代至生长稳定 筛选高产细胞株培养方式 普通平板培养 条件培养 看护培养 植板率 稳 定 高 产 细 胞 株 添加多种代谢调节因子 确定培养方式小剂量连续添加一次性大剂量添加 确定代谢调节因子加入时间 高效诱导体系
高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，
一. 方法建立的步骤 二．开始前应知道 1. 样品的性质 在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。 表 1 有关样品组分和性质的重要信息 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度 样品的化学成分能够为选择HPLC分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意这两种HPLC的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。 2.分离的目的 HPLC分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？； （2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到±1—2%，特别是不需样品预处理的情况。 （4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形态，环保样品等）。是否需要一种以上的HPLC方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？ （5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。 有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过10个，运行时间一般应控制在20min以内。（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？ 方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。 三. 样品的预处理和检测 1. 预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现：
紫杉醇规模生产工艺及方案（1500吨/年规模） 一、项目规模生产工艺方案 1、紫杉醇概述紫杉醇具有复杂的化学结构，母核部分是一个复杂的四环体系，有许多的功能基团和立体化学特征，化学名称为：5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯，分子由3个主环构成二萜核，上连1个苯异丝氨酸侧链，分子中有11个手性中心和多个取代基团，分子式为C47H51NO14，相对分子质量853.92，元素百分比（%）C：66.41，H:6.02，N:1.64，O:26.23。紫杉醇结构式为：紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。甲醇制3mg/ml 的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每咸的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外（﹥90%），经肾清除只占总清除的1%~8%。 红豆杉浸膏
1.1操作过程： （1）浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 （2）浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。（3）萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯（按物料：醋酸乙酯=1：1），萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 （4）干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为-0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 1.2紫杉醇粗制工艺步骤 1.2.1操作过程 （1）配料、装柱：将紫杉醇浸膏约100kg按物料、重量比1：1的比例加入100-200目的硅胶搅拌均匀，真空干燥，装柱。 （2）一次层析、浓缩：配制不同极性的淋洗液（乙酸乙酯：正已烷
色谱扫盲班 第一课色谱法概述 色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的叫气相色谱，流动相为液体的叫液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪，目前，主要有气相色谱仪和液相色谱仪。 色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特。1905年，他将从植物色素提取的石油醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名。这就是最初的色谱法。后来，用色谱法分析的物质已极少为有色物质，但色谱一词仍沿用至今，在50年代，色谱法有了很大的发展。1952年，詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系并提出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反映载气流速和柱效关系的范笨姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年，高莱(Golay)发明了毛细管柱，以后又相继发明了各种检测器，使色谱技术更加完善。50年代末期，出现了气相色谱和质谱联用的仪器，克服了气相色谱不适于定性的缺点。则年代，由于检测技术的提高和高压泵的出现，高效液相色谱迅远发展，使得色谱法的应用范围大大扩展。目前，由于高效能的色谱往、高灵敏的检测器及微处理机的使用，使得色谱法已成为一种分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析仪器。 在这里主要介绍气相色谱分析法。同时也适当介绍液相色谱法。气相色谱法的基本理论和定性定量方法也适用于液相色谱法。其不同之处在液相色谱法中介绍。 第二课气相色谱仪 典型的气相色谱仪具有稳定流量的载气，将汽化的样品由汽化室带入色谱柱，在色谱柱中不同组分得到分离，并先后从色谱柱中流出，经过检测器和记录器，这些被分开的组分成为一个一个的色谱峰。色谱仪通常由下列五个部分组成： 载气系统（包括气源和流量的调节与测量元件等） 进样系统（包括进样装置和汽化室两部分） 分离系统（主要是色谱柱） 检测、记录系统（包括检测器和记录器） 辅助系统（包括温控系统、数据处理系统等）
抗癌药物 ——紫杉醇 一、前沿 1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。 紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机理，现主要用于治疗晚期乳腺癌和卵巢癌等癌症。紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基。其全合成引起国内外许多有机化学家的兴趣。先后共有30多个研究组参与研究，实属罕见。经20多年的努力，于1994年才由美国的R．A．Holton与K．C．Nicolaou两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和I．Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。6条合成路线虽然各异，但都具有优异的合成战略，把天然有机合成化学提高到一个新水平。 紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗.紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物,其新颖复杂的化学结构、广泛而显著的生物活性、全新独特的作用机制、奇缺的自然资源使其受到了植物学家、化学家、药理学家、分子生物学家的极大青睐,使其成为20世纪下半叶举世瞩目的抗癌明星和研究重点,包括寻找新的生物资源、化学全合成、半合成、衍生物制备、生物转化、生物合成、生物工程、构-效关系研究、作用机制研究、药理学和药效学等研究.2011年是发现紫杉醇结构40周年,对紫杉醇发现的曲折历史过程进行回顾和总结,以纪念这一伟大发现并纪念为紫杉醇的研究与第二代紫杉醇的开发作出贡献的科学家。 二、紫杉醇的制备 1.1 天然红豆杉植物提取 紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种的提取红豆杉属植物共11种，我国有4种及1种变种，它们分别是云南红豆杉、西藏红豆杉（又名喜马拉雅红豆杉）、中国红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉（又名美丽红豆杉）。由于这些植物数量极少，自身繁殖率低，生长缓慢，且紫杉醇的含量又极低（每千克干树皮最多只能得到50~150mg 的纯紫杉醇），生产1g紫杉醇需砍伐3~4棵60年树龄的大树。在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物树皮中提取必将给红豆杉属植物的在自然界中的生存带来极大的威胁。但由于从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此，人们可利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题. 1.2人工栽培
紫杉醇综述 摘要：紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机制，它的问世被誉为20世纪90年代国际上的抗癌药三大成就之一。本文综述了近年来对红豆杉的资源概括、抗癌机制、化学成分、制备方法、不良反应等方面的新研究进展，对当前工作中存在的问题进行了探讨。 关键词：紫杉醇、红豆杉、抗癌、植物组培、不良反应 前言 全世界60亿人口中，每年约新增800万癌症患者，600多万人死于癌症，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死亡。癌症严重地威胁着人类的生命和健康，因此寻找有效的抗癌药物成为研究的热点。早在1958年美国癌症协会就发起一项历时20余年、筛选35000多种植物物种提取物的计划。在计划实施过程中，1963年美国化学家瓦尼和沃尔首次从生长在美国西部大森林中称太平洋杉中分离到了紫杉醇的粗提物。并发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性。由于该活性成份含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇。1992年12月紫杉醇被FDA批准上市，目前紫杉醇已成为世界公认的强活性广谱抗癌药物。然而由于这种天然化合物资源极其有限，严重的限制了其研究和应用的进度。同时尖锐的供需矛盾也在医学、化学和植物组织培养领域中引起了一场非同寻常的广泛研究，以增加这种化合物的来源和寻找高效、低毒、来源丰富的紫杉醇类似物[1]。 一红豆杉资源 紫杉又名红豆杉、赤柏松，为紫杉科紫杉属长绿针叶乔木，是世界珍稀濒危物种，国家一级保护植物。因其药用价值巨大，世界各国将其列为“国宝”，素有“植物黄金”之称。目前在我国共有4个种和1个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种）。但在我国资源并不丰富。 [2]野生红豆杉一般散生在海拔2500-3000米的深山密林中，成材需50-250年，
紫杉醇提取工艺原理及操作技术 紫杉醇为白色结晶性粉末，无臭，无味，在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。紫杉醇常规的提取工艺各个生产环节需控制在低温下操作，保证产品活性。各个工时段应尽快完成，可选水浴加热提取罐(含溶剂回收装置)，旋转真空浓缩机组(低温浓缩，1-2秒完成)，层析柱(精制分离)，板式真空干燥箱(低温干燥、速度快)。 紫杉醇提取操作过程 (1)浸提：将原料投入提取罐内，干红豆杉每罐填装约1.2吨的原料，加入约4吨的甲醇浸提，温度为45±5℃，每遍循环浸提大于4小时，浸提完成后，将浸提液排入浸提液储罐中，进行蒸汽吹渣，温度控制在85±5℃,压力小于等0.2Mpa，回收残余的甲醇溶液，吹渣结束后，将废渣移到废料堆场集中处理。 (2)浓缩：浓缩温度控制在45±5℃，真空度控制在-0.07±00.1Mpa，浸提液浓缩至比重达到0.95~1.05时，将浓缩液放出到专用的储罐中。 (3)萃取：将计量后的浸提浓缩液注入萃取罐，加入醋酸乙酯(按物料：醋酸乙酯=1：1)，萃取三次，将醋酸乙酯层重液排入指定贮罐，将贮罐内的醋酸乙酯液抽入浓缩锅进行初浓缩预处理，温度控制在 45±5℃，待浓缩液比重达到1.40±0.05时，将浓缩后的醋酸乙酯液排入指定贮罐中。 (4)干燥：将浓缩后的醋酸乙酯萃取液抽入蒸发罐内，罐内温度不超过45±5℃，真空度为 -0.06±00.1Mpa，浸膏置真空干燥箱内干燥，干燥完成后，取出产品，凉干，敲碎，经检验合格后即成为紫杉醇浸膏，用铁桶封装，入库阴凉保存。 甲醇制3mg/ml的溶液，比旋度为-48℃~56℃。甲醇制15μg/ml的溶液，在227nm处有最大紫外吸收，10mg紫杉醇加甲醇溶液10ml溶解后应澄清无色。紫杉醇注射剂是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。体外实验证明紫杉醇具有显著的放射增敏作用，可能是使细胞中止于对放疗每次的G2和M期，适用于卵巢癌和乳腺癌及NSCLC的一线的二线治疗。用于头颈癌、食管癌、精原细胞瘤，复发非何金氏淋巴瘤等治疗，静脉给予紫杉醇注射剂，药物血浆浓度呈双曲线，蛋白结合率89%~98%，主要在肝脏代谢，随胆汗进入肠道，经粪便排出体外(﹥90%)，经肾清除只占总清除的1%~8%。 莱特莱德膜分离技术有限公司致力于膜分离和脱盐浓缩技术以及冷冻浓缩分离技术推广与工艺设备开发。通过多年的努力，已具备丰富的工程经验，为客户提供从小试、中试、工业化设备的工艺设计到设备生产、安装调试等一系列服务，能够提供整体解决方案和交钥匙工程，并成功应用于冶金、环保、制药、化工、食品等领域，赢得了客户和业内的良好口碑。
紫杉醇的提取与性能 姓名:高海艳 学号:51151300057 专业:种子植物分类学
紫杉醇的提取与性能 一、紫杉醇简介 紫杉醇(T axol)就是一种复杂的具有抗癌活性的二萜类生物碱[1](结构如图一所示),就是从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)与东北红豆杉(Taxus cuspidata)的树皮中提取出来的。具有抗肿瘤、抗白血病的显著作用,主要用于治疗卵巢癌与乳腺癌[2],被人们誉为“植物黄金”。 Vidensek[3]对东北红豆杉(Taxus cuspidata)幼苗以及成树的不同部位中的紫杉醇含量作了分析结果表明成树紫杉醇的含量高低依次为树皮>树叶>树根>树干>种子>心材,幼苗的紫杉醇含量高低依次则就是树叶>树根>嫩枝条>心材。另外,对于不同植物来源的组织培养细胞中的紫杉醇含量陈未名等[4]作了大量的研究,结果表明愈伤组织中的紫杉醇含量以云南红豆杉为最高其次为欧洲红豆杉,再次为红豆杉;而悬浮培养细胞中的紫杉醇含量从高到低依次为云南红豆杉、欧洲红豆杉、红豆杉。 二、紫杉醇提取工艺 1、从原植物体中提取紫杉醇[5]: 红豆杉枝叶、树皮、树枝的采集 原料的干燥及粉碎 有机溶剂提取:甲醇 除去浸膏 固—液萃取 液—液萃取 己烷沉淀
2、细胞培养高效提取紫杉醇[6]: 1 紫杉醇就是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物,在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌与部分头颈癌与肺癌的治疗[12]。 2、紫杉醇作用于癌症的机制: 1979年,美国爱因斯坦医学院的分子药理学家Horwitz 博士阐明了紫杉醇独特的抗肿瘤作用机制:紫杉醇可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂与防止诱导细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到抗癌作用(如下图所示)[7-11]。
摘要本文就如何建立TLC法测定有关物质的方法进行论述，系统地阐述了薄层色谱法各条件确定的原理，并列举了质量标准制订中存在的某些问题。 关键词薄层色谱法（TLC法）有关物质方法建立 有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等[1]。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，特别是在药品申报的质量研究资料中需建立其检测方法，并根据生产、稳定性考核等实际情况考虑是否在质量标准中制订该检查项，规定其限度。目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法(HPLC法)和薄层色谱法(TLC法)。 TLC的特点是快速、简便，尤其是对无紫外吸收的杂质测定，更具有其应用价值。如能将TLC法与HPLC法有机地结合、或彼此间进行比对研究，便可得到更多、更为准确的有关杂质信息，做到两方法间的相辅相成，相益得彰！本文将着重讨论如何建立薄层色谱法测定有关物质的方法。 1．测定方法类型 常用的方法有杂质对照品法（适用于已知杂质）和自身（稀释）对照法（适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得杂质对照品）。目前国内由于难以获得杂质对照品、故一般均采用自身对照法。 2．展开剂的确定（即专属性试验） 专属性的研究是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%(w/w)浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来验证系统适用性。之所以如此配制，目的是模仿样品中有可能存在的状态，即有少量（1%左右）杂质存在时是否能与主成分达到完全分离，只有这样才能比较客观、科学地反映样品中实际存在情况的（见图1）；而不应把该溶液配制成：主成分与中间体相同浓度的。因为一者实际检测时样品中不可能存在此种情况；二者该浓度不易确定，目前国内申报资料中一般的作法均是配制成较低的一致浓度，这样各斑点当然易于完全分离了（见图2），但在实际测定时，由于主斑点急剧增大，很易将相邻杂质包含于主成分斑点中。同样，质量标准中的系统适用性试验用溶液的配制方法亦如此。
高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.
从紫杉植物中提取紫杉醇的简化方法 红豆杉Taxus又名紫杉，也称赤柏松，生于海拔1000～1200m处的山地，是世界上公认的濒临灭绝天然珍稀植物，从其根、皮、茎、叶中提取的紫杉醇taxol是目前世界上最有效的抗癌药物之一。全球每年大约需要1500～2500kg紫杉醇，而1 kg树皮仅能提取50～100mg。 10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ又称10-脱乙酰基浆果赤霉素Ⅲ，10-deacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ为有抑制肿瘤作用的紫杉烷二萜类化合物。Bissery等报道，可利用10-DABⅢ合成具有比紫杉醇更高抗癌活性的多烯他赛docetaxel。紫杉醇主要存在于树杆和树皮中，10-DABⅢ主要存在于树叶中，其含量大大高于紫杉醇的含量。 红豆杉是国家珍稀保护植物，生长缓慢，如果直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，不仅资源有限，而且不利于资源保护。以10-DABⅢ为原料采用酶催化半合成工艺方法来制备紫杉醇，可大大简化合成过程，使紫杉醇骨架修饰所需步骤更少，操作更简单，提高了紫杉醇合成的选择性和生产率，进而为在更大规模上进行紫杉醇生产提供了技术支持，最终使紫杉醇的化学合成半合成的产业化有了实现的可能。 目前文献报道从各种紫杉植物中提取紫杉醇的方法，均需经过繁冗的分离过程。本实验采用了一种适合于以各种紫杉植物树叶或树枝做原料，通过极性梯度溶剂萃取的方法逐步脱除大量不相干杂质，得到合成紫杉醇的前体10-DABⅢ的方法，然后通过反相层析柱加成，即可获得抗癌活性成分紫杉醇； 材料与方法 1 材料与仪器 南方红豆杉Taxus mairei枝叶取自浙江宁海红豆杉种植基地，8年树龄。10-DABⅢ对照品为Sigma公司产品，纯度98％；所用甲醇；乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、氯仿、正己烷、石油醚、乙腈等均为分析纯试剂。JJ一1精密增力电动搅拌仪，江苏金坛市江南仪器厂；SENCO R一201旋转蒸发仪，上海申顺生物科技有限公司；玻璃硅胶柱为2cm×40cm，杭州常盛科教器具厂；UV一2802PC／PCS型分光光度计，UNICO上海仪器有限公司；Sigma一3K18低温离心机4℃，转速18000rmin；LabAlliance高效液相色谱仪美国SSI公司。 2 实验方法 取南方红豆杉枝叶研磨成细粉，于燥保存。称取100g红豆杉细粉，45℃烘干，石油醚预处理，5L甲醇冷浸，辅以搅拌，超声40min，反复2次。浸渍液过滤，减压浓缩至100mL。加入75 mL正己烷萃取分液，重复操作2～3次。弃去正己烷层，萃余液旋干溶剂，制成浸膏。加入氯仿与水的混合液1：1反复提取。氯仿层减压浓缩至10～15mL上柱，用硅胶正相色谱柱分离。分段收集洗脱液，紫外监测，收集有效段合并浓缩，在甲醇／水中重结晶。 3 分析测试方法 采用反相高效液相色谱RP―HPLC方法检测。分析柱为Kromasil C18柱250mm×4.6 mm，5μm，流动相为乙腈-水30：70，流速为2.0 mLmin，每次进样体积为10μl，进样间隙用纯乙腈对柱子进行梯度冲洗。紫杉醇最大吸收波长为227nm，检测器测定波长为232nm，温度30℃，相关数据计算均采用峰面积归一化法。 结果 1 预处理 由于红豆杉枝叶中含有大量蜡质、植物色素诸如叶绿素等低极性杂质，故在提取前应首先加入低极性溶剂如正己烷、石油醚浸泡脱脂，以除去大量存在的此类非极性杂质，简化后续操作。该法可除去红豆杉枝叶中多达72％的极性比10-DABⅢ小且可溶于正己烷的杂质。 2 有机溶剂粗提 目前用于紫杉烷类物质提取的最普通的初级萃取剂是乙醇甲醇和水，Xu等采用的是体积比95：5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取时间为35~60min；而Hoke等和Powell等都选择的是纯甲醇，所需萃取时间为16～48h。将南方红豆杉枝叶的细粉在45℃烘干，甲醇浸渍，搅拌过夜。在搅拌的不同时间内其提取出的10-DABⅢ的含量。可以看出，有机溶剂粗提时的浸渍搅拌时间应以12h左右为佳。
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。 一、 基本术语基本术语 读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分 在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）： 图1. 典型色谱图 1. 保留因子(k)： t t t k R ?= (1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.04 2. 拖尾因子(T f )
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 a b a f W W W T 2+= (2) 图2. 典型拖尾峰 在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63. 3. 理论塔板数（N ）
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 图3. 峰高与峰宽的关系 2(16W t N R = (3) 或 2( 54.55 .0W t N R = (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。 设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=3410 4. 分离因子(α) 10 212t t t t k k R R ??= =α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。 设在图1中峰2的保留时间为6.50min, 则分离因子为: (6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.16
紫杉醇提取纯化方法的研究进展 紫杉醇是最早从红豆杉属植物中分离出来的三环二菇类化合物，是继阿霉素和顺铂之后最热点的抗癌新药。紫杉醇具有复杂的化学结构，分子由3个主环构成二菇核，分子中有11个手性中心和多个取代基团，母环部分是一个复杂的四 环体系，有许多功能基团和立体化学特征。分子式C 47H 51 NO 14 ，分子量853.92。 同位素示踪表明, 紫杉醇只结合到聚合的微管上, 不与未聚合的微管蛋白二聚体反应。细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能,特别是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 紫杉醇属于有丝分裂抑制剂,它的独特机制在于可以诱导和促进微管蛋白 聚合,促进微管装配及阻止微管的生理解聚,由此抑制癌细胞纺锤体的形成,阻止 有丝分裂的完成,使其停留在G2期和M期直至死亡,从而起到抗癌的作用。迄今为止紫杉醇是唯一促进微管聚合的新型抗癌药。这一新的发现引起了各国医药界的极大兴趣。现在已有包括我国在内的十多个国家批准了紫杉醇类药物的正式生产。目前有关紫杉醇研究的几个主要问题是:紫杉醇的提取;紫杉醇的人工合成;紫杉醇的临床应用(水不溶性问题的解决);紫杉醇的构效关系;紫杉醇的抗癌机理。紫杉醇的抗癌机理 1971年,Wani等报道了紫杉醇在一些实验体系中具有抗癌活性。1978 年,Schiff等发现紫杉醇在极低的浓度下(0.25μM)可以完全抑制Hela细胞的分裂,而且在对细胞4小时的培养过程中,对DNA、RNA和蛋白质的合成没有明显影响。
色谱分析分离方法概述 本书是色谱世界《色谱技术丛书》的第一分册。全书共四章，主要说明了色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用，色谱法的特点、分类及性能比较，色谱法的原理，色谱模型理论等方面的内容。 第一章色谱法的发展及其在分析化学中的地位和作用 第一节色谱法发展简史 一、色谱法的出现 二、色谱法的发展 三、色谱法的现状和未来 第二节色谱法在工业生产和科学研究中的作用 一、色谱法在经济建设和科学研究中的作用 二、色谱法在分析化学中的地位和作用 第三节色谱法与其他方法的比较和配合 一、色谱法的特点和优点 二、色谱法和其他方法的配合 第二章色谱法的特点、分类及性能比较 第一节色谱法的定义与分类 一、按流动相和固定相的状态分类 二、按使用领域不同对色谱仪的分类 第二节现代色谱法的应用领域和性能比较 一、色谱法的应用领域
二、各种色谱方法的性能比较 第三章色谱法的原理 第一节色谱分析的基本原理 一、色谱分离的本质 二、色谱分离的塔板理论 第二节色谱法中常用的术语和参数 一、气相色谱中常用的术语和参数 二、液相色谱中常用的术语和参数 第三节色谱的速率理论 一、气相色谱速率理论 二、液相色谱速率理论 第四章色谱模型理论 第一节色谱模型概述 一、色谱模型理论的意义 二、色谱模型的建立 三、色谱模型的求解 第二节线性色谱 一、理想过程 二、反应色谱 三、扩散的影响 四、相间传质阻力的影响 五、同时含扩散与相同传质阻力的情形
第三节单组分理想非线性色谱 一、理想非线性色谱数学模型分析 二、谱带发展与流出曲线 三、理想非线性色谱间断解的数学意义———弱解 四、非线性反应色谱 第四节双组分理想非线性色谱 一、数学模型分析 二、情形 三、简单波的传播 四、激波 五、谱带的发展与保留值的计算 第一节色谱法发展简史 俄国植物学家茨维特于1903年在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物。他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上形成三种颜色的6个色带。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”.茨维特于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。把茨
液相色谱仪的原理及分析方法 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9′107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理
高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外,柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅣA)项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1)色谱柱的理论板数（N,用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间ｔR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2),按n=5.5４(t R/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。 （2) 分离度（R)
紫杉醇提取工艺优化研究 赵万年 S1315004 立体依据 紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是Wani等[1]于1971年首次从短叶红豆杉(Taxus Bravifolia Nutt.)中分离得到的一种复杂的次生代谢产物，属二萜类化合物。其抗癌机理独特[2]，活性广谱高效，是目前所发现的惟一一种具有促进微管双聚体装配成微管, 使微管稳定, 从而阻碍细胞分裂, 将癌细胞停止在G2晚期或M期，最终导致癌细胞死亡[3]，抑制肿瘤生长的作用。由于紫杉醇的作用机理独特、疗效显著，因此已用于转移性卵巢癌、乳腺癌等的治疗，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。 虽然现在开发了多种紫杉醇的制备方法，利用半合成、全合成、生物合成、真菌发酵、植物组织细胞培养等技术手段获得紫杉醇的研究工作也取得了较大的进展［4-6］，但是要实现这些技术的工艺扩大和工业放大生产还存在一些问题，而从树皮中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化，因此目前从植物中直接提取分离仍是紫杉醇的主要制备方法。但是，紫杉醇在植物中的含量非常低(含量最高的红豆杉树皮也只有万分之几)[7]，且类似物多，具有热敏性，产物在中间过程中易于分解、变性，不同产地、不同季节的植物资源成分相差甚远，因此分离提取工作难度很大。 目前紫杉醇的提取纯化工艺有溶剂萃取法、固相萃取法、制备色谱法、膜分离法、超临界萃取法、离子交换法、键合物解离法、药理作用靶点法和化学反应法[8-10]。这些工艺各有优缺点，其中溶剂萃取法和制备色谱法是最简单、最常用的方法，也已经成功应用于工业生产，但仍需改进。本课题以乙醇为提取溶剂，探求从南方红豆杉树叶中浸取紫杉醇的最佳提取条件，旨在为南方红豆杉这一药用植物资源的开发与利用提供试验依据。 研究目标 采用乙醇浸提方法，考查粉碎度、乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间
紫杉醇的性质及色谱分析方法 摘要 紫杉醇是从紫杉(Taxus brevifolia)树皮中所提得，是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。已成为目前全球销售量排名第一的抗肿瘤药物。综述紫杉醇的发现历史、来源、性质及色谱分析方法。 Abstract Paclitaxel is extracted from Taxus brevifolia bark,whichnot only is one of the plants of the genus Taxus chinensis complex secondary metabolites, also is the only kind of antitumor drugs that can promote microtubule polymerization and stable microtubule polymerization till now. It has become the top sales in the worldwide . Review of Paclitaxel history, origin, nature and chromatographic methods. 关键词：发现历史；来源；性质；紫杉醇；色谱 Keyword：Discovery history; Source; Properties; Paclitaxel; The chromatographic
1.紫杉醇简介： 1.1发现历史 1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分析确定了该活性成份的化学结构——一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。 1.2来源 由于野生红豆杉资源有限且紫杉醇含量极低，限制了紫杉醇制药业的发展，全世界紫杉醇的需求量约为4000公斤/年，而总产量只有到300-400公斤/年。所以，从天然的红豆杉中提取紫杉醇的方法远远不能满足人们对紫杉醇日益增长的需要。因此，采用各种手段积极寻求紫杉醇新药源生产途径，扩大紫杉醇原料供应能力，已成为紫杉醇产业发展的重点研究方向之一, 目前已取得了一定的进展, 其途径可归结为以下几种： 1.2.2天然红豆杉植物提取 紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种树皮和叶片中中提取。但由