ＤＯＩ：１０．１３３５０／ｊ．ｃｊｐ
ｂ．１５０３２２·综述·
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统—
——靶向基因组编辑的新策略＊赵海卫１，吕欣１综述；尹文２审校＊＊
（１．
第四军医大学微生物学教研室，陕西西安７１００３２；２．第四军医大学西京医院输血科）【摘要】 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统。Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统经人工改造为由Ｃａｓ９核酸酶和特异的ｓｇＲＮＡ构成的新型靶向基因组编辑技术，即ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统。与锌指核酸酶（ＺＦＮｓ）、转录激活子样效应因子核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）相比，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统操作简单，花费低，编辑功能更强。本文综述了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的基本结构、作用机制和应用进展，并对其应用前景进行了展望。【关键词】 Ｃ
ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统；靶向基因组编辑；分子靶向治疗；脱靶效应；综述【中图分类号】 Ｒ３７ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １６７３－５２３４（２０１５）０３－０２８１－０４［Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ．
２０１５Ｍａｒ；１０（３）：２８１－２８４．］Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ：Ａ ｎｏｖｅｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ
ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＺＨＡＯ Ｈａｉ－Ｗｅｉ １，ＬＶ Ｘｉｎ１，ＹＩＮ Ｗｅｎ２ （１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ－ｔｙ，Ｘｉ＇ａｎ ７１００３２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｓ，Ｘｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｍｉｌｉｔａｒｙ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒ－ｓ
ｉｔ）【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｉｓ ａｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｉｓ ｆｏｒｍｅｄ ａｓ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ ｅｖｏｌｖｅ ｏｖｅｒ ｔｈｅｌｏｎｇ ｔｅｒｍ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｎｕ－ｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｇＲＮＡ，ｗｈｉｃｈ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｖｉａ Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ ｂａｓｅ ｐａｉ－ｒｉｎｇ，ａｎｄ ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｗｈｉｃｈ ｃｌｅａｖｅｓ ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｌｉｋｅＺＦＮｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ，ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ ｈａｓ ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｅａｓｉｅｒ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ｌｏｗ ｃｏｓｔ，ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇｃａｐａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ ｉｔｓ ｍｅｃｈａ－ｎｉｓｍ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｐｒｏｓｐ
ｅｃｔｓ ｆｏｒ ｉｔｓ ｆｕｔｕｒｅ ｕｓｅ．【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ；ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ；ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ；ｒｅｖｉｅｗ随着基因组测序技术的日益更新，
越来越多物种的基因组序列被人们所获知，研究基因对表型的功能成为科学家面临的一大难题。靶向基因组编辑技术为克服这一难题提供了可能，该技术通过人工操作对基因组特定基因片段进行定点改造。近些年出现的靶向基因组编辑技术包括：锌指核酸酶（ｚｉｎｃ ｆｉｎ－ｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮｓ）、转录激活子样效应因子核酸酶［ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－ｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ（ＴＡＬ）ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＴＡＬＥＮｓ］和最新发现的规律成簇间隔短回文重复（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒ－ｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９系统。靶向基因组编辑技术的不断问世，为基因功能研究提供了全新的平台。
１ ＺＦＮｓ，ＴＡＬＥＮｓ和ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的比较
锌指核酸酶（ＺＦＮｓ）是人工合成的由串联的锌指ＤＮＡ结构域转录因子蛋白ＺＦＡ（
锌指蛋白）和非特异的核酸内切酶ＦｏｋⅠ结构域融合而成的核酸酶［１］
。其Ｎ末端为锌指蛋白
ＤＮＡ结合域，由一系列识别并结合特异三联体碱基的Ｃｙｓ２－Ｈ
ｉｓ２锌指蛋白串联组成；Ｃ末端为非特异性核酸内切酶ＦｏｋⅠ结构域，只有当两个ＺＦＮ单体同时与各自的ＤＮＡ位点结合时才能形成有切割活性的ＦｏｋⅠ二聚体，从而在靶位点将ＤＮＡ
切断［１］
。转录激活子样效应因子核酸酶（ＴＡ
ＬＥＮｓ）是人工合成的由ＴＡＬ效应子ＤＮＡ结合结构域和非特异的核酸内切酶
ＦｏｋⅠ切割结构域融合而成的核酸酶［２］
。ＴＡ
Ｌ结构域是由多个重复串联的单元组成，每个单元由３３～３５个高度保守的氨
基酸组成，但每个单元第１２和１３位两个氨基酸是可变的，被称为重复可变双残基（Ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ，ＲＶＤ）。当两个ＴＡ
Ｌ单体同时结合ＤＮＡ双链时便形成有切割活性的ＦｏｋⅠ二聚体，在特定靶位点将ＤＮＡ切断［２］
。这两种基因组编辑技术
都是人工合成的嵌合体，由特异的ＤＮＡ结合元件和非特异的ＤＮＡ切割结构域构成，通过诱导基因组靶位点双链ＤＮＡ断裂（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢｓ）从而进行非同源末端连接（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄｉｎｇ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）或同源重组修复（Ｈｏｍｏｌｏ－ｇ
ｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＨＲ）来完成基因改造，然而操作过程中难度较大、系统的构建和组装时间较长，普通实验室很难得到有效地应用。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统是由一个特异性向导ＲＮＡ（ｓｇ
ＲＮＡ）和核酸酶Ｃａｓ９蛋白构成，与ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ相比，该系统具有显著优点：①载体构建简单，Ｃａｓ９蛋白相同，只需设计特异的ｓｇ
ＲＮＡ；②无活性Ｃａｓ９蛋白与其他相关蛋白融合，研究相关蛋白在特定ＤＮＡ序列上的作用［３］
；③可同时编辑多个靶位点基因［４］
；④实验周期短，
花费低，操作简单，易于推广。·１８
２·中国病原生物学杂志
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２０１５年３月 第１０卷第３期
Ｍａｒｃｈ
２０１５，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３＊＊＊【基金项目】 国家自然科学基金项目（
Ｎｏ．８１１７１６３７）；陕西省科技统筹创新工程计划（Ｎｏ．２０１４ＫＴＣＬ０３－０８）；军队后勤计划项目（ＣＷＳ
１３Ｌ０５８）。【通讯作者】 尹 文，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙ
ｉｎｗｅｎ＠ｆｍｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ【作者简介】 赵海卫（
１９８７－），男，陕西西安人，硕士研究生，检验技师，主要从事丙型肝炎病毒研究工作。Ｅ－ｍ
ａｉｌ：１８７０６８８０６７８＠１６３．ｃｏｍ
由于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统具有众多优点，该系统正逐步受到广大科研工作者的青睐。
２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的基本结构
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，用来对抗入侵的病毒及外源ＤＮＡ，它是一类新型的ＤＮＡ重复序列，通常位于原核细胞染色体上，个别位于质粒中，重复序列随物种不同而有所差异［５］。１９８７年，该系统首次在Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２的碱性磷酸酶基因附近区域被发现，２００２年将其正式命名为ＣＲＩＳＰＲ［６］。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统基因组序列由三部分组成：ＣＲＩＳＰＲ基因座、Ｃａｓ基因（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ）和ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）（图１）［６］。ＣＲＩＳＰＲ基因座通常由短的高度保守的重复序列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔｓ）和长度相似的间隔序列（ｓｐａｃ－ｅｒｓ）交替排列组成，重复序列的长度为２１～４８ｂｐ，重复序列之间为２６～７２ｂｐ的间隔序列，这些间隔序列是识别靶标基因的主要元件。ＣＲＩＳＰＲ基因位点的第一个重复序列上游有ＣＲＩＳＰＲ的前导序列（Ｌｅａｄｅｒ），Ｌｅａｄｅｒ序列在ＣＲＩＳＰＲ序列转录过程中发挥了启动子功能。与ＣＲＩＳＰＲ基因座相连的是一系列保守的Ｃａｓ基因，这些基因编码的Ｃａｓ蛋白具有核酸酶的功能，Ｃａｓ蛋白与ＣＲＩＳＰＲ基因座相关转录产物ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）结合对靶标ＤＮＡ序列进行特异性切割。ｔｒａｃｒＲＮＡ主要起连接ｃｒＲＮＡ和Ｃａｓ蛋白的桥梁功能
。
图１ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统基本结构
Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ
３ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的作用机制
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统通过将入侵噬菌体（或质粒）的ＤＮＡ片
段整合到ＣＲＩＳＰＲ基因座的间隔序列中，进而转录生成
ｃｒＲＮＡ，ｃｒＲＮＡ与ｔｒａｃｒＲＮＡ结合形成向导ＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ
ＲＮＡ，ｓｇＲＮＡ），最后ｓｇＲＮＡｓ与Ｃａｓ蛋白结合从而降解同源
互补序列，提供免疫防御［５，７］。迄今为止，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统的
详细作用机制尚未完全阐明，但整个过程大致可以分为３个阶
段：①外源噬菌体（或质粒）入侵阶段：Ｃａｓ蛋白复合物裂解噬菌
体（或质粒）基因组中的原型间隔序列（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒｓ），接下来
这些裂解后的原型间隔序列被整合到宿主基因组ＣＲＩＳＰＲ位
点的５′端；②ｓｇＲＮＡ形成阶段：整合到宿主基因组上的ｐｒｏｔｏ－
ｓｐａｃｅｒｓ序列被转录成ｃｒＲＮＡ，ｃｒＲＮＡ与ｔｒａｃｒＲＮＡ形成一种
双链二级结构，即ｓｇＲＮＡ；③防御阶段：ｓｇＲＮＡ与Ｃａｓ蛋白形
成复合体，在ｓｇＲＮＡ的介导下识别紧随ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒｓ序列后
的原型间隔序列毗邻基序（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ，ＰＡＭ），
Ｃａｓ蛋白的核酸酶结构域对ｓｇＲＮＡ特异识别的双链ＤＮＡ进
行切割，从而使细菌实现对抗同类噬菌体（或质粒）再次入侵的
能力［５，７］。由此可见，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统有两个必备元件：Ｃａｓ
酶和ｓｇＲＮＡ，这为体外设计ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ系统提供了理论基
础。
根据Ｃａｓ蛋白基因序列的不同，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统被分为
３类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［８］。Ⅰ型和Ⅲ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统是通
过多个Ｃａｓ蛋白形成核酸酶复合物来切割ＤＮＡ双链，作用机
制复杂［９－１０］。与之相比，Ⅱ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（又称ＣＲＩＳＰＲ／
Ｃａｓ９）系统只需一种Ｃａｓ９蛋白就可以对ＤＮＡ双链进行精确的
切割，该系统作用机制更简单，更容易进行体外设计和改造，是
目前被应用较为成功的一类人工核酸酶系统［１１］。Ｃａｓ９蛋白是
由多结构域蛋白融合而成，含有２个核酸酶结构域：ＨＮＨ结构
域和ＲｕｖＣ－ｌｉｋｅ结构域（图２）［１２］。ＨＮＨ结构域位于蛋白氨基
端，负责切割与ｃｒＲＮＡ互补配对的ＤＮＡ序列，切割点位于
ＰＡＭ上游３ｎｔ处；ＲｕｖＣ－ｌｉｋｅ结构域位于蛋白中间位置，负责对
另一条ＤＮＡ互补链进行切割，切割点位于ＰＡＭ上游３～８ｎｔ
处［１２］。Ｃａｓ９蛋白晶体结构的解析，使得ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的
作用机制更加清晰，为该系统的优化和应用奠定了基础
。
图２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统作用机制
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ
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中国病原生物学杂志
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２０１５年３月 第１０卷第３期
Ｍａｒｃｈ ２０１５，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３
４ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的应用
基于ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的作用机制，科学家设计并合成表达ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９蛋白的载体，并将该载体系统逐步应用到了细胞研究、植物育种，动物模型构建和分子靶向治疗。４．１ 在细胞研究中的应用 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统作为一种基因编辑工具，
因其设计简单，操作简便，对实验室条件要求低等优势已被广泛应用到各类细胞的基因编辑中。Ｇｉｌｂｅｒｔ等［３］
将无
活性的ｄＣａｓ９基因与抑制（ＫＲＡＢ）或活化（ＶＰ１６或ｐ６５ＡＤ）基因结合构成融合基因，将ｓｇＲＮＡ与ｄＣａｓ９的融合基因共转染ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ和酵母细胞，
成功实现了对真核细胞基因的转录调控。Ｆｕｃｈｓ等［１３］
应用ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系统在ＨｅＬａ细胞中
对核糖体蛋白ｅＳ２５（ＲＰＳ２５）基因进行成功敲除（ＫＯ）
，构建了ＲＰＳ２５基因缺陷细胞系。Ｚｈｅｎｇ等［１４］
设计了双ｓｇ
ＲＮＡ的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统，有效地敲除了人类细胞中不同长度的靶基因，
并证实当提供同源性修复供体时，靶基因将被同源供体基因替换。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９在基因编辑过程中具有序列特异性，
Ｍａｌｉ等［１５］
利用该系统分别对２９３Ｔ、Ｋ５６２和ｉＰＳ细胞靶基因
ＡＡＶＳ１进行了编辑，结果在不同细胞系中产生不同的打靶效率。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９最令人震惊的是可以同时编辑多个靶基因。
Ｗａｎｇ等［４］
在小鼠胚胎干细胞（
ＥＳ）中高效地实现了５个基因（Ｔｅｔ１，２，３，Ｓｒｙ，Ｕｔｙ
－８ａｌｌｅｌｅｓ）同时突变。此外，为了降低ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的脱靶效应，Ｋｉｍ等［１６］
将核蛋白重组Ｃａｓ９
核酸酶（ＲＮＰｓ）和ｓｇＲＮＡ应用在人类成纤维细胞和多能干细胞中，实现诱导位点特异性突变率高达７９％以上。
４．２ 在植物育种中的应用 植物提供给人类和动物食物，同时也是医学和化学药品的原材料，改良植物品种，提高其产量和疾病抵抗力已成为植物学研究者的目标，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统
已被引进到植物的育种领域。Ｆａｕｓｅｒ等［１７］
比较了ＣＲＩＳＰＲ
／Ｃａｓ９核酸酶和切口酶在拟南芥基因编辑中的效率，证明Ｃａｓ９切口酶适用于同源重组修复（ＨＲ），Ｃａｓ９核酸酶适用于非同源末端连接（ＮＨＥＪ），并用Ｃａｓ９核酸酶系统培育出ＡＤＨ１和
ＴＴ４基因突变的稳定遗传品种。Ｊｉａ等［１８］
利用改良Ｘｃｃ农杆
菌为载体将Ｃａｓ９和针对ＣｓＰＤＳ基因的ｓｇＲＮＡ导入甜桔，基因鉴定证明成功诱导其ＣｓＰＤＳ基因发成突变，
突变率约为３．２％～３．９％。Ｊｉａｎｇ等［１９］
将Ｃａｓ９、ｓｇ
ＲＮＡ和突变的ＧＦＰ基因导入拟南芥和烟草中，突变的ＧＦＰ基因经Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ切割、ＮＨＥＪ修复后表达出功能性ＧＦＰ蛋白；同理，在高粱胚胎中对突变的ＤｓＲＥＤ２基因进行了诱导修复，两周后在高粱幼苗中检测到有活性的ＤｓＲＥＤ２蛋白；此外，在水稻中应用Ｃａｓ９／ｓｇ
ＲＮＡ成功诱导其凋萎基因ＯｓＳＷＥＥＴ１４和ＯｓＳＷＥＥＴ１１发生突变。Ｘｕ等［２
０］
利用土壤杆菌属将３个针对不同除草剂抵抗基因的ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９转入水稻，基因型鉴定发现突变率约为２％～１６％，
表型分析表明等位基因突变株对除草剂敏感。此外，Ｓｈａｎ等［２１］
在小麦中也证实了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可以诱导
其基因发生突变。
４．３ 在动物模型构建中的应用 动物模型对生命科学研究和药物研发至关重要，为了高效率、短周期地构建动物模型，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统正逐步被应用在各种基因敲除、
敲入和诱导突变的动物模型构建中。Ｋｉｍｕｒａ等［２
２］
将分别打靶斑马鱼基因组和供体质粒的两个ｓｇＲＮＡ和Ｃａｓ９ｍＲＮＡ、供体质粒共注射斑马鱼受精卵，
在其幼虫基因组预期位点检测到供体质粒所携带的热休克蛋白（ｈｓｐ
７０）启动子及其调控的报告基因。Ｗａｎ等［２３］
将打靶抑癌基因（ｐ５３）的ｓｇ
ＲＮＡ和Ｃａｓ９ｍＲＮＡ注射食蟹猴胚胎中，获得了肝脏ｐ５３等位基因突变的食蟹猴，
开创了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统成功编辑猴基因组的先例。Ｐｌａｔｔ等［２
４］
首先建立了Ｃｒｅ依赖的Ｃａｓ９转基因小鼠，利用ＡＡＶ质粒递送ｓｇ
ＲＮＡ到该转基因小鼠肺脏，构建了条件性表达Ｋｒａｓ基因的肺癌小鼠模型。此外，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统也成功实现了果
蝇［２５］和大鼠［２６］的在体基因编辑。与ＺＦＮｓ和ＴＡＬＥＮｓ相比，
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统实现了在体同时编辑多个靶基因的目标。
Ｗａｎｇ等［４］
将Ｃ
ａｓ９ｍＲＮＡ和打靶小鼠基因Ｔｅｔ１和Ｔｅｔ２的ｓｇ
ＲＮＡ共注射小鼠受精卵，构建了两个基因同时突变的小鼠，有效率高达８０％。Ｅｄｖａｒｄｓｅｎ等［２７］
利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统同
时编辑大西洋鲑胚胎基因ｔｙｒ和ｓｌｃ４５ａ２，诱导突变率分别达２２％和４０％，首次实现了该系统对海洋冷水物种基因组的成功编辑。
４．４ 在分子靶向治疗中的潜力 基因缺陷和变异引起的遗传性疾病目前尚无有效的治疗方法，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统成为一种候选的遗传性疾病治疗工具。Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型肌营养不良症（ＤＭＤ）是一种由抗肌萎缩蛋白基因（Ｄｍｄ）突变引起的Ｘ－连锁
隐性遗传病，Ｌｏｎｇ等
［２８］
利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统纠正了ＤＭＤ小鼠模型中Ｄｍｄ突变基因，有效地阻止了ＤＭＤ小鼠的肌肉退化为，
为治疗ＤＭＤ带来了希望。遗传性酪氨酸血症是因富马酰乙酰乙酸盐水解酶基因（Ｆａｈ）突变而引起，Ｙｉｎ等［２
９］
用水动力转染编码Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ和修复模板的质粒到酪氨酸血症小鼠模型的肝脏中，大约在１／２５０的肝细胞中修复了Ｆａｈ突变基因，拯救出野生型Ｆａｈ蛋白。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统在治疗逆转录病毒和ＤＮＡ病毒感染引起的疾病中也表现出了一定的应用价值，甚至有望成为彻底根除病毒基因的有力工具。ＨＩＶ－
１基因的表达受ＴＬＲ因子的调控，Ｅｂｉｎａ等［３０］
将打靶ＴＬＲ基因的
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统转染到表达ＨＩＶ－１ＴＬＲ的Ｔ细胞中，通过切割和突变ＴＬＲ基因使其调控的ＨＩＶ－１表达下降。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ是治疗ＨＢＶ感染面临的主要障碍，只要ｃｃｃＤＮＡ存在，ＨＢＶ
ＤＮＡ就会始终会不断复制，与肝细胞共存亡，特异性地破坏ｃｃｃＤＮＡ成为治疗ＨＢＶ的新策略，Ｌｉｎ等［３１］
在Ｈｕｈ－
７细胞和小鼠模型中都证实了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统可以切割
ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ基因组；Ｓｅｅｇｅｒ等［３２］
在Ｈｅｐ
Ｇ２细胞中也证实了ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统能够突变和删除ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ，这为彻底根除ＨＢＶ提供了工具和可能。５ 结语
基因编辑技术在生命科学研究领域有着巨大的应用潜力。当前，基因测序技术已经比较完善，但是由于以往的基因编辑技术操作过程复杂、耗费昂贵，基因功能学研究进展缓慢，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的发现在一定程度上弥补了以往基因编辑技术的缺陷，该系统操作简单、成本低廉、编辑效率高，而且对实验室条件要求也比较低，目前该系统在生物科学研究众多领域的应用已初步证实了其具有广阔的应用前景，未来有望在临床疾病治疗中发挥重要作用。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统尽管被视为一种高效的基因编辑技术，但是也无法逃避基因编辑技术共有的缺陷—脱靶效应。目前科学家解决ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的脱靶效应主要有以下措施：①诱导ＨＮＨ（或ＲｕｖＣ－
ｌｉｋｅ）核酸酶结构域失活，产生单链切口·
３８２·中国病原生物学杂志
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２０１５年３月 第１０卷第３期
Ｍａｒｃｈ
２０１５，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３
酶活性的Ｃａｓ９蛋白［３３］
；②缩短ｓｇＲＮＡ序列的长度，提高其识别靶基因的特异性［３４］；③无活性的Ｃａｓ９蛋白与ＦｏｋⅠ内切核酸酶融合形成重组蛋白［
３５］
。相信通过以上措施的联合应用在不久的将来会改造出更加高效的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统，有效解决其脱靶效应，
至少可以使脱靶效应明显降低，为该系统的推广应用奠定基础。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统的推广应用，将加快基因具体功能和相互作用的研究，使基因缺陷和变异引起的遗传性疾病治愈成为可能。同时，也有望彻底根治病毒感染引起的疾病，这对生命科学和医学领域都将是历史性的变革。
【参考文献】
［１］ Ｓａｎｄｅｒ ＪＤ，Ｄａｈｌｂｏｒｇ
ＥＪ，Ｇｏｏｄｗｉｎ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｅｘｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｃｏ－ＤＡ）［Ｊ］．Ｎａｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８（１）：６７－９．［２］ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍ，Ｃｅｒｍａｋ Ｔ，Ｄｏｙｌｅ ＥＬ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ＤＮＡ ｄｏｕｂ－ｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｗｉｔｈ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，１８６（２）：５７－６１．
［３］ Ｇｉｌｂｅｒｔ ＬＡ，Ｌａｒｓｏｎ ＭＨ，Ｍｏｒｓｕｔ Ｌ，ｅｔ
ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２０１３，１５４（２）：４４２－５１．
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ｌｅｔｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆ０ｇｅｎ－ｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（９）：ｅ１０８６２２．［２８］ Ｌｏｎｇ Ｃ，ＭｃＡｎａｌｌｙ
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ｔｈｅＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｉｓｒｕｐｔ ｌａｔｅｎｔ ＨＩＶ－１ｐｒｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．ＳｃｉＲｅｐ
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ＨＣ，Ｋｕｏ ＹＴ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ｓｙｓｔｅｍｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ＨＢＶ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｉｎ ｖｉｒｏ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
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ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｂＢ Ｖｉｒｕｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２０１４（３）：ｅ２１６．［３３］ Ｒａｎ ＦＡ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｌｉｎ ＣＹ，ｅｔ ａｌ．Ｄｏｕｂｌｅ ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ
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ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕ－ｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ－ｏｌ，２０１４，３２（３）：２７９－８４．
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ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，３２（６）：５７７－８２．【收稿日期】 ２０１４－１２－０３ 【修回日期】 ２０１５－０２－
０９·
４８２·中国病原生物学杂志
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
２０１５年３月 第１０卷第３期
Ｍａｒｃｈ
２０１５，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．３
第9卷 第1期2007年3月 衡水学院学报 J o u r n a l o f H e n g s h u i U n i v e r s i t y V o l.9,N o.1 Ma r.2007植物功能基因组学及其研究技术 崔兴国 (衡水学院 生命科学系,河北 衡水053000) 摘 要:植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究.植物功能基因组学研究是利用结构基因组学积累的数据,从中得到有价值的信息,阐述D N A序列的功能,从而对所有基因如何行使其职能并控制各种生命现象的问题作出回答.近年来植物功能基因组学的研究技术主要包括表达序列标签、基因表达的系列分析、D N A微阵列和反向遗传学等.对植物功能基因组学的研究将有利于我们对基因功能的理解和对植物形状的定性改造和利用. 关键词:植物;功能基因组学;研究技术 中图分类号:Q3-3 文献标识码:A 文章编号:1673-2065(2007)01-0023-04 基因是细胞的遗传物质,决定细胞的生物学形状,细胞的生物学功能最终是由大量的基因表达完成的.随着人类基因组“工作框架图”的完成,生命科学研究的重点已经从结构基因组学转移到了功能基因组学的研究,特别是模式植物拟南芥(A r a b i d o p-s i s t h a l i a n a)和水稻(O r y z a s a t i v a)基因组测序的完成,公共数据库中已经积累了大量基因序列信息,获得了许多与植物发育相关的功能基因,在此基础上应用实验分析方法并结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能,并相应诞生和发展了一批新的研究技术,为功能基因组学的研究提供了必要而有效的技术支撑.功能基因组学研究的最终目标是解析所有基因的功能,即从基因水平上大规模批量鉴定基因的功能,进而全面研究控制植物生长发育及响应环境变化的遗传机制,在基因组序列与细胞学行为之间起到桥梁作用,共同承担起从整体水平上解析生命现象的重任. 1 植物功能基因组学研究 植物的生长和发育是一个有机体或有机体的一部分形态建成和功能按一定次序而进行的一系列生化代谢反应的总合,反应在分子水平上,它要求相应的遗传代谢途径必须按照特定的时空次序严格进行以保证正常发育.植物功能基因组研究就是要利用植物全基因组序列的信息,通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用;研究基因组的结构、组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系以及基因与基因间的调控关系;从表达时间、表达部位和表达水平3个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究.当前植物功能基因组学研究主要集中于一年生的拟南芥与水稻两个物种上,这主要是由于它们的遗传背景清楚,基因组较小,基因结构简单而且易于进行分子生物学操作.拟南芥研究组“2010计划”的宏伟目标是充分利用拟南芥基因组计划获得的序列信息并结合功能基因组研究技术来获知其25000个基因的全部功能,例如开花的诱导过程是植物生活周期中最奇妙的过程,目前从拟南芥中鉴定了提早开花和延迟开花的多种突变体,显示植物开花受多个遗传基因的控制,如延迟开花的两个突变体是由等位基因 C O(C O N S T A N S)和L D(C O L D L U M I N I D E P E N- D E N S)突变引起,这两个基因均已被克隆,并使其在转基因植物的叶片中进行表达,将C O基因转移到拟南芥中,高效表达C O蛋白的转基因植株即使处于短日照条件下也会开花,这说明C O基因具有激活开花基因的作用.对模式植物功能基因组的研究将有助于整个植物基因组学的研究. 目前的功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)c D N A全长克隆与测序;(2)获得D N A芯片 ①收稿日期:2006-10-12 作者简介:崔兴国(1963-),女,河北冀州市人,衡水学院生命科学系副教授.
基因组编辑技术的应用 基因编辑技术是指在基因组水平上对目的基因序列甚至是单个核苷酸进行替换、切除，增加或插入外源DNA序列的基因工程技术，经典的基因组编辑技术主要依赖于同源重组及干细胞全能性来完成对个体特定基因的改造。因为其在生物医学和工农业生产中发挥着重要作用，所以相关的早期开创性工作被授予2007 年诺贝尔生理医学奖。但是经典的方法存在效率低、技术要求高和成本高等缺点，严重制约了相关的研究和工农业生产。但是当2013年CRISPR-Cas9系统的诞生，使基因定位、精准修改变得更加容易，CRISPR文库的应用也让基础研究中大规模的基因组编辑和筛选成为现实。 基因定位和精准修改意味着该技术可以人为控制基因表达，目前CRISPR-Cas9基因编辑技术可被广泛地应用于动物模型构建、遗传疾病治疗、农业育种等方面。 动物模型构建 CRISPR-Cas9 系统作为最新一代基因编辑技术，能够简便高效地实现基因组精确修饰，是制备哺乳动物疾病模型的重要工具。目前科学家利用CRISPR-Cas9 技术在动物模型，如小鼠、大鼠、猪和猴等研制方面做出一系列重要工作。如科学家们将CRISPR-Cas9 系统导入小鼠受精卵，成功获得了有特定基因突变的小鼠模型，并获得近乎100% 的基因靶向突变效率，极大地降低了基因编辑小鼠模型制备的难度和成本，有望被广泛应用。 遗传疾病治疗及药物靶点筛选 作为一种简便高效的基因编辑技术，CRISPR-Cas9 技术自问世以来就被认为具有治疗遗传疾病的巨大潜力。科学家们选择小鼠白内障遗传疾病模型进行研究。对携带显性突变引发晶状体混浊的Crygc 基因进行定点修正。发现有1/3 的新生小鼠白内障症状被治愈，并通过生殖细胞将修复的Crygc基因传递到下一代，证明白内障遗传疾病得到了根治。CRISPR-Cas9技术更大的一项突破是CRISPR文库在药物靶点筛选中的应用。有科学家通过构建全基因组CRISPR文库，使全基因组中18000个基因形成缺失突变，结合相关的药物筛选手段最终对细胞进行筛选，最终对筛选存活的细胞进行NGS测序，即可推断出药物靶点相关基因。 农业育种 对于农业来说，基因编辑技术的兴起为培育新品种带来了更多的可能性。对于一些农作物来说，抗旱、抗虫、抗病等特性不再是遥不可及的梦想；对于另外一些作物，基因编辑技术能够使它们更好地适应消费者的需求。科学家利用CRISPR技术对双孢菇（一种常见的食用菇）进行了基因组编辑，培育出一种不会变褐的蘑菇。这样的蘑菇更宜于消费者储存，因此可以减少因蘑菇变色而带来的浪费。2016年4月，这种蘑菇成为了美国第一个被批准上市的基因编辑农产品。 CRISPR-Cas9作为一种新型的基因编辑技术，可以在不引入外源基因的情况下进行基因编辑，同时又能够精准的进行并在各个领域取得了一系列的成果，具有十分广阔的应用前景。 苏州泓迅科技利用独创的“GPS”（Genotype，Phenotype，Synotype）平台，提供基于CRISPR-Cas9 sgRNA文库的一站式基因功能筛选服务。
基因组学研究的应用前景摘要：基因组学是一门研究基因组的结构，功能及表达产物的学科，基因组的结构不仅是蛋白质，还有许多复杂功能的RNA,包括三个不同的亚领域，及结构基因组学，功能基因组学和比较基因组学。近几年，基因组学在微生物药物，细菌，病毒基因，营养基因方面都有进展，其前景是光明的。 关键词：基因研究未来结构 一、微生物药物产生菌功能基因组学研究进展 微生物药物是一类化学结构和生物活性多样的次级代谢产物，近年来多个产生菌基因组序列已经被测定完成，在此基础上开展的功能基因组研究方兴未艾，并在抗生素生物合成，形态分化，调控，发育与进化及此生代谢产物挖掘等方面有着新的发现，展现出广阔的研究前景，青霉素及其衍生的《》内酰胺类抗生素极大地改善了人类的卫生保健和生活质量，并促进研究人员不断对其工业生产菌株类黄青霉进行遗传改良和提高其产量，从而降低生产成本。经过60年的随机诱变筛选，当前青霉素产量至少提高了三个数量级，同时，青霉素的生物合成机理也得到了较为清晰的阐述，其pcbAB编码的非核糖体肽合酶ACVS~DPcbc编码的异青霉素N合成酶IPNS位于细胞质中，而苯乙酸COA连接酶PenDE编码的IPN酰基转移酶位于特殊细胞器一微体中。 研究发现，青霉素合成基因区域串联扩增，产黄青细霉胞中微体含量增加都可显著提高青霉素产量。然而随机诱变筛选得到的黄青霉工业菌株高产的分子机制尚不明确。为此，2008年荷兰研究人员联合国美国venter基因组研究所对黄青霉wisconsin54—1225进行了基因组测试和分析，并进一步利用DNA芯片技术研究了wisconsin54—1255及其高产菌株DS17690在培养基中是否添加侧链前体苯乙酸情况下的转录组变化，四组数据的比较分析发现，有2470个基因至少在其中一个条件下是差异表达的，根据更为严格的筛选标准，在PPA存在的条件下，高产菌相比测序菌株有307个基因转录是上调的，和生长代谢，青霉素前体合成及其初级代谢和转运等功能相关，另有271个基因显著下调，主要是与生长代谢及发育分化相关的功能基因。 二、乳酸菌基因组学的研究进展
基因组学的研究内容 结构基因组学： 基因定位；基因组作图；测定核苷酸序列 功能基因组学：又称后基因组学（postgenomics基因的识别、鉴定、克隆；基因结构、功能及其相互关系；基因表达调控的研究 蛋白质组学： 鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式 遗传图谱 （genetic map）采用遗传分析的方法将基因或其它dNA序列标定在染色体上构建连锁图。 遗传标记： 有可以识别的标记，才能确定目标的方位及彼此之间的相对位置。 构建遗传图谱 就是寻找基因组不同位置上的特征标记。包括： 形态标记； 细胞学标记； 生化标记；DNA 分子标记 所有的标记都必须具有多态性！所有多态性都是基因突变的结果！ 形态标记： 形态性状：株高、颜色、白化症等，又称表型标记。 数量少，很多突变是致死的，受环境、生育期等因素的影响 控制性状的其实是基因，所以形态标记实质上就是基因标记。
细胞学标记 明确显示遗传多态性的染色体结构特征和数量特征 ：染色体的核型、染色体的带型、染色 体的结构变异、染色体的数目变异。优点：不受环境影响。缺点：数量少、费力、费时、对生物体的生长发育不利 生化标记 又称蛋白质标记 就是利用蛋白质的多态性作为遗传标记。 如：同工酶、贮藏蛋白 优点： 数量较多，受环境影响小 ?
缺点： 受发育时间的影响、有组织特异性、只反映基因编码区的信息 DNA 分子标记： 简称分子标记以 DNA 序列的多态性作为遗传标记 优点： ? 不受时间和环境的限制 ? 遍布整个基因组，数量无限 ?
不影响性状表达 ? 自然存在的变异丰富，多态性好 ? 共显性，能鉴别纯合体和杂合体 限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ， RFLP ） DNA 序列能或不能被某一酶酶切，
基因编辑技术最新进展 人体内已命名的基因共有25000多条，目前已知一部分基因（3000）的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗，最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法（genetic therapies）。目前最广泛的遗传疗法手段为：1. 以病毒载体感染方式引导的源基因导入；2. 以RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。这些手段在治疗严重复合型免疫缺陷疾病（SCID）以及Wiskott-Aldrich综合征方面获得了成功。尽管如此，RNAi 技术在应用的广泛性上还存在局限。 基因编辑技术（genome editing technologies）是针对DNA本身进行的操作手段。最近应用型基因编辑领域的"鼻祖"，美国麻省理工学院张锋教授等人发表在《Nature Medicine》杂志上的一篇综述详细介绍了这些技术的原理以及在临床上的应用前景。 基因编辑技术的基本原理
归巢酶，ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9四种核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列，引起DNA双链断裂（DSB）。根据其识别方式的不同可以分为：蛋白质与DNA的识别与切割，包括归巢酶，ZFN，TALEN； RNA与DNA的识别与蛋白质介导的切割，即CRISPR/cas9。在特异性方面，归巢酶具有一个较大的DNA识别结构域，此结构同时负责DNA的切割；ZFN与TALEN是由多个酶亚基组成的复合体，分别具有特异性识别DNA的能力与 DNA内切活性。在应用方面，归巢酶及ZFN需要通过人工突变的方式构造切割不同DNA序列的工程酶，LALEN则需要复杂的分子克隆达到此目的。与之不同，在CRISPR/cas9系统中，可以通过简单的sgRNA的变化达到切割不同的基因片段的目的。切割完成后，目的位点会出现双链断裂（DSB）的结果并引起生物体的主动修复。NHDJ修复以另外一条未被切割的DNA链为模板，从而保证修复结果的准确。在反复不断地断裂-修复过程中，容易在切割位点造成插入或缺失突变，这样就达到了造成基因紊乱的目的。另外，研究人员利用HDR的修复机制可以人为制造想要得到的突变结果，从而达到基因修复的效果。 基因编辑疗法简介 基因编辑在疾病治疗方面的应用模式主要为：矫正/沉默有害突变，插入保护性突变，加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。对于突变引起的有害基因的活化，可以通过简单的沉默或敲除的方式达到治疗的目的，如亨廷顿氏舞蹈症（一种显性突变引起的家族性遗传病），但是对于突变引起的正常基因的失活，则需要通过HDR的方式对目的序列进行编辑，使其恢复到原有的健康状态，如泰萨氏病（一种隐性基因突变引起的遗传性疾病）。 基因编辑的效率 基因编辑的效率受到编辑方式，细胞类型，位点序列等多个因素的影响。总体上来讲，NHEJ要比HDR效率更高。对于我们更关心的HDR方式，主要受到4个因素的影响：1，修饰的本质，如改变的序列幅度；2，其识别特异性的干扰，如
Hans Journal of Biomedicine 生物医学, 2015, 5, 32-41 Published Online July 2015 in Hans. https://www.doczj.com/doc/8c1285658.html,/journal/hjbm https://www.doczj.com/doc/8c1285658.html,/10.12677/hjbm.2015.53005 Methods, Principles and Application of Gene Editing Yuchang Zhu1, Xiaojiang Zheng1, Yibing Hu2* 1School of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi Hubei 2College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing Jiangsu Email: *huyb@https://www.doczj.com/doc/8c1285658.html, Received: Jul. 1st, 2015; accepted: Jul. 24th, 2015; published: Jul. 27th, 2015 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.doczj.com/doc/8c1285658.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Fast development of gene editing technologies provides more powerful tools for gene function analysis. Now researchers can easily manipulate targeted gene with the Zinc Finger Nuclease (FZN), Transcription Activation Like Effector Nuclease (TALEN) and Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins (CRISPR) technologies emerged in the last dec-ade. These technologies revolutionized gene functional analysis and medical treatment. In this re-view, several typical gene editing technologies were listed, and their principles, characteristics and application were discussed. Keywords Gene Editing, Methods, Principles, Application 基因编辑技术的方法、原理及应用 朱玉昌1，郑小江1，胡一兵2* 1湖北民族学院生物科学与技术学院，湖北恩施 2南京农业大学资源与环境科学学院，江苏南京 Email: *huyb@https://www.doczj.com/doc/8c1285658.html, 收稿日期：2015年7月1日；录用日期：2015年7月24日；发布日期：2015年7月27日 *通讯作者。
植物功能基因组学研究技术的发展 摘要：随着植物基因组学的发展，植物研究的热点转向了功能基因组学。如何确定大量的基因序列的功能，并进而了解基因与基因之间通过其代谢产物而形成的控制生物体代谢和发育的调控网络是功能基因组学研究的核心问题。在植物功能基因组学研究中，多摒弃原来传统的技术而采用新发展的方法，既省力又节源的研究基因的功能。 关键词：功能基因组学；表达序列标签技术；代谢组学；RNA干扰 二十一世纪以来，基因组学在各种模式生物基因组测序的完成的基础上发展迅速。基因组学已经产生很多个分支，比如结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学等。其中，结构基因组学是基因组学发展的初级阶段，以建立生物的高分辨率遗传图和物理图为主。功能基因组学则代表基因组学发展的新阶段，是利用结构基因组学所提供的信息，发展和应用新的研究方法，从单一基因或蛋白质的研究转向多基因和多蛋白质的综合研究的一门学科，又被称为“后基因组学”。植物功能基因组学是植物后基因时代研究的核心内容，它强调发展和应用整体的实验方法分析基因组序列信息、阐明基因功能，其特点是采用高通量的实验方法结合大规模的数据统计计算方法进行研究。在植物功能基因组学的研究中，拟南芥和水稻是两种最常用的模式生物，近年来小麦的功能基因组学研究也在进行，主要集中于基因组中转录表达的部分。 1 植物功能基因组学中的分子标记 如何快速高效的从基因组中获取生物信息，是一个急迫并且有挑战性的课题。然而，表达序列标签（Express Sequence Tags，EST）的出现成为结构基因组学和功能基因组学连接重要依据。EST是从cDNA序列中获得的有特异性特征，能特指某个基因，它的发展成为功能基因组学发展的基础，Genbank中积累的大量EST序列不仅为新基因的发现提供帮助，而且为开发基于PCR的各种分子标记提供资源，如EST-SSR，CAPS，SNP，SRAP和TRAP等。截止2000年数据库dbEST中的主要信息统计如表1所示。
微生物基因组研究 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、 环保等诸多领域。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50％是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。 微生物间的相互作用机制也相当奥秘。例如健康人肠道中即有大量细菌存在，称正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。 随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在分子水平上研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学来说是一场革命。 以人类基因组计划为代表的生物体基因组研究成为整个生命科学研究的前沿，
基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN[创新技巧] 摘要： 最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。 在过去，如果你想在模式生物中进行复杂的基因组修饰，你几乎只能选择小鼠。 首先，你要设计一个打靶载体，将其引入小鼠胚胎干细胞，并将这些经过修饰的细胞注射到小鼠囊胚。接着是孕育、出生、筛选，等待所需的幼崽成长到性成熟，交配和杂交，之后是更多孕育、更多筛选，一直下去。 复杂的项目也许需要一年或更长时间才能完成。它几乎只对小鼠起作用。原因还不是很清楚，也许小鼠胚胎干细胞有着特别活跃的同源重组系统。大鼠和人类则不是这样。 不过好消息是，最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。大部分是在特定的位置引入双链DNA 断裂，然后由细胞进行修复。区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。 锌指核酸酶（ZFN） 第一个使用定制DNA核酸内切酶的基因组编辑策略就是锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFN）。 锌指蛋白是转录因子；每个指模块识别3-4个碱基的序列，将这些模块混合搭配，研究人员或多或少能靶定他们希望的任何序列。Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推出CompoZr ZFN试剂平台。 ZFN是异源二聚体，其中每个亚基含有一个锌指结构域和一个FokI核酸内切酶结构域。FokI 结构域必须二聚化才有活性，确保必须存在两个相邻的DNA结合事件才能实现双链断裂，从而增加了目标特异性。 切割事件使得大部分基因组编辑技术得以实现。在双链断裂后，细胞试图修复它。最简单的方法是非同源末端接合（NHEJ），其中细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，这往往产生移码。另一种方法是同源定向修复（HDR）。细胞试图利用另一条染色体上对应的DNA序列作为模板来修复断裂。通过提供自己的模板，用户可促使系统在不经意间插入所需的序列。 ZFN技术由Sangamo生物科学公司所拥有，被用来开发治疗产品。不过，对于科研方面的应用，Sangamo则授权给了Sigma-Aldrich。
微生物基因组研究：前景与目标 金奇 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生 物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不 在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、 环保等诸多领域。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50％ 是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾 病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。 在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感 染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致 病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株 发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间 可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大 流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设 计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核 感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有 益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医
药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选 出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广 泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑 料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一 些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等 普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现 的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的 微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。 微生物间的相互作用机制也相当奥秘。例如健康人肠道中即有大量细菌存在， 称正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存， 互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作 用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。 随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。 人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事 的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物 体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在分子水平上 研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学来说是一场革 命。
基因编辑技术学习总结 CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是在细菌中发现的适应性免疫反应系统，能有效抵抗噬菌体等对细菌造成的损伤。这项机制被应用于基因编辑，是当前生物学的研究热点。 一、基因编辑技术的发展 基因编辑技术的发展可追溯到1968年I型限制性内切酶的发现，它可以识别DNA并随即剪切DNA，但由于不具有特异性而不能得到应用；1970年后具有识别特异性的Ⅱ型限制性内切酶被发现；1981年一种Ⅱ型限制性内切酶，FokI 在黄杆菌中被分离出来，成为了基因研究的重要工具。 FokI不同于一般的Ⅱ限制性内切酶（识别和剪切利用同一结构域，因而难以在保证剪切活性的条件下改变识别域），FokI的含有两个相对独立的结构域，N端为识别域，C端为剪切域；这种特性使得FokI可以通过对识别域的改造对DNA进行定点切割。在这种理论的基础上，发展出了ZFN——锌指核酸酶，TALEN ——转录激活样效应蛋白核酸酶；两种技术都是通过使能够识别DNA序列的蛋白与FokI相连实现基因的特异性切割，其不同在于锌指结构域通过约30个氨基酸对DNA三联体进行识别，而转录激活效应蛋白则是通过34个氨基酸组成的识别单体对不同核苷酸进行识别，因而TALEN的识别效率显著高于ZFN。然而它们都是利用利用蛋白进行DNA识别，并使用相同的剪切蛋白－FokI形成二聚体进行DNA剪切。 CRISPR的不同之处在于它利用RNA进行DNA识别，其识别效率优势显而易见；此外CRISPR技术不需要对识别域和限制性内切酶剪切域进行连接，因而设计简单，编辑高效。 CRISPR技术起源于1987年日本在细菌DNA中发现“重复－居间（spacer）－重复序列”，2002年命名为成簇规律性间隔短回文重复（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）并预测改基因序列与细菌获得性免疫有关，2007年其免疫功能得到证实，并最终于2012年成功运用于基因编辑。 蛋白质、RNA介导的DNA编辑技术都已取得成功。2014年，单链DNA引导的具有核酸内切酶活性的TtAgo蛋白在嗜热菌中被发现。这种DNA指导核酸内切酶是否可以应用于基因编辑技术，韩春雨团队发表文章，利用NgAgo蛋白实现了格DNA引导的基因组编辑，但其实验结果目前依然存在争议。
（生物科技行业）第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学
第八章分子生物学常用技术的原理及其应用及人类基因组学 测试题 一、名词解释 1．分子杂交 2．Southernblotting 3．Northernblotting 4．Westernblotting 5．dotblotting 6．DNA芯片技术 7．PCR 8．功能性克隆 9．转基因技术 二、填空题 1．Southernblotting用于研究、Northernblotting用于研究，Westernblotting用于研究。 2．PCR的基本反应步骤包括、和三步。 3.在PCR反应体系中，除了DNA模板外，还需加入、、和。 4．Sange法测序的基本步骤包括、、和。 5．目前克隆致病相关基因的主要策略有、、。 6．血友病第Ⅷ因子基因的首次克隆成功所采用的克隆策略是，而DMD致病基因的克隆所采用的克隆策略是。 三、选择题 A型题 1.经电泳分离后将RNA转移到硝酸纤维素(NC)膜上的技术是： A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 2.不经电泳分离直接将样品点在NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Dotblotting E．insituhybridization 3.经电泳分离后将蛋白质转移到NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB.Northernblotting C．WesternblottingD．dotblotting E．insituhybridization 4.经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是 A．SouthernblottingB．Northernblotting C．WesternblottingD．Easternblotting E．insituhybridization
9.1人类基因组计划简介 人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。与曼哈顿原子弹计划和阿波罗登月计划并称为三大科学计划。 1986年,诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco发表短文《肿瘤研究的转折点：人类基因组测序》（Science, 231: 1055－1056）。文中指出：如果我们想更多地了解肿瘤，我们从现在起必须关注细胞的基因组。…… 从哪个物种着手努力？如果我们想理解人类肿瘤，那就应从人类开始。……人类肿瘤研究将因对 DNA 的详细知识而得到巨大推动。” 什么是基因组(Genome)?基因组就是一个物种中所有基因的整体组成。人类基因组有两层意义：遗传信息和遗传物质。要揭开生命的奥秘，就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。
为什么选择人类的基因组进行研究？因为人类是在“进化”历程上最高级的生物，对它的研究有助于认识自身、掌握生老病死规律、疾病的诊断和治疗、了解生命的起源。 在人类基因组计划中，还包括对五种生物基因组的研究：大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇和小鼠，称之为人类的五种“模式生物”。 HGP的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。 HGP的诞生和启动： 对人类基因组的研究在70年代已具有一定的雏形，在80年代在许多国家已形成一定规模。 1984年在Utah州的Alta,White R and Mendelsonhn M受美国能源部(DOE）的委托主持召开了一个小型专业会议讨论测定人类整个基因组的DNA序列的意义和前景（Cook Deegan RM,1989） 1985年5月在加州Santa Cruz由美国DOE的Sinsheimer RL主持的会议上提出了测定人类基因组全序列的动议，形成了美国能源部的“人类基因组计划”草案。 1986年3月，在新墨西哥州的Santa Fe讨论了这一计划的可行性，随后DOE 宣布实施这一计划。 1986年遗传学家McKusick V提出从整个基因组的层次研究遗传的科学称为“基因组学” 1987年初，美国能源部和国立卫生研究院为HGP下拨了启动经费约550万美元（全年1.66亿美元） 1988年，美国成立了“国家人类基因组研究中心”由Watson J出任第一任主任
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
现代农业研究 近年来，农作物转基因技术得到了快速发展，将基因编辑技术应用在农作物育种上，能得到多个新的生物品种，尤其在玉米、大豆、棉花等农作物上有着较好应用。转基因技术的应用，一定程度推动了农业领域发展，但是还存在一定安全问题，要想充分利用作物转基因技术，还要注重基因编辑农作物的管理和检测，以便能发挥基因编辑技术在研发新品种上的作用，尽可能提高农作物营养价值。 1基因编辑技术在农作物领域的应用 1.1ZFN 技术 ZFN 主要负责识别和结合特定的核苷酸序列，将ZFN 技术应用到作物育种中，可对植物基因进行重新编辑。锌指核酸酶由锌脂蛋白和核酸酶结构域组成，其中核酸酶结构域对切割点不具有识别特异性，只有在二聚体情况下可使其具备酶活性。因此，需要对任一靶位点设置一对ZFN，以便形成核酸酶二聚体，从而进行DNA 链的切割。有研究学者采用该技术，替换掉烟草中乙酰乳酸酶基因的三个核苷酸点，进而得到抗除草剂的作物[1]。另外，将ZFN 技术应用在玉米作物 中，能合成磷酸酶基因，使得玉米具有抗除草剂性能，同时还能减少玉米中的肌醇六磷酸含量，提高了作物营养品质。尽管当前ZFN 技术在多种植物中取得较好运用，但是由于锌指单元对切割点识别性不高，因此在不同基因改造上的识别差异较大，限制了该技术的广泛使用。 1.2TALEN 技术 该技术是一种基于核苷酸的编辑技术，是由核酸内切酶和DNA 结构域共同组成的，其中DNA 结构域主要是由多个氨基酸序列构成的，重复序列能识别相应的碱基。TALEN 技术运用原理为：结合靶位点两端的序列设置一对TALEN，与识别位点结合后，两个核酸内切酶结合起到形成二聚体，在切割DNA 链后可完成基因编辑。有学者将该技术运用到水稻中，破坏了细菌性病原菌效应蛋白在作物基因组上的位点，进而提高了水稻抗百叶枯病。另外，在这一技术作用下，还能破坏水稻甜菜碱乙醛脱氢酶结合位点，能起到提高水稻品质的作用。而将该转基因技术运用到小麦育种中，能得到抗性较强的小麦，相对于传统育种技术来讲有 浅谈基因编辑技术在农作物领域中的 应用与问题探究 （威海海洋职业学院 264300） 【摘要】随着ZFN 、CPISPR/Cas9等基因编辑技术的发展和运用，大量基因编辑作物生产出来，这种背景下，基因编辑作物的检测及安全成为重点研究问题。本文主要围绕基因编辑技术在农作物领域的应用、针对基因编辑农作物的安全评价监管、基因编辑农作物的检测等方面展开讨论，具体分析了基因编辑技术在农业领域的应用现状，并以保障农作物食用安全为主，加强基因编辑作物有关问题的研究，促进农业领域良好发展。【关键词】基因编辑技术；农作物领域；应用分析 邹丹丹 Discussion on the Application and the Problem of the Gene Editing Technology in the Field of Crop Zou Dandan [Abstract]With the development and application of gene editing technology such as ZFN,CPISPR/Cas9,a large number of gene editing crops have been produced.Under this background,the detection and safe?ty of gene editing crops has become a key research issue.In this paper,the application of gene editing technology in agriculture was analyzed in detail,and the main purpose was to ensure the food safety of crops,to strengthen the research on related problems of gene editing crops,and to promote the good de?velopment of agricultural field. [Keywords]gene editing technology;crop field;application analysis （Weihai Marine V ocational College 264300） 农业经济