主讲：胡银岗
西北农林科技大学农学院植物科学系
），最初由孟德尔提出
给予生命”
丹麦生物学家约翰生根据希腊文““给予生命
丹麦生物学家约翰生根据希腊文
遗传因子””。
“遗传因子
代替孟德尔的
代替孟德尔的“
美国遗传学家摩尔根通过果蝇试验，，
美国遗传学家摩尔根通过果蝇试验传的染色体理论（chromosomal theory of inheritance）。
揭示了在染色体载体上基因是按线性顺序排列的。。科学界普遍揭示了在染色体载体上基因是按线性顺序排列的
。
地接受了孟德尔的基因学说
地接受了孟德尔的基因学说。
通过细菌转化证明基因的载体是
年，A.D.Hershey利用双同位素标记的噬菌体感染大肠杆菌细胞，验证了Avery的结
J.Watson))和克里克(F. Crick)揭示了DNA 年，华生((((J.Watson
分子的双螺旋模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题。
应该指出：生物界并非所有的基因都是由DNA构成的，某些动物病毒、植物病毒以及某些噬菌体等，它们的遗传物质基础是RNA而不是DNA。
因并是交换和突变的最小单位，，基因内部也有不同的功能
”（cistron），一个顺反子
编码一条完整的多肽链。
。由许多可
编码一条完整的多肽链
位点之间可以发生交换。。
位点之间可以发生交换
线性排列的。并非所有的DNA序
外显子（（Exon），
，称为外显子
其中有基因的编码区，
列都是基因，，其中有基因的编码区
内含子（（Intron）。
编码区的其余部分称之为内含子
从细菌到高等生物的全部生命有机体的基因都是由DNA构
的基本结构都是一致的，，不同生物的所有生物DNA的基本结构都是一致的
可以融为一体
可以融为一体。。
是基因工程的一个重要理论基础。。
共性，是基因工程的一个重要理论基础
及蛋白质分子的
蓝图””。
及蛋白质分子的““蓝图
红色面包霉的研究揭示““一种基因一种酶”
红色面包霉的研究揭示
one enzyme）
镰形细胞贫血症的血红蛋白和正常的血红蛋白
证实了基因同蛋白质之间的直
蛋白质，，由多种基因编码
由多种基因编码。。异型多体（（heteromultimer）蛋白质
一种基因一种多肽链”（one gene to one polypeptide 以更加准确地反映出基因的本质。。
以更加准确地反映出基因的本质
为完整的图解模式（（图1-2）。为完整的图解模式
所有64种遗传密码
遗传信息传递和遗传密码的
是基因工程的又一个
真核细胞表达的调控，比原核细胞要复杂得多，至今还没有较为系统而又为实验所证实的理论。
首次成功地分离到了大肠杆菌乳糖操
半乳糖苷酶基因。。
建立一种可以将待分离的目的基因分离出来，建立一种可以将待分离的目的基因分离出来
进行体外无性扩增的体系，，如建立相应的基因进行体外无性扩增的体系
组文库，，或cDNA表达文库等
如分子探针。。检测和鉴定目的基因的技术体系，，如分子探针检测和鉴定目的基因的技术体系
技术的运用。。
技术的运用
首次报道了酵母丙氨酸转移核糖核个碱基对）的全合成。
年又报道了大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因的全合
将化学合成的人脑激素（生长激
素释放抑制因子）的基因，连接在乳糖操纵子上，并导入大肠杆菌。第一个以DNA重组技术完成的基因工程，也
是人类首次成功地将一种高等真核生物的基因移入原核生物的细胞内，并能转录、转译，产生有生物活性的蛋白质。
DNA的双螺旋结构和半保留复制（三）遗传信息的传递方式—中心法则
在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制
Boyer实验室又发现了核酸内切为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNA片段连接到一
分子上。
（三）大肠杆菌转化体系的建立
60年代，琼脂糖凝胶电泳和Southern印迹技术建立，并应用于基因工程。
人胰岛素,,世界上第一种基因工
人胰岛素
重组人胰岛素在英、美第一个基因工程药物----重组人胰岛素在英、美
第一批转基因家畜（兔、猪和羊))
1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊
基因工程西红柿在美国上市
1993 基因工程西红柿在美国上市
英国罗斯林研究所,,多莉羊
1997 英国罗斯林研究所
中国获准加入人类基因组计划. .
1999.9 中国获准加入人类基因组计划
科学家公布人类基因组工作草图
2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图
2000.6.26
公布人类基因组基本信息
2001.2.11 公布人类基因组基本信息
2001.2.11
生物技术：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程
质粒的发现与运用，天然的植物基
年，科学家发明了基因枪
年美国和法国同时对抗除草剂转基因烟草进行了年中国首先在大田种植转基因抗病毒烟草，揭开
了全球转基因作物商业化的序幕。
年，第一个转基因植物产品—延熟保鲜转基因番Flavor Savor”获得美国农业部（USDA）和美国食品与药物管理局（FDA）批准，进入市场。
我国继美国之后独立自主地研究出Bt抗虫棉，并在生产上大面积推广应用。
（一）基因工程与植物基因工程
(genetic engineering) ，DNA重组（DNA
molecular cloning ），基因操作
基因工程是指在体外用人工方法将不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行切割、拼接，然后按照人们的意愿重新组合成重组体，再将重组体放回到宿主细胞进行整合，使其携带的遗传信息在新宿主细胞或个体中高效表达，最终获得基因
遗传工程体或遗传改良生物（genetically modified organism，，转基因植物（transgenic plant或genetically modified
GMP），转基因作物（transgenic crop或genetically modified crop，GMC）
植物基因工程的概念和特点
（二）植物基因工程的特点
：基因工程强调外源DNA分子的新组合被引入到一种新的宿主生物中，并稳定遗传和定向改造生物：基因工程则深入到细胞水平，亚细胞水平（包括细胞核、细胞器），特别是基因水平来改造生物的本性。
遗传物质的跨物种转移：基因工程打破了种与种之间的杂交障碍，扩大了遗传物质重组的范围。
目的基因的功能验证及表达载体构建表达载体构建
（三）目的基因导入目标植物—转化
质粒等载体介导法
直接导入法
植物种质系统导入法
（四）转基因植物的筛选、鉴定与利用直接选择法
间接选择法
第一个转基因植物产品—延熟保鲜转基因番茄
进入市场。。
进入市场
各国正式批准的各类转基因植物达127个
个品种。。
），仅美国和加拿大就超过90个品种
据不完全统计
据不完全统计，，我国正在研究和开发的转基因植物约50
余种。。
涉及各类基因100余种
在1996－2001年的短短6年间，全球转基因农作物商业化种植面积增建了30多倍。
连接产物 ●重组分子 ●未连接的载体分子 ●未连接的D N A片段 ●载体的自连 ●含有错误插入片段的重组D N A分子 1转化—细菌吸收D N A的方式 自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。 细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。 1.1大肠杆菌感受态的制备 ●感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 1.1大肠杆菌感受态的制备 ●在冷的盐溶液中转化效率提高。一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。 –原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。 ●42°C热激处理。 1.2筛选转化细胞 1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。 1.3其他的转化方法 ●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法） ●接合转化 ●微注射法 ●λ噬菌体的转染 ●P E G介导的细菌原生质体转化 1.3其他的转化方法 ●电激转化 –受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。 –可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。 1.3其他的转化方法 ●接合转化 –是由接合型质粒完成的。 –涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。
–重组质粒和接合质粒必须有相容性。 1.3其他的转化方法 ●P E G介导的细菌原生质体转化 –高渗溶液中细菌培养至对数生长期 –溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。 –加入D N A样品和聚乙二醇等渗液 –离心除去聚乙二醇，固体培养。 ●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。 表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较 2重组子的鉴定 ●利用插入失活选择p B R322重组 ●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列 ●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列 ●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β- 半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。 ●转染：是将纯化的噬菌体D N A通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。 ●体外装配i n v i t r o p a c k a g i n g：将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子。 ●体外装配 –c o s位点突变的噬菌体的单品系系统 –另一种系统需要两种缺陷品系。一个是基因D的突变体，另一个是基因E的突变体。 3.1噬菌斑 ●λ形成的是真正的噬菌斑。 ●M13引起细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。 4重组噬菌体的鉴定 ●利用插入失活鉴定 ●λ噬菌体的c I基因的插入失活 ●利用S p i表型选择 ●根据λ基因组的大小筛选 4.1利用插入失活鉴定 4.2λ噬菌体的c I基因的插入失活 4.3利用S p i表型选择 4.4根据λ基因组的大小筛选 λ装配系统，只有37k b-52k b的D N A分子可以进入头部结构。 思考题
一、名词解释 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 、基因工程 基因工程是指重组 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在 顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子 、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链 某段特殊序列，并切割 双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身 不受限制，及破坏外源 使之迅速降解 、重组率：重组率 含有外源 的重组分子数 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为 ；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化 重组的后续操作 、探针 一小段单链 或 片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链 加热变性成为单链，
随后用放射性同位素 常用 、荧光燃料或酶标记成为探针 连接酶的酶活性 在最佳反应条件下 反应 ，完全连接 （ 片段）所需的酶量 二、选择题 、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组 工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组 乙型肝炎疫苗 、基因工程用于药物筛选模型的战略 、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 、分子杂交的化学本质是形成氢键 、 定点突变 的方法是 碱基的添加、删除、点突变
一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。 1、基因学说的创立 孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论，揭示了在染色体上基因的线性排列。 2、DNA是遗传物质 从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DNA是遗传物质。 3、DNA是基因的载体 4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。 5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。 6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，人们对基因的分子结构有了进一步的认识。 7、随着操纵子模型的提出，人们对基因的表达调控有了进一步的认识。 8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR等技术不断被人们运用。 9、目前，不仅能够分离天然基因，还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。 基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科，它的创立和发展，直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用。 1、三大理论基础： （1）1940年艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌； （2）1950年沃森（J.D.Watson）和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理； （3）1960年关于遗传信息中心法则的确立。 2、三大技术条件： （1）限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现； （2）基因工程载体； （3）大肠杆菌转化体系的建立。 3、应用：
第一章基因工程概论 第一节基因工程的基本概述 一、基因工程的基本概念 1、基因工程的基本定义： 按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA 直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 广义基因工程：DNA重组技术的产业化设计与应用。分为上游和下游技术。 2、上游技术：外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（狭义基因工程） 3、下游技术：含有外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养以及外源基因的表达、分离、纯化过程。 基因工程又称为：gene manipulation, gene cloning, recombinant DNA technoglogy, genetic modification, new genetics, molecular agriculture 二、基因工程的基本过程： 1、材料的准备：目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 2、目的基因与载体DNA的体外重组，形成重组DNA分子。 3、重组的DNA分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。 4、筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。 进一步可将基本步骤概括为：切、接、转、增、检［步骤演示］
图1-1 基因工程的基本步骤 三、基因工程的基本原理： 主体战略思想是外源基因的高效表达，可从四方面达到目的： 1、利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性与载体分子重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中的剂量，借此提高宏观表达水平。 2、筛选、修饰重组基因表达的转录调控元件：启动子、增强子、上游调控序列、操作子、终止子。 3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元件：序列、密码子。 4、工程菌（微型生物反应器）的稳定生产及增殖。 第二节基因工程的发展 一、基因工程的诞生 基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持： 1. 理论上的三大发现： 证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导） DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立 2. 技术上的三大发现 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始） 载体的使用 1970年，逆转录酶的发现。 1973年，C o h e n等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落T c r N e r，标志着基因工程的诞生。 二、基因工程的发展： 1. 1972-1976年，日本人，somatostatin； 2. 1978年，美国人，生长激素基因（HGH）； 3. 1980年，美国/瑞士人，a干扰素－基因； 4. 1984年，日本人，白细胞介素2（IL-2）； 三、基因工程的腾飞： 1. 1982年，美国人，大鼠生长激素基因转入小鼠； 2. 1983年，美国人，Ti质粒导入植物细胞（细菌Neor基因） 3. 1990年，美国人，腺苷脱氨酶（ADA）基因治疗，重度联合免疫缺陷症（SDID） 4. 1991年，美国倡导，人类基因组计划109bp，15年时间30亿USD； 5. 1997年，美国人，威尔英特克隆多利绵羊
《普通生物学A》期末考试试题（2004-2005，第一学期） 2005年1月10日院系__________姓名______________学号______________成绩______________ 一、填空（每空0.5分，共40分） 1．蛋白质是由__20__种氨基酸通过__肽_键连接而成，可以用放射性同位素__35S__来特异地标记；核酸可以用__32P__来特异标记；__亚油酸_和__亚麻酸_是人体必需的脂肪酸。 2．蛋白质变性的主要标志是__生物活性丧失，这是因为蛋白质的_高（或二、三、四）级结构被破坏。某些变性的蛋白质在一定条件下可以自动恢复活性，说明蛋白质的__一级结构_决定蛋白质的_高（或二、三、四）级结构_。 3．光合作用的光反应阶段是在类囊体膜上进行，它又可分为两个光系统，即光系统__I__和光系统_II_。前者的产物是_NADPH（或还原力）_，后者的产物是_ATP 和氧气_。光合作用的暗反应在_叶绿体基质进行，其主要作用是固定_二氧化碳_，这一过程称为_Calvin（或开尔文）_循环。 4．细胞周期包括_G1、__S_、_G2_和__M_四个时期。大部分蛋白质的合成是在__G1_期；DNA复制在_S_期。调节细胞周期的最主要的因子叫做_MPF（或有丝分裂促进因子或促卵泡成熟因子）_，它由Cyclin（或周期蛋白）_和_CDK（或周期蛋白依赖的蛋白激酶）_两种蛋白组成。细胞周期有3个检验点，它们分别位于G1/S、_G2/M_和M期，抑癌基因产物_p53（或Rb）_对G1/S检验点的形成很重要。5．不同物质的跨膜运输方式不同，请将下列物质与其运输方式相连： O2进入红细胞 肠道葡萄糖进入小肠上皮细胞自由扩散 K＋进入神经细胞协助扩散 葡萄糖从小肠上皮细胞进入血液胞吞作用 Ca2+排出肌肉细胞胞吐作用 胰岛素分泌主动运输 白细胞吞噬细菌 6．细胞通讯与信号传递，对细胞的生命活动很重要。在这一过程中，能引起细胞反应的
基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制，转录，翻译外援目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。基因工程的目标是实现转基因生物性状的定向改良，技术上包括基因或DNA 的体外重组，转基因，重组子筛选与扩大繁育等多个环节，目的性和技术性都很强，需要严密的实验设计。基因工程的技术流程包括以下几个基本环节：目的基因克隆，载体的准备，目的基因与载体的连接，重组DNA转化/转染/转导，重组体的筛选与鉴定，最后是重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用。从技术流程来看，基因工程包括四个基本条件：目的基因，载体，工具酶以及宿主细胞。 基因工程的发展经历了理论和技术的酝酿，诞生和快速发展等几个阶段。遗传物质DNA 的确定，DNA双螺旋结构的提出以及半保留复制机制的届是以及中心法则的提出为基因工程的诞生奠定了理论基础，而限制性内切酶核酸，连接酶的发现，载体的应用以及大肠杆菌转化体系的建立则为基因工程的诞生奠定了重要的技术基础。 基因工程能够真正应用离不开酶学，DNA重组技术的建立和发展是以各种核酸酶的发现和应用为基础的，特别是限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外切割与连接真正成为可能。通过切割相邻两个核苷酸残疾之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶叫做核酸酶，把应用于基因工程的各种核酸酶统称为基因工程的工具酶。 基因工程中常用的工具酶有：限制性内切核酸酶（特异切割DNA），DNA连接酶（DNA 片段间连接，产生重组DNA分子），DNA聚合酶Ⅰ（切口平移制作高比活探针；3’突出末端DNA分子标记），Klenow片段（3’凹陷末端的补平；双链DNA 3’末端标记；延伸寡核苷酸引物合成探针），TaqDNA聚合酶（PCR），反转录酶（合成cDNA），碱性磷酸酶（去磷酸化，防止载体自身连接），RNA酶（去除基因中的RNA）。 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）,简称限制酶，是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA 双链结构的内切核酸酶。已经鉴定出的限制性内切核酸酶可以分为四种不同的类型：TypeⅠ，TypeⅡ，TypeⅢ，TypeⅣ。Ⅱ型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，因为其识别和切割DNA分子具有严格的特异性，所以是基因工程中广泛使用的工具酶，被誉为基因克隆的“分子剪刀”。限制性核酸内切酶的活性受到以下几方面的影响：酶的纯度；DNA样品的纯度；DNA的甲基化程度；酶切反应的温度；DNA分子的构型；反应缓冲液；酶的星号活性；位点优势效应；末端切割。 DNA连接酶（DNA ligase）是能催化双链DNA片段靠在一起的3’ 羟基末端与5’ 段磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。目前发现和利用的DNA 连接酶主要来源于大肠杆菌，T4噬菌体和耐热细菌。在连接反应中，首先ATP（有些连接酶是NAD+）与DNA连接酶反应，与连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物，AMP激活DNA一条链的5’末端磷酸基团并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物，最后3’-OH对激活的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。其作用特点是：连接反应是耗能过程；不能够连接单链DNA分子；只能连接缺口不能连接裂口。影响连接反应的因素有：反应温度；连接酶浓度；ATP浓度；DNA片段末端。 基因工程的诞生，标志着人类打破历经数十亿年所形成的自然界固有的秩序，可跨物种进行基因交流，从源头上对生命进行控制或修饰，是人类从认识生命，探索生命奥秘的必然王国进入到改造生命的自由王国。基因工程对自然界和人类社会生活的影响之广，之深，是任何其他技术所无法比拟的。
1、什么是生命？生命的基本特征？ 生命泛指有机物和水构成的一个或多个细胞组成的一类具有稳定的物质和能量代谢现象（能够稳定地从外界获取物质和能量并将体内产生的废物和多余的热量排放到外界）、能回应刺激、能进行自我复制（繁殖）的半开放物质系统。 化学成分统一,严整有序的结构，新陈代谢，生长，遗传和繁殖，应经能力，进化 2、微生物发酵与人类的关系表现在哪些方面？ 生产人们生活中的各种食品：酒类，醋，酸奶…… 生产食品添加剂：柠檬酸，谷氨酸等 解决人类粮食短缺问题：通过发酵可获得大量微生物菌体——单细胞蛋白 工业上生产酒精，农药抗生素等 3、为什么说微生物与人类健康密切相关？ 益处： 微生物调节人体的内环境稳定：微生物代谢产生的酸性物质，可以抑制有害菌的繁殖。 微生物为人类提供多种营养物质：人体中的VitB因为有细菌合成而不宜缺乏。 现代生物学的若干基础性的重大发现与理论，是在研究微生物的过程中或以微生物为实验材料与工具取得的：证明DNA是遗传信息的载体。DNA的半保留复制方式。遗传密码子的解读。基因的转录调节。信使RNA的翻译调节等等。 现在，很多常用、通用的生物学研究技术依赖于微生物，比如：分子克隆重组蛋白在细菌或酵母中的表达，发酵技术产生单克隆抗体等。 很多医学技术也依赖于微生物，比如：以病毒为载体的基因治疗。 害处： 致病微生物会是人生病，甚至死亡。HIV引发AIDS，HPV诱发宫颈癌。 4、天然免疫与适应性免疫如何协同作用？ 5、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞的功能有什么差别？ 巨噬细胞（Macrophages）能够吞没、破坏受损伤组织，有助于启动康复过程。 树突状细胞：是一类在显微镜下看到的像树根形状的细胞，是机体免疫系统的控制者，当机体遭遇病原微生物侵袭或体内有细胞发生恶变时，树突状细胞很快即能获知这些信息，将这些信息及时传递给免疫系统，并将病原微生物或恶变细胞从体内清除出去。 中性粒细胞：将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片分解，这样，入侵的细菌被包围在一个局部，并消灭，防止病原微生物在体内扩散。中性粒细胞可引起感染部位的炎症反应并参与寄生虫感染引发的变态反应，从而引起免疫病理损害。 6、达尔文进化论的核心是什么？ 自然选择学说是达尔文进化论的核心 7、群体、物种、基因库、基因频率的概念？ 种群（population）指在一定时间内占据一定空间的同种生物的所有个体。种群中的个体并不是机械地集合在一起，而是彼此可以交配，并通过繁殖将各自的基因传给后代。 种群是进化的基本单位，同一种群的所有生物共用一个基因库。对种群的研究主要是其数量变化与种内关系，种间关系的内容已属于生物群落的研究范畴。 物种是生物分类学的基本单位。物种是互交繁殖的相同生物形成的自然群体，与其他相似群体在生殖上相互隔离，并在自然界占据一定的生态位。 一个种群全部个体所带有的全部基因的总和就是一个基因库。 群体中某特定等位基因数量占该基因座全部等位基因总数的比率。 8、生物宏观进化的大致进程？
名词解释（20 '） 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 1基因工程 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则 涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 2、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活 性的蛋白质分子 3、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身DNA不受限制，及破坏外源DNA使之迅速降解 4、重组率：重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25-75% ;重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高 的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作 5、探针 一小段单链DNA或RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链DNA加热变性成为单 链，随后用放射性同位素（P-32常用）、荧光燃料或酶标记成为探针 1 U DNA连接酶的酶活性 在最佳反应条件下15 C反应1h,完全连接1 mg l-DNA （Hind III片段）所需的酶量 二、选择题 1、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组CHO工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附 制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组CHO乙型肝炎疫苗 2、基因工程用于药物筛选模型的战略 3、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 4、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 5、分子杂交的化学本质是形成氢键 6、P CR定点突变DNA的方法是 碱基的添加、删除、点突变 7、双链DNA切开后，两链末端基团是5'-磷酸基和3'-羟基的末端『五菱三枪』 8、限制性核酸内切酶缓冲液中，DTT的功能是 还原，抗氧化。保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶活 9、DNA连接反应的最佳温度是16C 10、聚乙二醇促进平头DNA分子连接的机理： 促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率 11、大肠杆菌DNA聚合酶的用途： 细胞复制DNA的重要作用酶，催化DNA合成
专业重点整理 09级亲测可用 课程: 基因工程导论 团队: 南农爱整理团队 学院: 农学院 专业: 农学 班级: 农学9* 指导教师: 曹爱忠职称: 教授 2012 年7 月7 日 南京农业大学教务处制
基因工程导论 生物技术可以分为传统生物技术、工业生物发酵技术和现代生物技术。 现代生物技术包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等五大工程技术。 1、基因工程含义 概念：是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，利用分子生物学的手段，在体外操纵、改造、重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，获得人们所需的性状，并能稳定地遗传给后代。 特点：基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性。 2、DNA重组 利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物。 3、基因工程的理论依据 1）同基因具有相同的物质基础 2）基因是可以切割的 3）基因是可以转移的 4）多肽与基因之间存在对应关系 5）遗传密码是通用的 6）基因通过复制可以把信息传递给下一代 4、基因工程的实施步骤： 1）取得符合人们要求的DNA片段 2）目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA 3）把重组DNA引入某种细胞 4）把目的基因能表达的受体细胞挑选出来 5）形成新的目标产品 基因的概念 基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷段序列，是遗传物质的最小功能单位。 外显子：能够编码蛋白质的序列叫做外显子。 内显子：不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使RNA 。 原核生物的基因组结构特点 特点：1）染色体数量少； 2）DNA大多为双螺旋结构，少数以单链形式存在； 3）结构简单，基因组小，DNA一般只有单一复制起点，基因的编码通常是连续的，中间无非编码成分； 4）转录单元，基因组中功能相关的基因常集中在基因组的一个或几个特定部位，形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控，它们可被转录为多个mRNA分子，叫多顺反子； 5）存在重叠基因。
中国农科院博士入学基因工程概论试题汇编 2005年 2、噬菌粒的定义和优点 定义：一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒（phagemid 或phasmid）。 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬菌粒同时具有噬菌体和质粒的特征，可以像噬菌体或质粒一样复制。它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。 优点：1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链。 3、差异显示原理 1992年，梁朋和Pardee首次提出差异显示技术(DD-PCR)，并且利用这一技术克隆了几个基因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰度mRNA的优点，很快成为克隆新基因和研究植物基因表达的有力工具。这项技术最初用于医学研究上，近年来已开始在高等植物研究中应用，为研究高等植物的发育、生理代谢、基因表达提供了重要的技术手段。原理：是利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR 扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。 操作步骤： (1)从植物组织中提取总RNA：在这个步骤中注意不能有DNA污染，一般用无RNA酶的DNA酶在37℃下处理30min (2)在逆转录酶作用下：以Oligo T11MN为引物(M为G、A、C中的任一种，N为A、C、 G、T任一种)，进行逆转录 (3)PCR反应：扩增cDNA的第一条链 (4)扩增后cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳：使差异表达的cDNA片段在6%测序胶上分开 (5)找出不同处理间差异显示的条带：从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增 (6)克隆差异片段：差异片段可作为探针 (7)Northern杂交：验证目的片段，去掉假阳性片段 (8)对目的片段进行测序 (9)以克隆的目的片段为探针：从基因组文库中筛选出相应的全长基因。 4、酵母双杂交原理和进展 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。 酵母双杂交由Fields在1989年提出.他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究.GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.位于N端1-174
2004年中国农科院博士入学基因工程概论试题 一、名词解释 1、2μ环 2、hat选择 3、Ri质粒 4、cDNA 5、染色体步查 6、基因文库 7、α互补 8、Y AC 9、BAC 10、共整合载体 11、12、13、14、15、16、 二、简答题 1、举出植物转基因的三种方法，并说明其原理。 2、Southern印迹的原理及应用。 3、AFLP的原理及其应用。 4、拟南芥和水稻已进行全基因组测序，简述其对科学和社会领域的重要意义。 5、简述质粒、噬菌体和柯斯粒三种载体的结构特点。 6、 7、 8、 三、如果我们已经得到水稻的一个cDNA克隆，请设计一个验证该cDNA功能的试验步骤。 2002年中国农科院博士入学基因工程概论试题 一、简答题 1、聚丙烯酰胺、琼脂糖在DNA电泳中的区别是什么？ 2、举出动物转基因的两种方法，并说明其原理。 3、双脱氧法测序的原理。 4、以拟南芥或玉米为例，说明转座子标签法进行基因转移的原理。 5、Southern印迹的原理及应用。 三、试论述植物基因工程研究进展以及在农业生产上的意义。 2001年中国农科院博士入学基因工程概论试题 一、名词解释 1、限制性内切酶 2、同裂酶 3、核酶 4、2μ环 5、hat选择 6、Ti质粒 7、T-DNA 8、同功tRNA 9、反义tRNA 10、有义链 11、α互补12、基因文库13、cDNA 14、染色体步查（是否缺一个？） 二、简答题 1、举两种植物基因转移的方法?简述其原理。 2、Southern印迹的基本原理，这种方法有何应用。 3、噬菌体与cos作载体有何区别？ 4、AFLP的原理及其应用。 5、普通PCR与RAPD有何区别，何谓普通PCR？ 6、何谓双元载体，简述其组装过程及其作用机理？ 三、判断题 1、无论用哪种转化方法均可用PBR322作载体 2、进入细菌的外来DNA之所以被降解，是因为细菌只修饰自身DNA，不修饰外来DNA 3、只有粘粒端才可以被连接起来 4、用自身作引物合成的cDNA链，往往cDNA并不完整
一、名词解释(20’) 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 1、基因工程 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 2、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子 3、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链DNA某段特殊序列，并切割DNA双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身DNA不受限制，及破坏外源DNA使之迅速降解 4、重组率：重组率= 含有外源DNA的重组分子数/ 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25-75%；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作 5、探针 一小段单链DNA或RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素(P-32常用)、荧光燃料或酶标记成为探针 1 U DNA连接酶的酶活性 在最佳反应条件下15 ℃反应1h，完全连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量 二、选择题 1、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组CHO工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组CHO乙型肝炎疫苗 2、基因工程用于药物筛选模型的战略 3、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 4、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 5、分子杂交的化学本质是形成氢键 6、PCR定点突变DNA的方法是 碱基的添加、删除、点突变 7、双链DNA切开后，两链末端基团是5'-磷酸基和3'-羟基的末端『五菱三枪』 8、限制性核酸内切酶缓冲液中，DTT的功能是 还原，抗氧化。保护酶分子上的还原性基团，维持还原性环境，稳定酶活 9、DNA连接反应的最佳温度是16℃ 10、聚乙二醇促进平头DNA分子连接的机理： 促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率 11、大肠杆菌DNA聚合酶的用途： 细胞复制DNA的重要作用酶，催化DNA合成 Klenow酶：又称Klenow片段，用枯草杆菌蛋白酶将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD
现代生物技术概论（2014）概结 一、名词解释 植物细胞：是植物生命活动的基本单位。 愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞在培养一段时间后经过细胞分裂产生无组织结构，无明显极性的松散细胞团。 分批培养：将愈伤组织在一定容积的的密闭容器中进行培养，它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究用的培养方法。 看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖，这个愈伤组织称为看护愈伤组织。 微室培养：人工制造一个小室,将单细胞培养在小室中的少量培养基上,使其分裂增殖形成细胞团的方法。 花药培养：通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，进行诱导分化，最终形成完整植株的技术。 人工种子：一种含有植物胚状体，营养成分，激素以及其他成分的人工胶囊。 限制性核酸内切酶：是一种能够识别双链DNA分子中某种特异序列，并由此出切割DNA双链的一类内切酶。 载体：基因工程操作中，能携带目的基因进入宿主细胞进行扩充和延伸的工具。 基因文库：将某种生物的基因组DNA切割成大小合适的片段，并将这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中，保存和扩充，理论上讲，这些重组载体上携带了该生物的全部基因，称为基因文库。 热处理脱毒：通过对材料进行一个阶段的高温培养和发育使其脱毒。 亲和素：能与生物素识别特异结合的蛋白或粒体识别地高辛，用抗地高辛抗体。 二、填空题 1.植物细胞工程要素：植物材料（外植体）、无菌操作、培养条件。 2.悬浮培养的基本形式：分批培养、连续培养。 3.细胞生长各个时期的特点：滞后期、对数生长期、直线生长期、缓慢期、静止期。 4.植物组织培养需要物质：大量元素、微量元素、有机物、（碳源和能源）。 5.植物脱毒方法：茎尖培养脱病毒、愈伤组织脱病毒、热处理脱病毒。