讨论
1.假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4.出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数
胶回收DNA注意事项
①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。
②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。
③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合 DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。
⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH 适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。
⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。
⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。
⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。
⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
关于胶回收切胶的一点注意事项
1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。
2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。
4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，
根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。
胶回收
一. 提高胶回收量的办法：
1) 增加电泳时的上样量。
2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。
4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。
5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。
6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA 与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。
7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。
最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。
9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。
10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。
二. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤
1) 普通胶回收
如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。
2) 从低熔点凝胶回收DNA
纯化DNA片段加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE 饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。
3) 扩增特异性好的PCR回收
如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。
三. 不需胶回收就可直接连接的方法
1) 低温冷冻析出法
跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。
2) 酶切后的直接连接
在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的.
四、一些注意事项
1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。
2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。
3.关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果你戴树脂眼镜就可以了。
4.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。
5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用 EB。
6.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。
7.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。
附注：
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
1)DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）
2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA
Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb
1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.
3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB含量有关。
4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm
5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃
6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)
7)电泳缓冲液（0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用 1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
报批细节 1、技术档案： 技术人员简历表、培训档案、要求有实质性文件如每人的学历证书、上岗证、科研成果（课题）、技术文章、获奖证书等的复印件 2、仪器档案： 实验室所有仪器的购买、使用、校正、放置地点、出厂编号、说明书复印件等 实验室所有仪器维护校正记录如：加样器、温度计、温湿度计需出具计量局校正报告文件（可每种只校正一套作为标准）。 扩增仪需有仪器厂家专业技术人员维护校正报告，和校正后的参数。 加样器的出厂编号、使用时间、校正记录。 5700维护后验证记录—用同一公司或校准试剂或用自制质控血清并记录数值 3、其他细节: 垃圾处理：按生物污染性制品，交医院统一处理。 仪器简单操作流程 标记笔、枪头盒等一些小物品都要标明分区。 仪器的申请、采购、使用、验证程序 样本采集（针对临床医护人员）、运输、收集程序 样品的唯一编号原则—应区分开不同天、不同种类的标本 标本的保存程序—包括处理前、刚处理后、报告发放后的原始标本（原则上至少保留一周）应有专人负责。 检测结果的保存、备份记录、质控记录保存，除电脑记录外应有相应的手抄记录（类似于基因日检测统计表类型的）。 抱怨记录—应有时间、事件（项目）、接待人、处理方法、处理结果、处理人签字确认
注意事项 1、回答任何问题都应与自己写的SOP文件相一致."写你所做的,做你所写的". 2、SOP文件不能写的太虚,无法做到的东西不要写,比如公司版的SOP文件里的加样器的校准一般实验室就做不到.模棱两可也不要写,比如"消毒时间一到两小时"不能这样写,多少就是多少. 3、处理标本要在生物安全柜内,而加样则在柜外. 4、各区门口要贴有各区的工作制度,限入标志.还要准备两个登记本,一个来记录紫外消毒,一个来记录工作人员出入.区内还要有一个工作记录本,用来记录各区每天的工作内容,便于监测每天的工作全过程. 5、每把枪的用途要清楚,不能弄乱.比如稀释阳模的枪和处理标本的枪不可混用. 6、普通离心机处理分泌物标本时应在离心后静置20分钟才能开盖.(许斌这样认为) 7、所有仪器、设备都要有档案卡. 8、所有的清洁消毒要在实验结束后马上进行,尤其是仪器、设备.像扩增仪，每天都要清洁，做完的反应管决对不能留在样品槽内。 9、各区的拖把、抹布不得混用,标记清楚. 10、生物防护意识要强,手套要随时更换.生物防护安全的保证要从三个方面:制 度、硬件、意识。 11、爆管如何处理:立即停止实验,水浴里的水要倒掉,冲洗.所有可能污染的地方 要用消毒液擦洗,紫外照射,通风排风. 12、各区应有日常工作核查表,做为每天工作记录的补充. 13、各区要有泡有消毒液的生物污物桶,用来处理生物垃圾. 14、验收组带来的标本要按平时对待临床标本一样处理,要有接收记录,结果登记 等. 15、拒绝电话或代领等非正常方式发放报告单. 16、存放标本的冰箱要上锁,钥匙及电脑资料的密码要由本科室人员专人保管. 17、报告单上要注明试剂的检测下限,不能写成参考范围.除了有操作者,还要有 核校者,且两者姓名除了电子打印还要用手签.定量结果不能有阴阳性提示,
胶回收DNA注意事项 ①切胶回收DNA片段是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。所以为了减少胶的体积，我们就可以用相对比较薄的胶来跑电泳，通常只要够点样即可，或是采用薄而宽的梳子来跑胶。这样可减少回收试剂引起的一些后续麻烦。 ②主要还是DNA的浓度, 如果DNA浓度不够, 想胶小点也不可能。 ③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。 ④利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段可能有以下几个原因：胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；漂洗液中未加入无水乙醇。 ⑤可以改用去离子水洗脱。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH 值，以增加洗脱得率。 ⑥洗脱产物含有残留的乙醇会影响后续酶切实验，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。 ⑦不可以使用更小洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。 ⑧电泳检测只有一条目的带，可以选用凝胶回收试剂盒。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，
其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。 ⑨琼脂糖凝胶胶块不溶可能是下述原因：琼脂糖质量不好；含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃；制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。 关于胶回收切胶的一点注意事项 1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。 4. 按照正常程序点marker跑胶，然后切下有marker的胶，EB染色，紫外灯下与带刻度的尺子一起照相。由于要回收的带与marker间的相对位置已知，根据尺子来衡量未染色胶上目的带的位置即可。如果觉得很难判断，可以直接在marker边点少量的样，这样位置就容易确定了。 胶回收
PCR疑难解答 当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将PCR反应的试管与反应板紧贴。 当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml 的PCR管中不能均匀传热。 不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。 没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。 泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。 检查模板和引物的用量。 增加循环次数和/或模板DNA的用量。 泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高退火温度，但不要超过68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。 其他值得注意的条件： 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。 基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。 变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。 延伸：68--72℃下进行延伸操作。 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。
1、如何计算提取率 1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率； 2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比； 3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。 2、如何简易测算提取率 取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5-10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。 3、如何看待提取得率 影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 4、回收率为什么与点样量和片段大小有关 DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。 5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因 1）胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；
2）胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收； 3）紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内； 4）洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率； 5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好； 6）回收前的样品量太少，加大点样量； 7）洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。 6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象 1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶； 2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收； 3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。 7、琼脂糖凝胶块不溶 1）琼脂糖质量不好； 2）含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃； 3）制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
胶回收方法全攻略 说到电泳凝胶的片断回收，想来在实验室久已的“老手”们都会不屑一顾。确实，一般在各个和分子生物学沾到一点边儿的实验室里，从琼脂糖凝胶中回收DNA，仅仅是一种简单不过的常规实验操作。虽说早期的凝胶电泳片断回收没有1—2个小时是搞不定的，每个实验室也有自己的独门秘诀，可后来各大品牌纷纷推出了了多种不同用途，不同价钱的快速凝胶回收试剂盒，一下子将胶回收的时间缩短到10多分钟，操作也大大简化，胶回收就变成“小菜一碟”了。然而，从bbs逛上一圈下来，发现实际上还是有不少人为胶回收这种看似简单的操作而 烦恼。到底是什么导致了实验新手，甚至是老手在这个已经发展近40年的常规性实验中卡壳?由于胶回收的质量和数量直接影响后继的一系列实验——比如 酶切连接、转化筛选、测序或者PCR 扩增、标记乃至显微注射等等，为大家搜罗各种产品和方法的优缺点，注意事项，做一个胶回收全攻略篇。 一、胶回收的关键参数 胶回收的质量直接影响后继实验的成功与否。要想做好胶回收，无论是自己亲力亲为还是借助目前五花八门的胶回收试剂，最基本的评定标准无外乎这么几个:质量( 回收产物的纯度和浓度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的载量等等。 回收产物质量：回收产物的质量主要指纯度。常规电泳过程中，普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，会强烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实验。从凝胶中回收DNA片断，产物的纯度自然是我们考虑的第一要务。对于大片断DNA回收，质量还包括了产物的完整与否，如果机械剪切力使得回收产物大小不一致，后果决不是你希望碰见的。而对于较小片断回收，质量其实还包括了回收产物的浓度。因为产物浓度太小，对后继实验同样也有影响，比如连接、标记实验等等就很不爽，往往不得不再浓缩一次，增加了操作的复杂性。此外，极微量的纯化介质或者是某些试剂混入回收产物中也会对结果产生致命的影响。 回收率：回收得率，是我们考虑的另一个重要参数。由于上电泳的样品量通常都很少，电泳的过程本身也会导致样品的分散和损失，因而尽可能多的回收电泳凝胶条带中的目的片断，提高产物得率，对于后继实验来说是非常重要的。回收率的多少通常和回收产物的大小以及量的多少有关，比如DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低;又比如说，DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。因此，根据情况选择不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于样品的大小和多少对回收率都有显著的影响，所以回收率并非是一成不变的。 其他：操作方面，相信大家都会比较喜欢操作简单，快速，应用起来方便的方法或者产品。比如溶胶的缓冲液中添加指示剂，可以指示溶胶的溶液pH值就是很方便的设计;离心过柱就比离心沉淀要简单方便。载量，就是每次回收最多能回收的产物的量。这个自然是越大越好了，因为对于纯化柱或者一定量的纯化介质，过量的产物吸附不了就是被浪费掉的。难免有时你需要回收比较大量的产物，大载量就很有优势——同一个片断你要用2个柱子，多郁闷啊。
琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法20世纪70年代是一个奠定现代分子生物学的时代，1973年冷泉港实验室的Joseph Sambroo k和Phillip Sharp发明了利用琼脂糖凝胶分离DNA 和EB染料观测DNA 相结合的技术。现在，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化核酸和蛋白质片断的标准方法。这里首先介绍的是琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法： 1.柱回收试剂盒：可谓目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。 2.玻璃奶/纯化填料胶回收试剂盒：这个方法比前面的方法更为灵活，可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。前面的操作步骤和上者一样，将电泳凝胶的条带切下，Buffer溶解，（区别在于这里）加入纯化填料填料吸附混合，快速离心沉淀去上清，洗涤沉淀后，干燥沉淀，最后用洗脱液纯化介质中吸附的片断释放出来，离心，取上清，
就是回收的产物。这个方法适合各种不同大小的片断，特别是大片断的回收，但是操作就较前者复杂一些，涉及到多次离心沉淀和取上清，有可能会误吸了微量的沉淀；另外干燥的程度也有点技巧，干过了不好洗脱，没干透又影响结果。后来的改进版本有将混合了纯化介质后的凝胶溶解液加入到一种离心过滤柱上，这种柱子不带纯化填料，只有一层过滤膜，离心过滤后，填料在柱子里，溶液被甩掉，这样就避免了上述的问题。 3.低熔点琼脂糖：传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法需要用到酚氯仿等有机试剂，由于乙醇沉淀需时较长，现在用的人已经不多了。想当年经费紧张的时候，低熔点琼脂糖贵，不舍得这么浪费的，比较取巧省钱的法子就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再将那块家伙切出来，就可以非常非常节约了。除了直接酚抽低熔点琼脂糖凝胶，还有人用琼脂糖酶来消化琼脂糖凝胶，条件也相当温和，只是那酶价格并不便宜（光那酶的成本就至少5-6块，还不算其他的麻烦事），多数的酶只适合用低熔点琼脂糖，问题是我不用酶也可以直接酚抽，费时间还特长，所以，并不觉得特别好用。后来据说T家的琼脂糖酶可以用于常规琼脂糖，前提是你有办法在65度把那胶化了。但那需要极好的耐心。
PCR操作时应注意的事项 PCR检测微量感染因子时，容易因为污染的而导致各种问题，因此，进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。 （1）划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： ①标本处理区，包括扩增摸板的制备； ②PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增； ③产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR 扩增→产物分析→产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （2）分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA： ①PCR用水应为高压的双蒸水； ②引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制； ③引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 (3) 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意： ①戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； ②使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； ③避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； ④操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； ⑤最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； ⑥操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； ⑦尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； ⑧重复实验，验证结果，慎下结论。 威斯腾生物400 675 6758
除了选择合适的方法外,实验中还要注意以下几点: (1)防止抽提过程中污染DNA酶 与回收片段接触的试剂与器皿等都应进行灭菌(酶)处理,即使是不能用干热或湿热法灭菌的器皿也要用乙醇浸泡以灭杀活菌与DNA酶,不然可能发生回收片段部分降解的现象,有时甚至一无所获.即使是轻微的降解反应——当发生在粘性末 端时也会导致严重的连接困难. (2)紫外照射选择长波段 回收过程往往需在紫外等监测下进行,与一般观察电泳结果不同的是这时应用长波紫外灯.因为短波紫外线(254nm)会引起DNA的断裂或是形成TT二聚体,前者会使以后的连接与转化等实验失败,后者可能造成基因突变,给克隆工作带来麻烦.即使是使用了长波紫外照射,回收DNA时也要尽量短时照射,避免连续长时间照射. (3)实验操作要轻柔 特别在处理较大片段时应防止机械剪切作用DNA对的破坏,如吸取液体,转动离 心管等操作均应缓慢,轻柔. 综上所述,只有在合适的回收方法基础上注意具体操作步骤是才能有效回收所需片段,为以后的酶切,连接,标记等工作打下良好基础. 3 实验步骤 一、试剂盒法(Kit回收法,以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例) (1)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小,提供后续回收效率) (2)凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN) (3)凝胶溶解:55-60℃,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀. (4)将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒. (5)取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟. (6)重复步骤5一次. (7)取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm 离心2分钟. (8)将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放 置2分钟. (9)盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA 片段. 胶回收 一. 提高胶回收量的办法： 1) 增加电泳时的上样量。 2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。
逆转录RT-PCR操作注意事项 RT-PCR操作有三步： 第一，RNA提纯； 第二，RT逆转录； 第三，PCR聚合酶反应 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2.RT按要求做，一般不会出太大问题。 3.PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计有3种方法: a：Random 9mers； b：OligodT-Adaptor Primer； c：特异的下游引物。 如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？https://www.doczj.com/doc/7d16602025.html, 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5'，3'RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。 3.RACE 我做过RACE（3'RACE是宝生物的Kit；5'RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3'RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3'UTR却怎么也扩不出来，我推测是不是该基因的3'UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。 有关内参的几点建议： 一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的。 （1）半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量；
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
DNA凝胶电泳简介 一、实验原理 DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。 2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。 二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。 表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围 由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。 随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。（5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
精品好文档，推荐学习交流 切胶回收的步骤 1．琼脂糖凝胶电泳目的基因，紫外灯下切除含有目的基因的琼脂糖，用纸巾吸尽凝胶表面的液体，尽量减少不含目的基因的凝胶量，称重（1mg=1ul） 2．尽量切碎凝胶 3．向离心管中加入3倍体积的NAL溶液，55（视具体胶定）度加热，使凝胶完全融化， 4．按每20ul硅胶树脂结合（树脂使用前要充分混匀）约3ugDNA加入适量比例的硅胶树脂，充分混合，室温放置20min， 5．10000rpm离心1分钟，去上清（上清液暂保存，如回收率不过可重复4） 6．加入800ul清洗液（清洗液加入56ml100%的无水乙醇），振荡混匀后，室温静置10min，10000rpm离心1分钟，去上清 7．重复步骤6，尽量去除上清，完全风干至不残留乙醇味道； 8．加入和硅胶树脂等体积的TEbuffer或灭菌蒸馏水混匀，55度水浴20min 9．10000rpm离心1分钟，吸上清为DNA回收液， 重复8，9初一语文讲义 辨析和修改病句的基本方法 辨析并修改病句是语文实际运用能力的具体表现之一，也是中考中长“考”不衰的常青树。本专题主要就是帮助学生了解句子的致病原因，掌握辨析和修改病句的基本方法，提高“诊断和施治”的能力。 “病句的辨析及修改”是近年来各地中考的重点，也是难点。这类题的主要考查方法有客观题和主观题两种。病句的辨析一般以客观选择题出现。这是一种比较传统的考察题型，它面广量大，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢1
精品好文档，推荐学习交流 以思维见长，是近年中考中常见的题型，也是学生最易失分的题目，这就要求同学们复习过程中要重视这一类题的复习和训练。 主观题多指修改性的题目，多用于对句子或文段的修改。不仅要求学生们了解这是病句，是什么样的病句，而且要求知道如何修改，难度更大。目前学生对病句尚处于感性认识的阶段，而且这种认识是分散和不完全的，往往还不能自觉地综合应用，这一专题的复习指导是非常必要的。 一、何为“病句” 如果一个句子文不从，字不顺，不合乎语法规范，那它就有语病。通俗地说就是，凡是读起来不通顺，感觉别扭、含混不清的句子都是病句。 二、如何辨析病句 （1）感读——凭语感，凡是读起来别扭，听起来含混的，就可能有语病。 如：她有一个女儿，同许多年轻的妈妈一样，愿意把孩子打扮的漂亮一些。 10． 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2
相对定量方法实际操作 （常用方法） 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 F=2— 待检样品看 家基因平均 Ct值 对照组目的 基因平均Ct 值 对照组看家 基因平均Ct 值 — 待检样品目 的基因平均 Ct值 ——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。 反之，如果M差值大于，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例： 如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为和，两者的差值<，因此，
PCR 一、PCR的原理 PCR，Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明。该技术基本原理如下： 在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下，依赖于DNA polymerase的酶促合成反应。DNA polymerase以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端(退火),并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环。 1.PCR反应的基本成分 包括：Templates DNA(待扩增DNA)、Primers、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的Buffer(对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO)。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃或60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下，以dNTPs为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，新链又可成为下次循环的模板。 3.PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示实际扩增效率，平均约为75%，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。如果进行30个Cycles，实际扩增倍数往往为106-107（理论上以Y=2n计算，为109）。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有
影响PCR的主要因素 PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 一、温度循环参数 在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。 关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。 1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。 2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式进行计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果（G+C）%含量为50%时，则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成，长时间退火没有必要。 3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100～300bp之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的DNA 片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min，与此同时，在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。 4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。 扩增结束后，样品冷却并置4℃保存。 二、引物引物设计 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。
完成PCR实验注意事项 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。 PCR操作时应注意事项 PCR检测微量感染因子时，容易因为污染而导致各种问题，因此，进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染出现。 （1）划分操作区 目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： ①标本处理区，包括：扩增摸板制备； ② PCR扩增区，包括：反应液的配制和PCR扩增； ③产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆制备。 ※各工作区要具有一定隔离，操作器材专用，要有一定方向性，如，标本制备→PCR扩 增→产物分析→产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （2）分装试剂 PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装，所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源DNA： ①PCR用水应为高压的双蒸水； ②引物和d-NTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制； ③引物和d-NTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 （3）实验操作注意事项 尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意。 ②一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； ②使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； ③避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； ④操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； ⑤最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； ⑥操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增
D N A胶回收中常见问题 和解答 TYYGROUP system office room 【TYYUA16H-TYY-TYYYUA8Q8-
1、如何计算提取率？ 1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率； 2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比； 3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。 2、如何简易测算提取率？ 取胶回收后的DNA溶液体积的1/5—1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5-10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。 3、如何看待提取得率？ 影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。 4、回收率为什么与点样量和片段大小有关？ DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。 5、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？
1）胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例； 2）胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收； 3）紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内； 4）洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率； 5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好； 6）回收前的样品量太少，加大点样量； 7）洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。 6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？ 1）胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶； 2）胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收； 3）水浴温度是否达到规定温度65℃，用温度计检测。 7、琼脂糖凝胶块不溶？ 1）琼脂糖质量不好； 2）含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃；
实验六 PCR产物胶回收实验 一、实验目的 1. 掌握胶回收的常规操作 2. 了解胶回收PCR产物的目的 二、实验原理 利用胶回收试剂盒纯化PCR产物。本试剂盒提供一个从TBE或TAE电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶中提取高质量DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度≤3%，高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回收率最大为99%，大于10kbDNA片段回收率为20~70%。回收的基因组DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学实验。 三、试剂及配套设备和材料 3.1 试剂 Extraction buffer Wash buffer Elution buffer 3.2 配套设备和材料 无菌1.5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头 无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc (pH 5.0) 离心机 四、基本技术参数 五、操作步骤 1. 用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5或 2.0 ml离心管中。 请尽量切去不包含DNA片段的凝胶。一般情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul （50ul为最终洗脱体积）。
2. 按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入Extraction buffer。 例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer。对于每人份试剂用量，凝胶质量不能超过400mg。 3. 于恒温水浴或金属浴中50℃温育，直到凝胶融化。 一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔2-3分钟混匀一次。如果温育后，混合液体颜色变紫，请加入10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混合液颜色变回黄色。 4. 可选：按1：1的比例（凝胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混合均匀。 如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加异丙醇。 5. 将混合液全部转移到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内液体。 如混合液体积大于750ul可先转移750ul，其余的液体待离心弃液后，再转移。 6. 向Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。 7. 向Spin column内加750ul Wash Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去接液管内液体。 如果回收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置2~5分钟，再离心。 8. 再次于12,000 rpm离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1.5ml离心管中。 如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。 9. 向Spin column内加50ul Elution Buffer、水或TE溶液，并于室温静置1分钟。 可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。但不要低于20ul。 10. 于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段。 回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20℃。 六、注意事项 1. 为了保证没有外源DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌。 2. 为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引起的一些后续麻烦。