方法
2.3.5 细菌的生理生化鉴定
１、形态学观察
采用插片法、埋片法, 对该拮抗细菌的菌落形态特征作镜检观察。用革兰氏染色进行油镜观察。
①革兰氏染色
溶液和试剂：革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等。
试验步骤：(1) 涂片：取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不易过厚）、干燥和固定。
(2) 初染：滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位1～２min，用水冲洗至流出水无色。
(3) 媒染：先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖１min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
(4) 脱色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液（一般20～30s），当脱色至流出液无色时立即用水洗去乙醇。
(5) 复染：将玻片上残留水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2min，水洗，用吸水纸吸去残水晾干。
(6) 镜检：用油镜观察。
②芽孢染色
(1) 制片：按常规方法涂片、干燥及固定。
(2) 加热染色：向载玻片滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持５min，加热时应注意补充染液，切勿让涂片干涸。
脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水无色。
(3) 复染：用0.5%番红水溶液复染2min。
(4) 水洗：用缓流自来水冲洗至无色。
(5) 镜检：晾干载玻片后油镜镜检。
③鞭毛染色（硝酸银染色法）
(1) 载玻片准备：将载玻片置于含洗衣粉或洗涤剂的水中煮沸20min，然后用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，使用时取出在火焰上烧去乙醇及可能残留的油迹。
(2) 菌液制备：用接种环挑取菌落边缘菌体，悬浮于1～2mL无菌水中制成菌悬液，不能剧烈震荡。
(3) 制片：取一滴菌悬液滴到载玻片一侧，倾斜玻片，使菌悬液流向另一边，用吸水纸吸取多余的菌悬液，自然干燥。
(4) 染色：滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，期间可用微火加热，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。
(5) 镜检：用油镜镜检观察。
A、B液需现用现配（4h内效果最佳，1d内可用）：
A：单宁酸5ｇ，三氯化铁1.5ｇ，蒸馏水100mL，加1%氢氧化钠1mL，15%甲醛2mL。
B：硝酸银粉末2ｇ，水100mL，溶解匀均，取出10mL回滴用，往90mL
溶液中加浓氨水到出现大量沉淀时再加浓氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出现薄雾。
２、糖类分解试验
配方：蛋白胨 1.0ｇ；NaCl 0.5ｇ；0.2%溴百里香酚兰 1.2mL；葡萄糖 1.0ｇ；蒸馏水100mL。
基本原理：糖类分解实验是常用的鉴别微生物的生化反应，鉴定细菌能否利用分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氨气、甲烷、二氧化碳等）。当发酵产酸是，指示剂可有紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的小管中有无气泡来证明。
试验步骤：用记号笔在试管外面分别标明发酵培养基名称和所接种的细菌的编号。取盛有葡萄糖发酵培养基的试管，按编号接种细菌，每种细菌做两个平行，可留一个空白，作为对照。在接种后要轻摇试管，防止倒置的小试管进入气泡。再将将上述已接种的和对照管置37℃温室中培养2～3d。观察颜色变化及小试管中有无气泡。
３、V-P试验
配方：蛋白胨 1.5g；葡萄糖1.5g；K2HPO4 1.5g；蒸馏水300mL；pH：7.4基本原理：此实验也是常用的检验细菌的生化反应之一。某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境再被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基生成红色化合物，称
V-P反应。
试验步骤：将被检菌接种于试验培养基中，培养2～7d后，于培养物中加入1mL 10％的NaOH，混匀，再加入3～4滴2% 氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。
４、甲基红试验
配方：与V-P试验的配方相同
基本原理：某些细菌在糖代谢过程中，会分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸还可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH将至4.5以下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量小，或者产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、酮、醚、气体和水等），则培养基的酸度仍会在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。
试验步骤：接种细菌于培养基，在37℃培养2～7d后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1ｇ甲基经溶于300mL 95% 乙醇中，加蒸馏水至500 mL），如呈红色，表示阳性。
５、柠檬酸盐利用试验
配方：柠檬酸钠1ｇ；硫酸镁0.2ｇ；NaCl 5ｇ；NH4H2PO41ｇ；K2HPO4 1ｇ；琼脂20ｇ；1％溴麝香草酚蓝酒精溶液10mL；蒸馏水1000mL。
基本原理：柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐能否被利用。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，是培养基的pH升高，当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会有绿色转变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.5～7.0时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。试验步骤：将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2～4d，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。
６、硝酸盐还原试验
配方：硝酸钾0.2ｇ；蛋白胨5ｇ；蒸馏水1000mL；pH：7.4。
甲液：４-苯胺磺酸（对氨基苯磺酸）0.4ｇ；5mol/L冰醋酸50mL。
乙液：α-萘胺0.25ｇ；5mol/L冰醋酸50mL。
基本原理：某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的４-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘胺结合生成N-α萘胺偶苯磺酸。
试验步骤：将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1～2d，每管中先加入甲试剂0.1mL，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。
注：本试验阴性的原因有三：细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。
７、淀粉水解试验
配方：牛肉膏0.5ｇ；蛋白胨1ｇ；氯化钠0.5ｇ；可溶性淀粉0.2ｇ；蒸馏水100mL；琼脂2ｇ；pH：7.0～7.2。
基本原理：有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。
试验步骤：将细菌划线接种于平板上，37℃左右培养1～2d，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环，培养基会呈深蓝色。
８、吲哚（靛基质）试验
配方：蛋白胨1ｇ；NaCl 0.5ｇ；蒸馏水1000mL；pH：7.6。
吲哚试剂自行配制：对二甲基氨基苯甲醛0.5g；乙醇（95%）47.5mL；浓盐酸10mL。
基本原理：有些细菌可以产生色氨酸酶，分解色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚与二甲基氨基苯甲醛反应生成红色的玫瑰吲哚，因此可根据细菌能否分解色氨酸产生吲哚来鉴定菌种。
试验步骤：将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1～2d。于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3mL，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入吲哚试
剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。
９、接触酶试验
配方：牛肉膏蛋白胨培养基
基本原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。
试验步骤：将1ml 3% 的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量（30%），再用清洁无菌的
细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2
液面下，有气泡者为阳性。也可在玻片上滴一滴H2O2蘸取少许培养物，混合，
有气泡者为阳性。
2.3.6 确定菌种类型
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》( Buchanan ＆Gibbons，1984) 和《常见
细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英，1999) 确定菌种类型。
结果
3.3 菌株的生理生化鉴定
3.3.1 菌落的特征分析
通过显微镜观察菌落形态特征，结果见表3。
表3 拮抗细菌K1、K2与K3的菌落特征
菌株K1K2K3
形状椭圆状圆形杆状革兰氏染色阴性阴性阴性芽孢无无无
菌落形态椭圆形圆形梅花形菌落颜色乳白浅黄棕黄菌落隆起度凸起凸起凸起菌落边缘形状光滑光滑粗糙菌落表面状态光滑光滑光滑
K2
菌落光泽 有光泽 有光泽 无光泽 菌落干湿程度 干燥 湿润
干燥 菌落透明程度
不透明
不透明
不透明
3.3.2 菌株的生理生化鉴定
糖类分解试验 V-P 试验 甲基红试验
硝酸盐还原试验 淀粉水解试验
K1
K2
K1 K1
K1 K1
K1
K1
K2 K2
K2 K2 K2
K2
K3
K3
K3
K3
K3
K3
吲哚（靛基质）试验柠檬酸盐利用试验
K1 K2 K3
接触酶试验
图3 拮抗细菌K1、K2与K3的生理生化特征
表４细菌的生理生化鉴定结果
菌种K1 K2 K3 糖类分解试验＋－＋V-P试验＋＋＋
甲基红试验－－－硝酸盐还原试验＋＋＋淀粉水解试验＋＋＋
吲哚（靛基质）试验＋＋＋
柠檬酸盐利用试验－＋＋接触酶试验＋＋＋注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性，由于糖类分解试验都没有产生气泡，所以这里显示的是能否产酸。
根据细菌的菌落形态及生理生化特征，再参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步推测K1为土壤杆菌属，K2为固氮菌属，K3为动胶菌属。如若准确判断，还需进行16S rDNA序列测定。
一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC的原理。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 三、实验材料 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn）， 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。 2.培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品 平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。 四、实验步骤 1.淀粉水解实验 （1）培养基制备 将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
1、氧化酶巴氏杆菌 1、原理： 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。 2、试剂 盐酸二甲基对苯撑二胺(或四甲基对苯撑二胺)1%水溶液于茶色瓶中在冰箱中贮存。 3、方法 在干净培养皿里放一张滤纸，滴上二甲基对苯撑二胺的1%水溶液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿，用金丝接种环(不可用镍铬丝)取18~24 h的菌苔，涂沫在湿润的滤纸上，在10 s内涂抹的菌苔现红色者为阳性，（四甲基对苯撑二胺为蓝色）10~60 s现红色者为延迟反应，60 s以上现红色者不计，按阴性处理。 4、注意事项： a.盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。 b.铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。 c.在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。 2、苯丙氨酸脱氨酶变形杆菌 1、原理： 某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。 2、培养基 酵母膏3g NaCl 5g Na2HPO4 1g DL-苯丙氨酸2g (或L-苯丙氨酸) 1g 蒸馏水1000 ml pH为7.0，分装试管，121℃蒸气灭菌10min,摆成长斜面。
3、试剂 10%(W/V)的FeCl3溶液 4、方法 适当浓度接种，37℃培养4h或8~24h测定。将试剂4~5滴滴到生长菌的斜面上，当斜面上和冷凝水中产生绿色时为阳性反应，即表明己形成了苯丙酮酸，不变则为阴性。 3、H2S(TSI) 变形杆菌鸡白痢沙门氏 1、原理： 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 2、培养基： 牛肉膏7.5g 蛋白胨10g NaCl 5g 明胶100~120g(或琼脂15g) 10%FeCl2 (培养基灭菌后无菌加入) 5 ml 蒸馏水1000 ml pH 7.0，112℃灭菌20min 在明胶培养基尚未凝固时，加入新制备的过滤灭菌的FeCl2，用无菌试管分装，培养基高度约为4~5 cm，立即置冷水冷却凝固。 3、方法 用穿刺法接种，30℃培养，1、3、7天，观察，变黑者为阳性，不变为阴性。 4、注意事项 ①此方法适用于肠杆菌科细菌鉴定 ②在实验过程中可用硫酸亚铁代替氯化亚铁 ③可同时测定明胶液化，20℃培养 4、DNA酶金黄色葡萄球菌 1、培养基 酪朊水解物15g 大豆蛋白胨5g NaCl 5g DNA 2g 甲苯胺蓝0.1g 琼脂15g 蒸馏水1000 ml
实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.
左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．
左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．
１、糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。 ２、淀粉水解试验 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。 3 、明胶液化试验 有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。 试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。 4 、石蕊牛奶试验有些微生物能水解牛奶中蛋白质酪素，酪素水解可有石蕊牛奶检测，石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是浑浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常用来检测乳糖发酵，有酸石蕊会转变为粉红色，过量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成）。氨基酸分解会引起碱性反应使石蕊变为紫色。某些细菌能还原石蕊使试管底部变为白色。 试验方法：取两支石蕊牛奶培养基试管，以无菌操作分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌，置35℃恒温箱中，培养24~38h。观察培养基颜色。石蕊酸性时为粉红色，碱性为紫色，还原后为无色。 ５、靛基质试验 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs 氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。 6 、硫化氢（H2S）试验 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐
小黑豆相关生理指标测定 1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。 株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。 主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。 叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。 2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）和H2O2含量测定 样品处理：取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA）、可溶性糖和H2O2含量测定。 总蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X代表可溶性糖含量（ug）) 蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O）.注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。 丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式为：MDA（umol/L）=6.45OD532-0.56OD450. 反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品，80℃水浴10min后，测OD532和OD450。对照用Tris-HCl. 0.6%TBA配方：称取硫代巴比妥0.6g，溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解后用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸馏水中，待其溶解即可）定容至100ml。 H2O2测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10）+150ul样品提取液），30℃水浴30min，测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560，X代表H2O2含量)
菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑 实验三细菌生理生化鉴定-LOPAT试验 一、实验目的： 1）了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定lopat实验方法 二、实验材料： 猕猴桃溃疡病病原菌（分类地位薄壁菌门Gracilicutes，Proteobacteria纲假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞杆菌属Pseudomonas）、SPA培养基：蔗糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml 对照SPA培养基：葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml Thornley培养基配方：蛋白胨1g，精氨酸10g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，酚红0.01g，琼脂6g，蒸馏水1000ml 1%二甲基对苯二胺盐酸盐，3×108 /ml的菌液（病原菌），烟草，马铃薯； 灭菌培养皿及培养基（平板）110套、未灭菌培养皿110套，接种针15个，试管110支，接种针55把，滤纸55张，试剂瓶55个，胶头滴管55支，喷壶55个 三、试验方法： 果聚糖试验（Levan formation）： 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，再用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。 在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。 氧化酶试验（oxidase reaction）： 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。 在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应 氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶 马铃薯软腐试验（potato erroring capacity）： 在马铃薯上做刺伤伤口，将细菌接到伤口上，几天后观察，是否出现软腐。 精氨酸双水解酶检验（argine reaction）： 配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌，冷却，针刺接种细菌至培养基底部，立即用凡士林封管，在27℃条件下培养7 d。 在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。 细菌的精氨酸双水解作用是将精氨酸经过两步水解，生成有机胺和无机氨。鉴定细菌的精氨酸试验，无论发酵菌还是非发酵菌，革兰阳性菌还是革兰阴性菌，测的都是精氨酸双水解酶，使用脱羧酶试验培养基。所以，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶用同一种基础培养基，为Moeller配方或Falkow配方，均须加盖石蜡油。对于发酵菌，细菌生长后，培养基变黄为阴性，变紫为阳性；对非发酵菌，培养基颜色不变为阴性，变黄为阳性。另有一种精氨酸双水解酶专用培养基，其中使用的是酚红指示剂。这种配方目前已不使用。细菌生化反应表中的精氨酸双水解酶的阳性百分率也不是在这种培养基上做的，所以，该配方实际已淘汰。 烟草过敏性反应（tobacoo hypersensitivity）：
细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.
左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．
左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．
小黑豆相关生理指标测定 1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测 6个重复。 株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。 主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。 叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。 2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定 样品处理:取 0.5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含量测定。 总蛋白测定(Bradford 法 :样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 , 空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空白对照 (1ml 蒽酮 +180ul ddH2O , 测定 OD625后带入标准曲线 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug
山东大学实验报告2017年12月4日 ___________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康 一、目的要求 1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的 酶系统。 2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、基本原理 1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。 （1）吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。 （2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 （3）伏-普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉
实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应 16111202班史政伟1120122681 一、实验目的 1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。 2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。 3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。 1.糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。 2.甲基红试验（M.R试验） 甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。 3.Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验） 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。 4.靛基质试验 某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。 5.硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。 6.明胶液化实验 明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。有些微生物可产生一种成为明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4 度仍能保持液化状态。 7.柠檬酸盐利用试验 有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂 pH6.0(黄)～7.6(蓝)，由绿色变为深蓝色。 8.淀粉水解实验 细菌水解淀粉的过程可以通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 三、实验仪器、材料和用具 实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱； 微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；
血常规 1．红细胞（RBC或BLC）参考值：3.8~5.1*10^12 生理功能：（附1） 1、运输氧、二氧化碳、电解质、葡萄糖以及人体排出来的废物新陈代谢所必须的物 质；酸碱平衡功能（血红蛋白Fe2+） 2、吞噬细胞样的功能，在其细胞膜表面具有过氧化物酶，该酶是典型的溶酶体酶， 它可起着巨噬细胞样的杀伤作用。 3、免疫粘附功能：抗原-抗体复合物与补体C3b结合后，可粘附于灵长目或非灵长 目的红细胞与血小板上（C3b受体）；清除免疫复合物的特性是白细胞和淋巴细胞 所不及的。 4、防御感染：细胞与细菌、病毒等微生物免疫粘附后，不仅可以通过过氧化物酶对 它们产生直接的杀伤作用，而且还可以促进吞噬细胞对它们的吞噬作用。因此，红细胞的免疫功能可以看作是机体抗感染免疫的因素之一。 5、免疫功能：识别携带抗原；清除循环中免疫复合物；增强T细胞依赖反应；效应 细胞（B/T）样作用 增多：分为相对增多（呕吐、腹泻、多汗、多尿、大面积灼伤等所致绝对增多（真性红细胞增多症等），继发性：代偿性增多（缺氧等），非代偿性增多（肝细胞癌、卵巢癌、子宫肌瘤等肿瘤相关及肾盂积水、多囊肾、肾癌等肾脏相关）。 减少：生理性：≤15岁儿童、部分老年人、妊娠中晚期等；病理性：常见于缺铁性、溶血性、再生障碍性贫血及急、慢性失血等（生成过多、破坏过多、丢失过多）。 2．血红蛋白（HB或HGB）参考值：115~150g/L 生理功能：运输氧、二氧化碳、电解质、葡萄糖以及人体排出来的废物新陈代谢所必须的物质；酸碱平衡功能（血红蛋白Fe2+） 增多：
相对增多（呕吐、腹泻、多汗、多尿、大面积灼伤等所致）；绝对增多（真性红细胞增多症等）：生理性增多：见于高原居民、胎儿和新生儿、剧烈劳动、恐惧等；病理性增多：由于促红细胞生成素代偿性增多所致，见于严重的先天性及后天性心肺疾病和血管畸形，如法洛四联症、紫绀型先天性心脏病、阻塞性肺气肿、肺源性心脏病、肺动-静脉瘘以及携氧能力低的异常血红蛋白病等；某些肿瘤或肾脏疾病，如肾癌、肝细胞癌、肾胚胎瘤以及肾盂积水、多囊肾等 减少：轻度：血红蛋白<90g/L、中度：血红蛋白90～60g/L、重度：血红蛋白 60～30g/L、极重度：血红蛋白＜30g/L 生理性：≤15岁儿童、部分老年人、妊娠中晚期等；病理性：常见于缺铁性、溶血性、再生障碍性贫血及急、慢性失血等（生成过多、破坏过多、丢失过多） （1）红细胞压积（HCT）：参考值：0.35~0.45L/L一定量的抗凝全血经离心沉淀后，测得下沉的红细胞占全血的容积比。 增多：血液浓缩；其他同红细胞 降低：同红细胞 （2）平均红细胞体积（MCV）：参考值：82~100fL （3）平均红细胞血红蛋白量（MCH）参考值：27~34pg （4）平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）参考值：316~354g/L 平均红细胞血红蛋白浓度除了使用血红蛋白这个指标判断贫血外，还要参考红细胞数量，如二者比例失调，则需进一步参考平均红细胞体积，平均红细胞血红蛋白量及平均红细胞血红蛋白浓度及红细胞体积分布宽度，因不同病因引起的贫血，可使红细胞产生形态的变化，检查红细胞形态特点可协助临床寻找病因。 贫血形态学类型MCV(fl) MCH(pg) MCHC 病因举例 正常细胞性贫血82～95 27～31 320～360 急性失血，溶血，造血功能低下，白血病
细菌鉴定中常用的生理生化反应 录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验 柠檬酸盐培养基系一综合性培养基，其中柠檬酸钠为碳的唯一来源。而磷酸二氢按是氮的唯一来源。有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溟廖香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。 2、实验仪器，材料和用具 （1）实验仪器 37OC 恒温培养箱、20OC 恒温培养箱（室温代替）。 （2）微生物材料 大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌这四种菌种的斜面各1 支。 （3）试剂
干旱胁迫对植物生理生化指标的影响 摘要：水是生命之源，地球上任何生物的生存都离不开水。并且，很多生物在出现缺水时都表现出一系列相应的症状，特别是植物最明显。植物常常遭受的有害影响因素之一就是缺水，当植物消耗的水分无法从外界得到补充时，就会使植物体内的一些生理生化指标发生变化，如脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢 (H 2O 2 )、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)等的含量。实验通 过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量，我们通过测定这些指标含量的变化就可以知道干旱对植物的损伤有多严重。植物经常遭受干旱胁迫的危害，全世界干旱、半干旱地区的面积占总面积的43%，而中国更为严重，约占51.9%，因而研究植物的抗旱性尤为重要。由实验数据可知，当小麦受 到干旱胁迫时，小麦幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H 2O 2 )、多酚 氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)的含量均升高。 关键词：干旱、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H 2O 2 )、多酚氧化酶(PPO)、 过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH) 1.引言 1.1干旱及干旱对植物的影响 干旱化已成为世界性的问题，中国干旱半干旱地区面积为256．6×104km2，占国土面积的26.73％。在我国各干旱省份中，云南又属于干旱的省份之一。对植物影响的诸多自然因素中，干旱占首位。因此研究干旱对植物的影响就尤为重要，以利于应用于农作物上。在农业上可以采取植物的各种抗旱机制来抵抗干旱对农作物的损伤，才不致使庄稼减产，利于丰收。那么，究竟什么算干旱呢？就让我们来看看它的定义吧！ 当植物耗水大于吸水时，就会使组织内水分亏损，简而言之，过度水分亏缺的现象，称为干旱。干旱可分为大气干旱和土壤干旱。土壤干旱时，植物生长困难或完全停止，受害情况比大气严重。我国农业每年受旱灾面积达2500多万km2。[1] 水分在植物的生命活动中起着极大的作用,全世界由于水分亏缺导致的减产
常用生化试验 一．糖、醇发酵试验 1.糖、醇发酵试验原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气，有的仅产酸，而不产气。根据这些特点，可鉴别细菌。 培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。可根据试验的要求和细菌的特性来选择。 2.乙酰甲基甲醇试验（V-P 试验） 原理：某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的 a -萘酚为催化剂，可加速此反应，使反应颜色增加， 提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V-P 试验呈阴性。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 3.甲基红试验（MR 试验）原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH 降至 4.5 以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在PH6.2 以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 MUG 葡萄糖醛酸苷酶试验 原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4-甲基伞形酮-3 -D葡萄糖醛酸甘 （4-Methylumbelliferyl- 3 -D-glucuronide简称MUG ）的3葡萄糖醛酸甘键，使其水解，释 放的4-甲基伞形酮在366nm 紫外灯下产生蓝白色荧光。 培养基：MUG 培养基 4.3-半乳糖苷酶试验 原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和3-半乳糖苷酶两种不同的酶作用， 能水解邻硝酸酚-3-D 半乳糖苷（O-nitrophenyl- 3-D-galactopyranoside,ONPG ），而释放出黄色 的邻硝酸酚。发酵乳糖的细菌具有上述两种酶，可迅速分解乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌只有 3■半乳糖苷酶，而缺少半乳糖苷渗透酶或是其活性很弱，不能将乳糖很快运送到菌细胞内，
细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示： (一) 糖、醇发酵试验 原理： 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。 培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制： (NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。 测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意：以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果： 用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。 结果记录： 产酸：+，产气：○，不产酸长气：- 。 (二) 淀粉水解试验 原理： 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基配制： 牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法： 以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养
细菌的生理生化反应实验 一．目的与意义 一般来说，对一株从自然界或其他样品中分离纯化的未知菌种的鉴定要做以下几个方面工作。①个体形态观察，进行革兰氏染色，分辨是G（+）菌还是G（-）菌。并观察其形状、大小、有无芽孢及其位置等；②菌种形态观察，主要观察其形态、大小、边缘情况、隆起度、透明度、色泽、气味等特征；③做动力试验，看他能否运动及其鞭毛着生类型（端生、周生）；④做生理生化反应及做血清学反应实验。最后根据以上实验项目的结果，通过查阅微生物分类检索表，给未知菌进行命名。 此实验为生理生化反应实验，就是使不同种类的细菌在对营养物质的利用、代谢产物的种类、代谢类型等方面表现出差异，故利用这些差异作为细菌分类作为细菌分类鉴定的重要依据。要求在此实验中了解细菌在不同底物环境中各种代谢途径和产物，加深理解细菌生化反应原理；根据细菌在培养基中生理生化特点，学会鉴定细菌。 生理生化反应的项目很多。本实验结合肠道杆菌科的分类鉴定，选作其中重要的几项实验。 二．材料与用具 1.菌种：大肠杆菌、沙门氏菌。 2.培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）、葡萄糖蛋白胨水培养基、童汉氏蛋白胨水培养基、
柠檬酸盐斜面培养基（添加溴麝香草酚蓝变色范围pH6.8 绿—pH7.6 蓝）、三糖铁琼脂培养基。 3.试剂：甲基红指示剂、40%NaOH、吲哚检验试剂（对二甲基氨基苯甲醛）、双氧水等。 4.用具。酒精灯、接种环、接种针、试管等。 三．实验内容与方法 1.糖（醇）类发酵实验 多数细菌都能利用糖类作为碳源及能源，但各种菌因含有不同发酵糖（醇）类的酶，故表现出有的能分解或不分解某些糖类，有的分解糖产酸，并产气，或只产酸不产气，可根据这些特点鉴别细菌（培养基中指示剂溴甲酚紫pH6.8以上呈紫色，pH5.2以下呈黄色）。 大肠杆菌与沙门氏菌的生理生化鉴定区别 操作：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）中，无菌操作，穿刺接种，37℃培养1天。 记录：阴性—不产酸（紫色）；阳性—产酸（黄色）。 2.甲基红（M·R）实验 某些菌在糖代谢过程中，分解糖类，产生丙酮酸，继而再分解为各种酸，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性反应；若分解糖产酸少，或所产生的酸转换为其他物质，则培养基pH在4.5以上，加入指示剂呈黄色，为阴性。 操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37℃培养2天。观察时加入甲基橙试剂。
综合的部分常见菌鉴别试验 表1 常见产黄色素菌种的鉴别 菌名氧 化 酶 动 力 葡 萄 糖 吲 哚 硝 还 ONP G 麦 芽 糖 木 糖 七叶 苷 Mac 生长 少动鞘氨醇单胞+ + + - - + + + + - 浅黄金色单胞菌- + + - + + + + + + 栖稻黄色单胞菌- + + - - - + + - + 嗜麦芽窄食单胞- + + + + + - + + 食醇鞘氨醇杆菌+ - + - - + + + + + 多食鞘氨醇杆菌+ - + - - + + + + + 脑膜炎败血黄杆+ - + + - + + - + V 有毒威克斯菌+ - - + - - - - （+）- 短稳杆菌+ - + + - - + - - + 洋葱伯克霍尔德+/- - + + + + + + + 产吲哚金黄杆菌+ - + + + - + - + + 食醇鞘氨醇杆菌阿拉伯阴性,甘露醇阳性,多食鞘氨醇杆菌相反。（+），多数阳性；（-），多数阴性；V，不定；空缺的是暂时未查到确切结果。 表2葡萄球菌与其他革兰阳性球菌的鉴别 菌属严格 需氧四联 排列 紧粘 琼脂 动 力 触 酶 氧化 酶 厌氧葡 萄糖产 酸 杆菌 肽耐 药 呋喃唑 酮耐药 5.0％ NaCl琼 脂生长 葡萄球菌属－ d －－+ － d + －+ 气球菌属－+ －－－－（+）－－+ 动性球菌属+ d －+ + －－+ 口腔球菌属－ d + －±－+ －－－ 微球菌属+ + －－+ + －－+ + 注：杆菌肽0.04U/片，（+）为耐药，（-）为敏感，抑菌环10～25mm；呋喃唑酮100μg/片，抑菌环≤9mm为耐药（+），抑菌环15～35mm为敏感（-）。葡萄球菌、动性球菌、口腔球菌和微球菌都属微球菌科。 表3常见凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定