郭兆奎,助理研究员,硕士,从事分子生物学研究和转基因烟草检测工作。
收稿日期:1999—08—06
适于PCR 分析的烤后烟叶DNA 提取方法的研究
郭兆奎 万秀清 魏继承 于艳华 于金涛
(黑龙江省烟草科学研究所 牡丹江 157011)
摘 要 以8种方法提取烤后烟叶
DNA ,测定其浓度和纯度,结合叶绿体不编码蛋白序列和
35S 启动子序列的PCR 扩增结果来分析评价提取DNA 的质量,同时讨论了这些提取方法的可靠性及所提取DNA 的纯度和产量。
关键词 烤后烟叶 DNA 提取 PCR 分析 随着PCR 技术的发展,尤其是在转基因检测、病原检测和转基因烟草安全性评价等方面的广泛应用,迫切需要一种可靠、快速从烤后烟叶微量提取高纯度DNA 的方法。本实验通过8种DNA 提取方法的比较,提出了适于烤后烟叶DNA 提取的优化方法。
1 材料和方法
111 试验材料
烟草材料:A )阳性材料采用转普通花叶病毒外壳蛋白基因(TM V —CP )N C 89;B )阴性材料为普通N C 89,烟叶经常规方法烘烤处理。
PCR 反应试剂:P rom ega 公司产品,购于天象
人生物工程公司。
PCR 引物:A )叶绿体不编码蛋白基因引物序列:
P lan t 215′C G A A A T C G G T A G A C G C T A C G 23′
p lan t 225′G G G G A T A G A G G G A C T T G A A C 23′
B )35S 启动子序列
35S 215′G C T C C T A C A A A T G C C A T C A 23′
35S 225′G A T A G T G G G A T T G T G C G T C A 23′
由大连宝生物工程公司商业合成,H PL C 方法纯化。112 试验方法
11211 材料提取前处理
取10g 烤后烟叶于研钵中液氮充分研磨,分别称取50m g 加入若干115mL Epp endo rf 管中。11212 DNA 提取方法
方法一:W J C 法11加入500ΛL 提取缓冲液,振荡混匀,冰上静置30m in 。
2111822r m in 离心5m in 。
31取上清液至新管中,加等体积酚,混匀,12399r m in 离心5m in 。41取上清液至新管中,加等体积酚2氯仿,混匀,12399r m in 离心5m in 。
51取上清液至新管中,1 10体积3m o l L N aA c (pH 512)和2倍体积的冷无水乙醇,-20℃沉淀1h ,12399r m in 离心5m in 。
61弃上清液,以70%乙醇洗两遍,真空干燥2h
以上。
71沉淀重新溶于50ΛL 去离子水中-20℃保存。
方法二:(O a rd a nd D ronova l .)11加600ΛL 抽提缓冲液,沸水中热浴7m in 。21离心后上清液转入一新的Epp endo rf 管中,加45ΛL 10m o l L 乙酸铵和1mL 乙醇于-40℃冷置1h 。
31高速离心15m in 。
41沉淀于60℃干燥5～10m in ,重悬于50ΛL T E 中。
方法三:(G ibco p la nt DNA Zo l Re ge nt )参照Gibco 植物DNA 提取试剂盒说明。方法四:(Edw a rds )
中国烟草科学 1999,(4):5—8
11加600ΛL提取缓冲液,高速离心5m in。
21取上清液,加等体积异戊醇,冰置5m in。
31高速离心10m in。
41沉淀于60℃真空干燥5～10m in,重悬于70ΛL T E中。
方法五:(Q ia ge n D Ne a s y p la nt m ini k it)
参照Q iagen D N easy p lan t m in i k it手册。
方法六:改进C TAB法
11加入700ΛL0175X CTAB提取缓冲液,充分混匀后在65℃中水浴10m in。
21加入700ΛL氯仿:异戊醇(24∶1),混匀后在4℃、12950r m in离心4m in。
31取上清液,加1 10体积的10%CTAB提取缓冲液,加入等体积的氯仿:异戊醇(24∶1),混匀后在4℃、12950r m in离心4m in。
41重复步骤3。
51取上清液,加等体积的CTAB沉淀缓冲液,混匀后在4℃、14479r m in离心8m in。
61去上清液,沉淀加入100ΛL高盐T E缓冲液,65℃水浴5～10m in。
71加入2倍体积的冷无水乙醇,于-40℃冷置30m in。
8114479r m in离心8m in,沉淀溶于50ΛL超纯水中。
方法七:SDS法
11向Epp endo rf管中加入450ΛL提取缓冲液和100ΛL SD S,用力振荡、混匀。
2160℃温浴10m in,取出后加160ΛL3m o l L KA c(pH512),冰上静置20m in。
314℃下12950r m in离心10m in。
41吸取上清液至另一Epp endo rf管中,加入等体积的异丙醇,冰上静置30m in。
51重复步骤3。
61弃上清液,沉淀重悬于420ΛL T E中,加RNA酶37℃温浴2h。
71加等体积酚-氯仿12950r m in离心抽提一次。
81取上清液,加等体积氯仿再离心抽提一次。
91取上清液,加1 10体积的3m o l L N aA c (pH512)和2倍体积的冷无水乙醇,-40℃冷置30 m in。
10114479r m in离心10m in,沉淀重悬于30ΛL T E中。
方法八:改进的酚 仿抽提法
11加1mL50℃预热的抽提混合液(20ΛL的巯基乙醇加入到1000ΛL的2×抽提贮存液,加样混合)。
21将其中600ΛL的混合物转到2mL的试管中,50℃温浴裂解20m in。
31裂解液中加入500ΛL的酚 仿(1∶1),用力振荡混匀,37～45℃下振荡60m in以上。
4125℃下15000r m in离心20m in,取400ΛL上清液至新管。
51加400ΛL1×抽提贮存液和500ΛL的酚 仿(1∶1),37℃下振荡30m in。
6125℃下15000r m in离心30m in,取600ΛL上清液至新管。
71加500ΛL氯仿,室温振荡10m in以上。
8125℃下15000r m in离心30m in,取450ΛL上清液至新管。
91加150ΛL10m o l L醋酸铵和300ΛL异丙醇颠倒混合,25℃下15000r m in离心30m in,小心弃上清液。
10170%乙醇洗管两次,加RN ase处理。
11213 DNA产量和纯度测定
烟叶DNA提取物的产量和纯度可以通过紫外分光光度计260nm和280nm之间的波长扫描来估测,并利用叶绿体不编码蛋白基序列和35S启动子序列扩增评定是否可作模板。
2 实验结果
211 8
种提取方法的比较
注:11W JC 21oard 31Gibco P lant DNA Z OL R EGEN T 41Edw ards 51Q iagen DN easy k it 61改进的CTAB 71SD S 81改进的酚 仿抽提法
图1 8种方法提取DNA的波长扫描
中国烟草科学
(1)不同提取方法提取DNA的波长扫描
从波长扫描的结果来看,各种DNA提取方法(除了方法2)提取DNA在260nm处均有一个明显的峰,但是它们的曲线形状却有明显的差别。各种DNA提取方法提取的DNA,不同程度上含有一些杂质(RNA、多糖及其它的代谢产物),而这些杂质对吸光度的影响很大,从而影响曲线的形状。从图1中我们发现,DNA提取方法5和6提取的DNA不论是从产量还是从纯度上考虑都是最好的,从对各种提取方法的波形比较分析认为,DNA提取方法5和6提取的DNA的波形较好,所含有的杂质也最少。所以我们认为8种DNA提取方法中,方法5、6最适宜于干烟叶的DNA提取。
212 不同DNA提取方法的DNA产量和纯度比较一般认为,波长为260nm下,吸光值110相当于50Λg mL双链DNA,纯度利用260nm和280nm 下的吸光值的比值进行计算,比值在117～119之间纯度较高,试验中方法6提取的DNA纯度10次的平均值是1182,方法5为1176,都在此范围内,纯度较好。其它提取方法的纯度都低于117,杂质含量较高。
表1 不同DNA提取方法的DNA产量和纯度
提取方法
纯 度
A260 A280
产 量
ng m g
方法1115317410
方法211108100
方法3114211210
方法4114095100
方法5117621010
方法6118226810
方法711335610
方法8116512710
213 不同提取方法叶绿体不编码蛋白和35S启动子序列PCR扩增结果分析
由图2可以看出:不同DNA提取方法所提取的DNA虽然在产量和纯度上差异很大,但叶绿体不编码蛋白序列PCR扩增条带都非常明显,主要由于叶绿体不编码蛋白序列在烟草细胞中具有较高的拷贝数。从35S启动子序列扩增结果看,方法5和6提取的DNA表现为一条非常明显的35S启动子序列扩增条带,提取方法3、1、4、8也出现特异扩增条带,但没有方法5和6明显。另外两种方法提取的DNA没有得到扩增产物,主要由于纯度过低所致
。
2～918种DNA提取方法叶绿体不编码蛋白序列扩增结果 101试剂对照 111M arker 131M arker 14～2118种DNA提取方法35S启动子序列扩增结果 221阴性对照
图2 PCR扩增结果分析
3 讨 论
就PCR本身而言,对模板DNA的要求并不是非常苛刻,但由于烤后烟叶样品DNA降解严重,样品中阳性成分含量差别较大,有些样品的含量可能极少,为保证转基因检测的准确,必须保证模板的纯度,试验结果表明:8种DNA提取方法所提取的DNA都可以获得叶绿体不编码蛋白序列的扩增产物,但对于35S启动子来说,有6种提取方法均可获得扩增产物,其中以改进的CTAB方法和Q I A GEN DN easy P lan t M in i K it提取的DNA获得的扩增条带最为理想,对照紫外波长扫描结果,这两种提取方法制备的模板DNA纯度最高,OD260 280稳定在117～119之间。
试验方法中所用的叶绿体不编码蛋白序列PCR扩增片段长度为550bp,而转基因烟草共有序列检测(35S和NO S)和目的基因检测的片段长度均在300bp以下,从扩增片段长度上看,利用叶绿体不编码蛋白序列PCR扩增,用来评价PCR模板是适宜的,但由于叶绿体不编码蛋白序列在烟草细胞的拷贝数,远高于外来基因序列,在PCR扩增效率上可能存在差异,在对DNA提取物评价时,应将叶绿体不编码蛋白序列扩增结果和紫外波长扫描结合起来考虑。
参考文献
1 Edw ards1A si m p le and rap id m ethod fo r the p reparati on of p lant genom ic DNA fo r PCR analysis.N ucl.A cids R es.19:1349
2 Fang G S,H amm ar1A quick and inexpensive m ethod fo r remo2
第4期 郭兆奎等:适于PCR分析的烤后烟叶DNA提取方法的研究
国际烟草科学研究合作中心(COR ESTA)会议在苏州召开
1999年10月10日～14日,国际烟草科学研究合作中心(CO R ESTA)会议在苏州隆重召开。这次为期5天的农学与植病学组联席会议,是继1988年广州大会后,CO R ESTA在中国召开的又一次国际性会议。
CO R ESTA农学组组长Sergi o BR E MM先生(巴西)、植病组组长R enéD ELON博士(法国)、国家烟草专卖局副局长潘必兴、中国烟草学会理事长关政林、名誉理事长金茂先、秘书长华明德、中国工程院院士朱尊权、美籍华人左天觉博士等出席会议。
此次会议国内代表50余人,国外代表120余人,其规模为近年来我国烟草界国际学术活动之冠。
学术论文多,涉及领域广是这次会议的一大特点。本次会议,共有62名专家学者作了学术报告或宣读论文,其中中国论文16篇。会议内容包括基础研究和应用基础研究,涉及国内外烟草农业科学、病理病害及CO R ESTA在全世界开展的部分调查,并重点探讨了正在烟草业发展的马铃薯Y病毒病的病源、发病规律、对烟叶品质的影响;烟草细菌性青枯病、黑胫病;转基因的检测;杂交品种;对烟草有害物质特异亚硝胺的分析、鉴定、转化;烟草机械打顶导致的病害传播;烟草施肥、灌溉及除草剂的开发研究等。会上还介绍了中国、巴西、阿根廷、津巴布韦及欧洲的烟草生产和科技概况。国内烟草界权威人士指出,会议讨论和涉及的许多问题,对我国烟草科研和生产具有实际意义。
会议的又一大特点是青年学者比重较大。菲利普?莫瑞斯(美国)烟草公司D aleH ill博士的看法颇具代表性,他认为,这次会议,中国的论文作者以年轻学者为主,论文水平较以往有所提高,希望对他们给予支持和鼓励,使其继续在烟草研究方面做出更大贡献。
(本刊记者 徐建华)
ving po lysaccharides from p lant genom ic DNA1B i o T echniques 13:52～55
3 Guidet F1A pow erful new technique to quick ly p repare hundred of p lant extracts fo r PCR and RA P I D analysis.N ucl.A cid R es
22:1772～1773
4 O ard J H.R ap id iso lati on of rice and m aize DNA fo r analysis by random p ri m er PCR.P lant mo l.B il R ep tr.10:236～241
Study on D NA extraction m ethods suitable for cured tobacco leaf
Guo Zhaoku i W an X iuqing W ei J icheng Yu Yanhua Yu J in tao
(H eilongjiang Tobacco R esearch In stitu te M udan jiang 157011)
Abstract
T he concen trati on and the p u rity of DNA ex tracted from the cu red tobacco leaf w ith eigh t m ethods w ere m easu red and its quality w ere assessed by PCR analysis w h ich u sed tobacco ch lo rop last non2coding DNA sequence and35s p rom o ter sequence.T he liab ility,conven ience,p u rity and yield of these DNA ex trac2 ti on m ethods w ere also discu ssed.
Key words:Cu red tobacco leaf;DNA ex tracti on;PCR analysis
(责任编辑 徐建华)
中国烟草科学 1999,(4):8