中国农业科学 2007,40(10):2355-2360 Scientia Agricultura Sinica
收稿日期：2006-02-28；接受日期：2007-01-16
基金项目：国家转基因专项（JY04-A-01）和河北师范大学博士基金项目（L2005B20） 作者简介：赵宝存（1971-），女，河北大城人，副教授，博士，研究方向为植物分子生物学。通讯作者黄占景（1957-），男，教授，研究方向为植物
分子生物学。Tel ：0311-********；Fax ：0311-********；E-mail ：huangzhanjing@https://www.doczj.com/doc/87790907.html,
利用基因芯片研究小麦耐盐突变体盐胁迫条件下
基因的表达图谱
赵宝存，赵 芊，葛荣朝，沈银柱，黄占景
（河北师范大学生命科学学院，石家庄 050016）
摘要：【目的】研究小麦在不同盐胁迫时间下根部基因的应答反应。【方法】利用基因芯片技术，分析盐胁迫下耐盐小麦RH8706－49的小麦根部基因的表达情况。【结果】获得了61 215个小麦基因的差异表达图谱。在不同盐胁迫时间下大量根部基因的表达发生很大变化，即有盐诱导表达的基因，也有盐抑制表达的基因，同时对杂交数据进行多种聚类分析，并对基因表达差异的原因进行了初步分析。【结论】小麦耐盐机理非常复杂，是大量基因协调表达的结果，其中盐诱导表达基因的作用非常重要。
关键词：基因芯片；小麦；耐盐基因；盐胁迫；盐诱导基因
Study on the Expression Profile of Salt-Tolerance Mutant Under
Salt-Stress in Wheat Using Gene Microarray
ZHAO Bao-cun, ZHAO Qian, GE Rong-chao, SHEN Yin-zhu, HUANG Zhan-jing
(College of Life Science , Hebei Normal University , Shijiazhuang 050016)
Abstract : 【Objective 】The objective of this experiment is to study the reactions of different genes of root to salt-stress in wheat. 【Method 】The expression of genes in root of wheat was studied by using gene chip technology. 【Result 】 The expression of all genes in root of wheat salt-tolerance mutant RH8706-49 were analyzed using gene chip technology. The responses to different times of salt stress were studied. The differential expression profile of 61215 genes was gained. The clustering analysis of hybridization data showed that gene expression changed greatly in root under salt stress. Both salt-induced genes and salt-inhibited genes were found.【Conclusion 】The mechanism of salt-tolerance in wheat is very complicated and it is the result of a lot of genes expression in line. The function of the salt-induced genes is very important.
Key words : Gene chip; Wheat; Salt stress; Salt-tolerance gene; Salt-induced gene
0 引言
【研究意义】盐害是作物生长的一大危害因素。植物受到盐胁迫后，一部分基因的表达量增加，协同完成对胁迫的应答，这一类基因称作盐诱导基因（salt induced gene ）。对盐诱导基因的研究和克隆是研究耐盐基因起决定性作用的策略之一。【前人研究进展】对于耐盐植物在盐胁迫下相白质基因[1~4]。在水稻方面，盐胁迫应答基因已经关基因的克隆取得了一些进展，例如在烟草、棉花及高梁等作物中分离、克隆了与渗透调节有关的蛋克隆并定位[5]。在小麦方面，也
克隆了耐盐相关基因[6]，但是，耐盐是一个数量性状，相关基因非常多，常规的克隆方法效率不是很高。【本研究切入点】cDNA 微阵列(cDNA microarrays)技术可以高敏感度地定量、定性检测基因表达水平，既可以同时比较不同样品基因表达水平的差异，也能够提供某一基因或一群基因的表达模式与其他基因表达模式相互间关联的信息。自1992年Affymetrix 公司首次合成第一块基因芯片（gene chip ）以来，cDNA 微阵列在抗性基因筛选方面有广泛应用。Shiniji K 等[7]，孙亮先等[8]，Philippe R 等[9]，Narusaka Y 等[10]分别利用cDNA 微阵列研究了不同植物的抗性基因，获得了
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大量数据，对抗逆性的研究有非常重要的意义。目前，利用cDNA微阵列研究小麦耐盐相关基因的表达情况的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究中，利用cDNA微阵列技术，对盐胁迫下的耐盐小麦的根部基因的表达情况进行研究，寻找敏盐基因和耐盐相关基因，为进一步克隆耐盐基因奠定基础，对利用基因工程的方法培育耐盐小麦及研究耐盐机理有非常重要的意义。同时，从分子水平整体检测萌发期幼苗根部基因表达情况，有助于更好地理解盐胁迫过程中所发生的各种生理变化，从而为研究作物耐盐机理打下良好基础。
1 材料与方法
1.1 材料
小麦耐盐突变体RH8706-49水培，至二叶一心时用含0.8% NaCl的1/2 Hoagland溶液处理，分别取胁迫时间为0（对照）、1、6、12和72 h的根为试验材料，保存于-70℃备用。
1.2 基因芯片
Affymetrix公司的小麦基因组芯片（Wheat Genome Array，P/N: 520254），包括61 215基因或EST的原位合成探针，详见该公司网站https://www.doczj.com/doc/87790907.html,。
1.3 RNA抽提和探针合成
利用TRIzol（Invitrogen）方法抽提各材料的总RNA，并采用RNeasy Mini kit（Qiagen）纯化总RNA。利用one-cycle cDNA Synthesis Kit（Affymetrix）合成dscDNA，该cDNA纯化由GeneChip Sample Cleanup Module（Affymetrix）来完成。纯化的cDNA可以根部据GeneChip IVT Labeling Kit的实验说明制备生物素标记的cRNA。生物素标记的cRNA于94℃保温35 min进行片段化。片段化的cRNA即为杂交用的探针。
1.4 芯片杂交及数据分析
首先，应用检测芯片（test chip）检测片段化cRNA 的质量。之后取适量cRNA与实验芯片（experimental chip）杂交，按照实验流程进行洗涤，扫描后，用Affymetrix Microarray Suite 5.0软件对杂交图像进行分析，并对数据均一化。根据杂交信号，将基因分为表达（present，P），模糊表达（marginal，M）和缺失（absent，A）3种情况。之后对两张芯片的杂交数据进行比较，以盐胁迫0 h的材料为参照衡量其他胁迫时间下根中基因表达变化的比值（ratio），比值>2为基因表达明显上调，比值<0.5为基因表达明显下调。另外，采用聚类分析软件对数据进一步分析。2 结果与分析
2.1 不同盐胁迫时间的根部基因的表达差异分析
对不同芯片杂交后的图像进行分析，将各试验组与对照组的信号强度进行对比，再分别将各试验组相比较，二者相差大于2.0倍以上为高表达的基因；而低于50%以下为低表达的基因。介于两者之间者为没有表达差异的基因。对各盐处理的根部cDNA的基因芯片杂交结果分别进行数据处理，对两两处理之间的数据进行比较分析，结果如散点图1。散点图中点的位置用来表示基因表达水平（信号强度）。由图1可知，任何两个处理之间都有一定数量的基因存在表达差异（图中偏离45°中线的点），其中既有上调表达的基因，又有下调表达的基因。
2.2 聚类分析
利用Affymetrix Microarray Suite 5.0软件对试验数据进行均一化，均一化的杂交信号强度比值进入成簇分析软件包进一步分析。笔者选用Cluster and Tree View软件（详见https://www.doczj.com/doc/87790907.html,）对数据进行了3种聚类分析，包括等级聚类（Hierarchical clustering），自组织映射聚类（self organizing map）和组成性分析聚类（principle component analysis），用来找出基因表达行为的相似性，以及分析基因之间的调控关系。
2.2.1等级聚类利用等级聚类方法得到了成簇分析的聚类图，建立了表达图谱（图2）。由图可知，相同基因在不同处理之间以及处理和对照之间的表达量存在很大的变化，随着盐胁迫时间的延长，不同基因表达量的变化趋势不同。
2.2.2基因表达谱的PCA分析由于散点图和聚类分析分类量很大，试图应用PCA分析将其减少。对在盐胁迫处理条件下表达发生变化的基因进行PCA聚类分析，结果如图3。PCA分析表明，根部据盐胁迫时发生变化的根部基因在不同时间点的变化情况进行分类，将其分为5类。最显著的变化成分是在盐胁迫1 h时出现了峰值，而且表达强度最大，在1 h之后表达量逐渐降低（图3，红色），该基因很可能是一些应激反应的分子和信号分子。第二类变化显著的基因是在盐胁迫后显著降低，而后表达量又缓慢回升，该类基因应该是典型的盐抑制基因（图3，黄色）。其它3类基因变化相对平稳，而且在盐胁迫前和胁迫后72 h时表达量基本持平，其变化可能是盐胁迫的影响导致，与耐盐关系不会很大。
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横坐标和纵坐标均表示不同盐处理时间的基因的表达水平（信号强度）
Both abscissa and ordinate show the express level of genes (intensity of the signal) in different time of salt-stress
图1 在不同盐胁迫条件下的小麦根部61 215 个基因表达情况比较的散点图
Fig. 1 The plot is about the expression change of 61 215 genes of the root under salt-stress in different time in wheat
2.2.3 基因表达谱的SOM 聚类 为了弄清楚基因表达改变上升的组分，划分为在不同时间点出现峰值的模式来进行SOM 聚类。这些基因群通过选择基因鉴定表达模式。SOM 聚类分析将2 652个表达量发生变化的基因进行了聚类，将其分为16类，其变化趋势及所含基因数见图4，每类为一个折线图，图上面的数据分别表示聚类号、该类中的基因数。从图中可以看出，基因在受到盐胁迫后不同基因的表达量出现不同的变化，在各个阶段都有上调表达的基因，也有下调表达的基因。可见，盐胁迫对基因的表达量存在明显的影响。
2.3 盐胁迫下RH8706-49小麦的根基因表达谱
杂交芯片上总探针位点是61 215，杂交数据表明，相对于对照，在不同的时间点，小麦根部的基因表达
约20%出现表达差异，而且不同胁迫时间下表达的基因比例不同，基因表达情况见表1。其中，与对照相比，盐胁迫1 h 的材料中，5.6%基因上调表达，12.4%基因下调表达，80.9%没有变化；盐胁迫6 h 的材料中，6.8%基因上调表达，9.6%基因下调表达，82.7%没有变化；盐胁迫12 h 的材料中，6.3%基因上调表达，10.1%基因下调表达，82.6%没有变化；盐胁迫72 h 的材料中，7.5%基因上调表达，11.2%基因下调表达，80%没有变化（表1）。对各处理材料的表达基因进行比较，不同胁迫时间的根部基因中有变化的基因总量一般小于20%，有80%以上的基因表达量没有改变，据表达量的变化可以将基因分为上调基因和下调的基因两种。这些表达量有改变的基因很可能与耐盐有密切的关系。
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A 是盐胁迫0、1、6、12和72 h 下部分小麦根部基因的差异表达图谱；
B 是标尺。红色表示表达水平高，蓝色表示表达水平低。各样品之间同一水平线上的基因为同一类基因。树状图（左图）表示各个基因变化趋势的相近程度，连接的线越短，越相近
A is The different expression profile of a part of genes of the root under 0h, 1h, 6h, 12h and 72h salt-stress in wheat;
B is marker. Red shows high expression level, Blue shows low expression level. The genes in the horizontal line show the same gene in different sample. Hierarchical map (left map) shows the similarity of gene change tendency. The shorter the line is, the more similar the genes are
图2 盐胁迫下部分小麦根部基因的表达谱图
Fig. 2 The expression profile of a part of genes of the root under salt-stress in wheat
所有变化基因可以分为5类，每一条线代表一类变化趋势相同的基因
All genes whose expression level changed under salt-stress were divided to five clusters, each line presents a cluster genes which change tendency is the similarity
图3 盐胁迫条件下表达量有变化的基因的PCA 聚类分析
Fig. 3 PCA clustering analysis of genes whose expression level changed under salt-stress
表1 不同盐胁迫时间下小麦根部基因的表达变化情况
Table 1 The expression thing of all genes of the root in salt-stress in wheat
表达基因比例 The proportion of expression genes (%) 盐胁迫时间 (h) Salt-stress time
上调Up-regulation
无变化No change
下调Down-regulation
模糊Illegibility
1 5.6 80.9 12.4 1.1
6 6.8 82.
7 9.6 0.9
12 6.3 82.6 10.1 1.0
72 7.5 80.0 11.2 1.3
由于小麦基因组庞大，基因变化复杂，变化趋势不是很明显。但是，从表1可以看出，盐处理1 h
时下调表达的基因比例大于上调表达的基因，而在6、12和72 h 时则上调表达的基因比例大于下调表
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达的基因，表明处理前期激活了大量起始因子，开启了大量不同的基因，使后期基因表达增加。尤其是72 h时，上调表达基因显著增加。植物已经进化了许多应对生物及非生物胁迫的机制。控制控制胁迫应答的一个重要的步骤就是转录激活和基因抑制。许多基因被胁迫诱导表达，包括那些编码转录因子的基因，都已经被鉴定。而且其中有一些已经表明对于耐盐是必要的。在拟南芥的表达图谱中，转录因子基因很明显参与了非特异性和特异性胁迫应答[11]。试验表明，在胁迫后期被激活表达的基因往往是早期胁迫处理中上调表达的转录因子的受体或靶蛋白[12]。这些靶基因的高效表达提高了植物对盐的耐受性。
2.4 功能基因群的表达改变
盐胁迫下RH8706-49的根部的转录本与对照转录本的比较可以用来鉴定该品系的耐受能力。收集这些信息最直接的方法是从对照和胁迫情况下的植株中收集代表性转录本，将其与公共数据库中的序列做比较。由于目前小麦基因组功能基因的数据还远远不够，所以目前功能分类有待进一步研究。
SOM聚类分析结果将表达差异基因分为16类，每个图谱上面的数据分别表示聚类号及每类中的基因数。横坐标为盐处理的时间，纵坐标表示基因的表达水平（信号强度）
All genes whose expression level changed under salt-stress were divided into 16 clusters in SOM analysis, the number in the map show the number of clustering and the number of gene in the cluster. Abscissa shows the time of salt-stress (0.8% NaCl) and ordinate shows the expression level of genes (intensity of the signal)
图4 SOM聚类分析图
Fig. 4 The profile of SOM clustering analysis
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3 讨论
Affymetrix公司采用独特的PM-MM探针对设计，以获得在复杂样品背景中检测的高灵敏度和特异性之间的优化平衡。对芯片上所有探针的杂交结果进行综合判断形成一整套数据，可以最大限度地提高在一张芯片上检测基因的数量。对某一基因序列进行冗余取样设计多对探针来检测样品，所获得的数据翔实可靠，与GeneChip TM分析平台整合可获得可靠、重复性好的分析结果，从而建立有效的高通量基因表达分析的数据库[12,13]。同时，在芯片杂交过程中采用严格质控方法，使数据更加可靠。为了验证芯片结果，通过与本室研究过的基因的Northern杂交结果进行比较，发现二者的结果相符（数据未列出）。
总之，笔者鉴定了根部在盐胁迫下出现表达差异的大量基因，根据表达情况对这些基因进行分类。这些基因的上调和下调表达可能和植物的耐盐密切相关。这些基因在盐胁迫应答和耐盐反应中的作用还需要利用其他方法进行验证。另外，检测结果中只有约50%的基因检测到表达，推测那些沉默基因可能是在某个阶段特异表达的，或者是在所研究的样品中mRNA水平较低或数量少造成的。可见，小麦耐盐机制非常复杂，还需要进一步实验来对其进行研究，最终揭示耐盐机理。
4 结论
本文利用基因芯片技术分析了盐胁迫下耐盐小麦RH8706-49的根部基因的表达情况。获得了61 215个小麦基因的差异表达图谱并对其进行多种聚类分析。结果表明，小麦RH8706-49在不同胁迫时间下根部基因中有80%以上的基因表达量没有改变，表达变化的基因一般小于20%，据表达量的变化可以将基因分为上调基因和下调的基因两种。这些表达量有改变的基因很可能与耐盐有密切的关系。
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（责任编辑孙雷心）