224 中国医药生物技术 2010年6月第5卷第3期Chin Med Biotechnol, June 2010, V ol. 5, No. 3 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.013 ·
技术与方法· 静注人免疫球蛋白抗补体活性
测定影响因素的探讨
王宗刚，卢元志，张慧兰
静注人免疫球蛋白（pH 4）（IVIG）是我公司生产的具有多种抗体活性的血液制品，因具有广泛的应用价值而受到临床重视。其低 pH 值能更好地保证 Fc 段生物学活性，一般认为少量的 IgG 多聚体能暴露出 Fc 段补体结合位点，从而促使抗补体活性（ACA）产生[1-3]。ACA 是 IVIG 中一项重要的指标，它指 IVIG 中 IgG 多聚体在没有结合抗原的情况下，激活补体的能力。IgG 多聚体通过激活补体使补体消耗，从而使机体的免疫防御能力下降。头痛、潮红、颤抖、背痛、恶心是较常见的不良反应症状[4]。因此，ACA 的高低对 IVIG 的质量起着至关重要的作用。据文献报道[5]，影响 ACA 的因素可能与 IgG 多聚体含量、Na+ 浓度、pH 值、葡萄糖的浓度有关。据此，我们进行了研究。另外，还研究发现枸橼酸含量对 ACA 也有一定影响。本文就以上因素对其进行实验分析。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1试剂氯化钠购自天津海光药业有限公司；葡萄糖购自天津海光药业有限公司；枸橼酸购自湖南尔康制药有限公司；钙镁离子贮备液、巴比妥缓冲贮备液、明胶巴比妥缓冲液、阿氏液均自制；IVIG（pH 4）样品为本公司用低温乙醇分离法生产的，随机抽取 3 批，批号分别为 20090101、20090412、20090619。
1.1.2仪器 721 型可见分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；501 型超级恒温水浴箱为上海市实验仪器总厂产品；660PH 计为上海英格仪器厂产品；Lambda BIO 紫外分光光度计为美国 PE 公司产品。
1.1.3 实验动物 15 只豚鼠，雄性，年龄 40 d，体重 400 ~ 500 g，健康状况良好；兔子，2 个月龄，雄性，体重 1200 ~ 1500 g，健康良好；绵羊，雄性，体重 33 kg，健康。以上动物均由山西康宝生物制品股份有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 豚鼠血清（补体）的制备对豚鼠进行心脏采血，放入大试管中，待血凝固后，取出血清，4 ℃离心除去血细胞，制备混合血清，尽快分装，–70 ℃保存，也可冻干保存。豚鼠血清每 1 ml 中的补体总活性应不低于 200 CH50。
1.2.2溶血素兔抗羊红血球血清。用羊红血球免疫兔子，使兔子产生抗体，分离血清制得。
1.2.3绵羊红血球由绵羊颈静脉无菌采集全血与等体积的阿氏液混合，无菌分装于试管中，4 ℃保存 1 周后方可使用。如未污染细菌可用 4 周。
1.3 检测方法
1.3.1ACA 测定按照中国药典 2005 年版三部附录IX K 中的方法测试 3 批样品。
1.3.2多聚体含量测定采用中国药典 2005 年版三部附录 III B 高效液相色谱法（HPLC）进行分析，根据峰面积计算 IgG 多聚体含量。
2 结果
2.1 IgG 多聚体含量对 ACA 测定的影响
将 3 批 IVIG 样品放入 60 ℃恒温水浴中加热，使之产生 IgG 多聚体，每隔一定时间取样对其 IgG 多聚体含量和 ACA 测定，结果见表1。结果表明，3 批 IVIG 的 IgG 多聚体含量对 ACA 测定的影响无显著差异（P > 0.05）。
2.2 Na+ 浓度对 ACA 测定的影响
将 3 批 IVIG 样品中加入不同浓度的 NaCl，将 pH 值调至 7.1（等电点），测定其 ACA，结果见表2。3 批检测结果均表明，随着 Na+浓度的增加，IVIG 样品中 ACA 有下降趋势。由此可见，Na+浓度对 ACA 测定有一定的影响。
2.3 pH 值对 ACA 测定的影响
将 3 批 IVIG 样品 pH 值调整前和调至 7.1 后测定ACA，结果见表3。结果表明，随着 pH 值增加至 IVIG 等电点，ACA 有一定程度的降低。由此可见，不同 pH 值对ACA 的测定有一定影响。
2.4 不同浓度的葡萄糖对 ACA 测定的影响
将 3 批 IVIG 样品中分别加入不同浓度葡萄糖做保护剂，测定其 ACA，结果见表4。结果表明，加入浓度为5% 的葡萄糖做保护剂时 ACA 最低。此结果与文献[6]中结果一致。
2.5 枸橼酸对 ACA 测定的影响
将 3 批 IVIG 样品中分别加入不同浓度枸橼酸，测定其 ACA，结果见表5。结果表明，加入枸橼酸可以使 ACA 升高。
作者单位：046011 长治，山西康宝生物制品股份有限公司
通讯作者：王宗刚，Email：wngznggng@https://www.doczj.com/doc/7519089294.html,
收稿日期：2009-11-12
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表 1IgG 多聚体含量和 ACA 的关系
批号 20090101 20090412 20090619 IgG 多聚体含量（%）0.91 4.01 7.11 0.81 4.17 7.03 0.88 4.33 6.97
ACA（%）14.7 14.4 14.1 7.5 7.7 7.9 26.1 26.0 26.1
表 2Na+浓度和 ACA 的关系
批号20090101 20090412 20090619 Na+ 浓度（%）0 0.3 0.6 0.9 0 0.3 0.6 0.9 0 0.3 0.6 0.9 ACA（%）16.4 15.3 14.3 13.9 8.8 7.3 5.5 3.3 28.2 26.6 24.5 23.6
表 3 pH 值和 ACA 的关系
批号20090101 20090412 20090619 pH 值 3.89 7.10 3.98 7.10 3.88 7.10
ACA（%） 16.8
11.9
9.8
3.3
27.4
20.6
表 4葡萄糖浓度和 ACA 的关系
批号 20090101 20090412 20090619 葡萄糖浓度（%） 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7
ACA（%）13.6 15.3 11.4 12.3 13.3 9.910.9 8.18.910.6 28.6 28.4 22.1 30.3 35.6
表 5枸橼酸浓度和 ACA 的关系
批号 20090101 20090412 20090619 枸橼酸浓度（%）0 0.1 0.2 0 0.1 0.2 0 0.1 0.2
ACA（%）15.6 26.8 44.0 11.5 > 50 > 50 28.4 > 50 > 50
3 讨论
从实验结果可以看出：
⑴ IVIG 中 IgG 多聚体含量对 ACA 测定结果没有显著影响，与文献[5]结果一致，但我们认为 ACA 的产生不仅与 IgG 多聚体含量有关，还有其他未探明因素；
⑵ Na+浓度，pH 值和葡萄糖的浓度均对 ACA 测定有一定影响。其中，随着 Na+浓度的增加，IVIG 样品中ACA 有下降趋势；pH 值增加的过程中，ACA 有降低趋势；5% 的葡萄糖做保护剂时 ACA 最低。这与文献[6-7]研究结果一致；
⑶生产上在制作 pH 4.0 的 IVIG 过程中，实验证明，用枸橼酸调整反应的 pH 值能使 IVIG 中 ACA 增高，甚至超出测定范围，用半透膜透析法超滤除去反应过程中加入的枸橼酸则明显能使 ACA 降低。所以，一般生产上采用HCl 来控制反应中的 pH 是有一定道理的。但加入微量的枸橼酸即能使 ACA 有较大波动，其原因还有待于进一步探讨研究。
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