引物设计软件Oligo使用方法介绍荧光定量PCR仪|荧光定量PCR基因扩增仪
作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能，如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。
在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：
1、直接用键盘输入：
a、点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；
b、此时即可键入DNA序列；
c、如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。
2、利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件。html 格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。
3、如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA,GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。
点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。
进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6-碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6-碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA 时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5‘端稳定性是否稍高于3’端等。
一、普通引物对的搜索：
以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600-800bp
长的PCR产物。
1、点击“Search”菜单中的“For Primers and Probes”命令，进入引物搜索对话框；
2、由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs.
在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a、无二聚体；b、3‘端高度特异，GC含量有限定，d、去除错误引发引物等。
3、剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。
①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1-2000,下游引物的位置：100-2300;PCR产物的长度600-800bp.
②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同设定，参数以及更多参数。
③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。
④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE?（Prime Effitions,引发效率）。也可以限定所选引物对的最大数目。
⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt.其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters”窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。
4、点击“确认”-“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗
口。显示出得到的引物对数目。
5、点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。
6、点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5-6度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。
7、要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”,我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理，“Hairpin Formation”,“Composition and Tm”,“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。
需要说明的是，①如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；②引物一般尽量不要在3‘端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10;3,对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。
8、Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：
首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR.
单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”,选择路径及文件名即可。
二、测序引物的设计
在oligo中，测试引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。
还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600-800bp的位置设计一条测序引物。
Open-Search
在“Search”窗口中，选中“Sequence Rrimer”,同时去除负链Search的选中
在“Search Range”窗口，输入正链的600-800bp
在“Parameters”中选定very high，引物长度改为18bp
结果行到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。
三、探针的设计：
探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。
四、评估引物对：
我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR,往往很难重复别人的实验结果。这时就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案是肯定的。
1、点击File菜单中的New命令；
2、在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；
3、如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5‘端位置数字，如20;
4、点击Accept/Discard菜单的Accept命令；
5、如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；
6、选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；
7、从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；
8、在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；
9、选取“Accept and Quit”命令；
如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44%.
10、点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。
P C R仪使用手册 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
Biometra T gradient 用户手册 型号 050-810 T gradient48 050-811 T gradient96 Biometra biomedizinische Analytik GmbH Rudolf-Wissell-Str. 30, D-37079 Goettingen Tel.: 0551/50 686-0; Fax: 0551/50 686-66 email: 1 目录 1 目录 2 介绍 3 使用前 安全警告 警告标志 4 T gradient的初始操作步骤 T gradient前视图 T gradient后视图 T gradient控制板 初始自检 T gradient的显示 操作可调节的热盖
盖子卡住时如何放开转轮 5 创建一个程序 选择一个目录 选择一个程序储存库 输入子目录的名称 输入程序名 输入热盖的温度 选择/取消热盖预热 输入温度和时间设置 设置温度梯度 查看模块的温度梯度值 设置循环次数 冷却到环境温度以下 储存程序 6 浏览/编辑程序数据 删除/插入程序档 拷贝程序 删除程序 7 其他选项的设置 设置时间增量 设置“触地”（touch down）PCR 调节加热和冷却坡度
8 运行程序 选择和开始程序 操作过程中的显示 浏览剩余的运行时间 察看当前的温度梯度 暂停/停止程序 9 特别功能 打印协议 警报声的开关 选择语言 标准模式/测试模式 RS232-控制器 10 微板的密封 在PCR中密封微板 取下热封膜 11 维护 12 问题解答 减慢加热和冷却的速度 由于断电重新启动 来自其他PCR仪的协议的更改13. Tg radient 96技术参数 2 介绍
实时荧光定量PCR实验体系的设计与优化 实时荧光定量PCR以其精确、快速、方便，越来越多的应用在科研、临床及检验检疫的各个领域。但是定量PCR是对精确性要求很高的实验，不仅要求在实验前有比较完整的实验设计方案，而且实验的条件对实验结果的影响也非常大。这些都是很多老师与学生非常关心的问题，下面分别从这两个方面来对定量PCR实验做一些阐述。 定量PCR实验步骤（以m RNA为例）： 1.设计实验方案：例如对样品、实验组和对照组的一个实验流程设计 2.引物和探针的设计和合成 3.抽提RNA，测定提取的RNA的浓度 4.反转录PCR 5.定量PCR 6.数据分析 在进行定量PCR实验的过程中，PCR的扩增效率是一个非常重要的影响因素，因为定量PCR原理的理论方程是基于扩增效率最大值1，因此高的扩增效率能保证定量PCR实验的精确性及重复性，影响PCR扩增效率主要有以下几个方面：1，扩增子的长度；2，扩增子的GC含量；3，扩增子、引物和探针的二级结构；4，PCR反应各组分的浓度；5，RNA或者c DNA的纯度。 进行定量PCR实验时，必须设计好引物和探针，除了能获得高的扩增效率外，对PCR扩增的特异性、消除DNA的扩增及提高扩增的灵敏度都有很大的影响。下图就是使用不同的引物和探针对18S RNA进行定量PCR的荧光曲线图（反应条件和模板都相同）。 引物设计原则： 1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守。 2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。 3.确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G 碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。5．跨外显子设计引物，用于区别或消除DNA的扩增。 探针设计的基本原则： 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm 值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。 7. 避免探针与引物之间形成二级结构。
ABI Veriti 梯度PCR仪使用说明 哈尔滨德远科技开发有限公司
操作步骤： 1、打开PCR仪的热盖，插入0.2ml的样品管。盖好热盖。 2、打开PCR仪的电源，仪器程序开始初始化，需等待几分钟。 3、初始化完成后，显示主菜单： 4、点“Browse/New Methods”，进入PCR程序列表：
5、可以直接点一个PCR程序，选择“Start Run”运行；点右边的符号，可以选 择不同的文件夹。如要新建一个PCR程序，点“New”，出现PCR程序： 6、添加一段程序：点中上方的“Stage”位置，该位置变红；再点“Add”，软件将 加入一段新的程序。
7、修改循环数、温度、时间：点中循环次数、温度或时间位置，下方出现数字键。 依次点数字键，出现合适数字后，点“Done”确定。 8、增加一个步骤：点“Step”位置，该位置变红；再点“Add”，软件将加入一个新的步骤。 9、删除一个步骤：点“Step”位置，在点“Delete”，软件将该步骤删除。
1）点中一个步骤，再点“Option”键，出现选项如下 2）点“VeriFlex step”，出现梯度创建窗口： 输入6个梯度温度，温度下方的“1－2”是指对应的1、2两行加热孔，全部输好后，点“Done”确定。注意：相邻的两个梯度温度之差最大不能超过5℃！
1）点中一个步骤，再点“Option”键，出现选项如下 2）点“Auto Delta”，出现渐变模式创建窗口。 点“Staring Cycle”，输入起始循环数；点“Delta Temperature”，输入温度变化值；点“Delta Time”，输入时间变化值。渐变模式适用于touchdown PCR，可以提高PCR 反应的特异性。例：输入起始循环数为2，温度变化值为＋0.5℃，时间变化值为＋5s，则表示从第2个循环开始，每循环一次升温0.5℃，时间增加5s。
荧光定量引物设计原则 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
引物的具体设计要求： 1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 +C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 ′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。 值在58-62度之间。 17.引物设计的软件Primer 有专门针对荧光的。 用染料做荧光定量不如探针特异性好，具体操作一下就知道了！ 可以多定几对引物，免得摸条件浪费时间和金钱！试剂很贵的！ 荧光定量PCR引物设计原则 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ① 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：℃+℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
Mastercycler Personal PCR仪操作手册
1 简介 Eppendorf的Mastercycler Personal是适用于所有分子生物学和生化实 验室研究的PCR仪。 样品温度在4-90度间快速可调（最大速度每秒3度）。 设计有特殊的“离心管控制”模式，从而对装有不同体积溶液的不同离心管中的样 本进行温度控制。 加热槽为一通用模块，可适用5X5的微孔板、25个0.2ml的Eppendorf PCR管、16个0.5ml薄壁的Eppendorf PCR管或其他相应的试管，而无须更换模块。 为避免样本蒸发浓缩，本仪器设计有可适应各种试管高度的热盖。 本仪器易于操作，有完整的八线显示，并可连接打印机。 Mastercycler Personal是Perkin-Elmer公司授权许可生产的PCR仪。 2 安全警告 3 安装 3.1 包装 一个包装内应含有以下物品： 1台小型PCR仪 1条主电源线 1本操作指南 1张个人存储卡 1包0.2mlPCR管（100个） 3.2 装机 安装时请确保通气孔通畅，四周有足够的空间散热；并请确保仪器下部无其他异物。 搬动仪器时无须其他装置，可抓住仪器两侧将其提起。 所需空间：宽 18cm 深：35cm 高： 25cm 电源连接：1个防电击插座。 如需连接打印机，则需用另一电源连接。 3.3 启动仪器 拆除热盖上的胶条并取出热盖下的泡沫塑料。 连接电源线。启动仪器前请核对用户电源是否与铭牌要求相符。 连接和启动打印机的步骤见第9部分。 4 技术说明 4.1 仪器结构 图1：前面观 1 热盖 2 热盖锁 3 显示与控制面板 4 个人存储卡读取器
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域 内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长 度相似。 16.TM值在58-62度之间。 17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： ①引物长度 一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。 在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃ 在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。
一. 开机 打开 PCR 仪的电源，需等待一小段时间，大概几十秒，仪器程序开始初始化。初始化完成后，显示主菜单， 二. 建立新方法 1. 点击“N ew Methods ”，进入以下界面，点击“open template ”进入创建程序界面，可以通过已存在的模板创建程序，如果没有使用其中的模板， 请选择“Blank Template ”，在选择“General PCR ”进入下边第三幅图界面。 2. 温度，时间，循环等体积等的设置：点击”Edit ”进入如下“edit ”界面，可以通过点击页面上的步骤温度、时间、热盖温度、反应体积和循环数，来设定每个步骤时间和温度；点击“Save ”保存当前程序，可以设定程序名称，保存位置。程序保存后选择模块，直接运行程序。
3. 添加步骤和阶段。点击“Manage Stages ”进入如下界面，点击“Add Stage ”出现“+”，点击“+”则在该Stage 之前添加一个相同的Stage ，点击“Remove Stage ”在程序界面上出现“-”，点击“-”则移除当前Stage ；点击“add step ”出现“+”，点击“+”则在该Step 之前添加一个相同的Step ，点击“Remove Step ”在程序界面上出现“-”，点击“-”则移除当前Step ； 4. 高级设置。点击“Advanced Options ”进入高等设置界面，如下图： 点击“Simulation Mode ”进入模拟界面，可以选择需要模拟的机器。当选择模拟机器时，仪器的变温速率是不可以调整的。 通过“VeriFlex ”设定仪器的梯度，点击，设置梯度，两个梯度范围间隔最小0.1℃，最大5℃ 三、运行已有的程序 点击“Open method ”，进入“Select Method ”菜单项，选择左侧的文件夹，查看文件夹中的程序，选择要运行的程序直接点击，进入程序界面，在此界面下也可以对程序进行编辑，如果无需编辑选择要使用的模块，直接点击“Start RUN ”,运行当前程序。
PCR仪使用说明及注意事项开机：PCR仪的开关在仪器的背面 将开关打开后仪器显示如下界面 F1（Run）选择一个程序并开始运行； F2（Create）Ｆ3（Ｅdit）建立一个新程序或修改已有程序； Ｆ４(Ｕtil) 查看仪器最后运行的程序； Ｆ５（Ｕser）建立、编辑或删除新用户。 建立新用户：
选择Ｆ５ 选择Ｆ２ 用户名可以用字母、数字或它们的组合命名，通过方向键选择字母、通过数字键选择数字。 命名完成后选择Ｆ１，用户名建立完成。 程序设置：1、新建程序 选择用户名后，选择Ｆ２
通过光标移动及数字键设定程序的各个参数（包括各反应阶段的事件、温度及循环数），完成后选择Ｆ２储存程序，出现以下界面，选择Ｆ３为程序命名 选择Ｆ１保存。 ２、编辑程序：在主菜单的界面下选择Ｆ２，选择需要编辑的程序 选择Ｆ１编辑 编辑完成后，选择Ｆ２保存程序信息。 运行程序：在主菜单下选择Ｆ１，然后选择运行的程序 选择Ｆ１
在此界面下需确定样品的体积，选择Ｆ１开始运行。 程序运行结束后出现以下界面 退出到主菜单，取出样品并关闭电源。 注意事项： １、使用PCR仪需提前预订，预订的程序要标明退火温度和延伸时间：如果不用要及时取消或通知接下来要做的人。 ２、不得无故拖延反应开始的时间，如无故拖延超过半小时，该时间段即刻取消，其他同学可协商使用。 ３、PCR反应结束后请及时收取PCR产物，或交代同学及时帮忙收取。若后续反应不能及时跟上，请务必关机！因为开机状态下，热盖将持续工作，长此以往，热盖容易损坏。４、PCR反应最后一步请务必设置为：16℃，2 min。（切忌4℃，∞，避免压缩机过度耗损！）５、PCR仪不能同一温度设置较长时间，16℃３小时。 ６、PCR仪不能开机运行过夜。
荧光定量PCR引物设计要求 荧光定量PCR引物的具体设计要求： 1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。 2. 产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)。 3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。 4.G+C含量在40%~60%之间，45-55%最佳。 5.碱基要随机分布，尽量均匀。 6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8.引物5′端可以修饰。 9.3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)。 10. 引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于 9KJ/mol。 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp. 13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或者有8个互补碱基同源。 15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。 16.TM值在58-62度之间。 17.引物设计的软件Primer 5.0 有专门针对荧光的。 ATGATGTTGACCTTGTCGCGTAACGATCCGTTTATCACCACTGACTACATGACATATATGTTCAA GTATGACACTGTTCATGGACAATGGAAGCATCATGAGCTTAAGGTCAAGGATGAGAAGACTCTTCTCTT CGGTGAGAAGCCAGTCACTGTTTTTGGCATCAGAAACCCTGAAGATATCCCATGGGGTGAGG CTGGGGC TGACTTTGTGGTC GAGTCCACTGGAGTCTTCACAGACAAAGACAAAGCTGCTGCCCATTTGAAGGGTGG TGCAAAGAAAGTCATCATCTCTGCTCCTAGCAAAGATGCTCCCATGTTTGTTATGGGTGTCAAC GAGAA GGAATACACACCCGAGC TTAACATTGTTTCAAATGCCAGCTGTACAACCAACTGCCTTGCTCCCTTGGC CAAGGTCATAAACGACAGGTTTGGCATTGTTGAGGGTCTTATGACAACTGTGCACGCTATGGCTGCCAC TCAAAAGACTGTTGATGGTCCATCAATGAAGGACTGGAGAGGTGGAAG
美国伯乐公司MyCycler PCR仪操作步骤： 1．接通电源，打开开关，如果仪器处于备用状态，可直接按显示屏上的standby键，在通过一个快速自动诊断程序后，初始界面将会出现。 2．按F2键，初始界面上将会出现选择菜单。 3．选择“Custom”项，并按Enter键以建立新的运行程序。如果菜单已有的程序与你需要的程序相近，那么你也可以在选择菜单对已有的模板程序进行编辑。 4．编辑运行程序： 仪器默设的运行程序有3个简单的步骤组成。95℃30秒，55℃30秒，72℃0秒。你将根据需要按如下步骤更改。 （1）按F4键增加或删除部分步骤，注意竖线把不同的循环周期搁开，正在运行的循环次数在第一次循环的左下脚标出。 （2）采用方向键在不同的步骤之间转换，调定点温度将显示在温度曲线上方。相反运行时间将显示在温度曲线下方。循环次数将在每一个循环最后一步的右下角，后跟随“x”符号。（3）在用方向键选择要更改的温度调定点以及运行时间后，按F3，选择要更改的操作，此时会弹出一个新的界面，在此界面下，可以输入所需的时间或温度。 （4）程序编辑完成后按F5。 5．在选择菜单中点“Save Protocol As…”保存编辑程序，以字母与数字组合命名。然后按Enter键完成操作。 6．此时初始界面会出现，按F1键进入程序储存库，用箭头键选择你新编辑的程序，随后按Enter键，将会出现一个选择菜单。选择“Run Protocol” 7．随之出现运行方案界面。提示是否想热启动（如果你选择“YES”将会进一步提示你所需要的热启动温度），如果你选择“Algorithmic Measurement”，界面上还会让你选择温度标准以及取样容积标准。 8．按F5开始运行程序。 9．运行完毕后按Stop键完成操作。
qPCR引物设计原则及具体操作步骤 1.找基因（DNA） 1)通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search搜索即可 2)通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3)通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4)找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存 序列。
2.qPCR引物和TaqMan探针的设计 1)引物设计注意事项 a)引物长度17bp-25bp为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出 现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b)扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c)引物的Tm值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距 不超过1℃，推荐使用Primer Premier 5进行Tm值计算； d)引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其 是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 e)引物设计时请尽量避开TC或者AG的连续结构。 f)3’端不能超过3个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能 搭上 g)特异性要有保证，与非特异模板3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4个及以上的 GC互搭 h)引物3’端最后五个碱基不能包含超过2个以上的G或者C i)引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j)正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k)在Primer-BLAST设计时，在Organism 处选择相应物种 l)需跨外显子设计，避免基因组污染 2)TaqMan探针设计指南 a)探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔1~5个 碱基（一般10个以内，最好是1个碱基）。 b)应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免GGGG或者更多的连续G出现。 c)探针5’端应避免使用碱基G，因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存 在淬灭作用 d)3’端应避免使用碱基A
目录： 1 安全预防法 2 安装 2.1 交货包装 2.2 仪器的安装 2.3 功能性单元 2.3.1 Mastercycler ep realplex 2.4 启动 2.4.1 realplex模块与热模块之间的连接 2.4.2 Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接2.4.3 与其它部件的连接 2.4.4 realplex软件的安装 2.4.4.1 安装主程序 2.4.4.2 数据恢复 2.4.4.3 开始realplex软件的运行 3. 操作 3.1 管理者登陆 3.2 登陆 3.3 用户变更 3.4 系统配置 3.4.1 对使用者的管理 3.4.1.1 新用户建立 3.4.1.2 编辑用户 3.4.1.3删除用户 3.4.2 用户层 3.4.3 循环仪 3.4.4 realplex 模块 3.4.5 系统层 3.4.5.1 特性 3.4.5.2 登陆出错信息 3.4.5.3 用户登陆 3.4.5.4 软件更新 3.5 检测项目管理 3.5.1 建立检测项目 3.5.2 打开检测项目 3.5.3 保存检测项目 3.5.4 保存模板文件 3.5.5 模板文件的使用 3.5.6 复制检测项目 3.5.7 检测项目的输出 3.5.8 检测项目的输入 3.5.9 建立文件夹
3.5.10 删除检测项目和文件夹 3.6 探针管理 3.7 染料管理 3.8 校准 3.8.1 背景校准 3.8.2 颜色校准 3.8.2.1 使用商业的校准工具包进行的颜色校准3.8.2.2 客户特有的染料的校准 3.9 数据库管理 3.9.1 当前数据库的自动保存 3.9.2 当前数据库的保存 3.9.3 输入数据库 3.9.4 数据库的归档 4 编程（检测项目的建立） 4.1 建立一个新的检测项目 4.2 建立板布局 4.2.1 染料的确定 4.2.2 参考染料的选择 4.2.3 样本容积输入 4.2.4 探针类型的确定 4.2.5 背景的确定 4.2.6 样品类型的定义 4.2.6.1 标准 4.2.6.2 阳性对照 4.2.6.3 阴性对照 4.2.6.4 未知样品 4.2.7 复制和标准系列的自动建立 4.2.8 定量的样品类型 4.2.9 相对定量的样品类型 4.2.9.1 多plex分析例子 4.2.9.2 单plex分析的例子 4.2.10 熔点分析中的样品类型 4.2.11 终点测定中的样品类型 4.2.12 +/-检测项目中的样品类型 4.2.13 基因辨识中的样品类型 4.2.12 样品的复制与剪切 4.2.15 删除样品 4.2.16 几个样品的归组 4.2.17 子检测项目的测定 4.2.18 板布局的删除 4.2.19 完整检测项目的板布局编辑 4.3 pcr程序的建立 4.3.1 用模板程序建立一个pcr程序 4.3.2 不用模板程序建立pcr程序
荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定比较序列的开始与结尾。有时因
为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低换了一对貌似很烂的引物结果溶解曲线却长得很漂亮扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高适当降低反应退火温度看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解反转录过程是否完整设好内参正对照最后所有这些都满足还是没扩增出来重新设计引物吧1设计的时候尽量靠近基因的3端这样能最大限度地保证扩增效率2尽量跨越内含子这样可以保证检测有无基因组污染3两条引物的Tm值不要相差太大4产物长度保证在80200bp之间最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化最好设计的时候记录下产物的Tm值这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上一般Tm80以下的峰都是引物二聚体对于水稻等GC含量比较高的基因组产物Tm不要高于94个人观点。如果同时检测很多对基因的表达量变化我会尽量调整所有产物的Tm值与内参产物的Tm相差不太大这样方便实验操作和最后的分析。3相对错配来说我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大当然也别错配得太邪门了非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了引物的3端不要有错配。5一
般我们用Primer Premier设计软件我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物找到一条评分是100的再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的 引物一般5分钟之内可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5端的300-400bp区域内可以用DNAMANAlignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。 3、引物长度一般在17-25bp之间上下游引物不能相差太大。 4、GC含量在40-60之间45-55最佳。 5、碱基要随机分布尽量均匀。 6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8、引物5?6?7端可以修饰。 9、3?6?8端不可修饰而且要避开ATGC rich 的区域避开T/C A/G连续结构2-3个。10、引物3端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5端大于3?6?7端。12、定量产物长度80-150bp最好最长是300bp。实时定量PCR完全手册方法简介所谓的实时荧光定量PCR 就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR 反应中引入了一种荧光化学物质随着PCR 反应的进行PCR 反应产物不断累计荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化从而得到一条
步骤： 1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单：“-RUN ENTER PROGRAM PROGRAM”准备执行程序。 2、放入样本管，关紧盖子。 3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：“-ENABLE DISABLE HEATED LID”按《Proceed》选 择ENABLE，则开始执行程序。 4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示“-NEW LIST EDIT DELET”，按《Proceed》，1）选择NEW，命名新的程序， 最多8个字母，输入后按《Proceed》确认。 2）输入程序步骤：名字输入后，显示“STEP1 _TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。 3）选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数最多可达9999次）（为实际循环数 -1)。 4) 选择option，显示“STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE”再选择increment，按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》确认。选择extend，按《Proceed》确认，输入每个循环增加或减少的时间（-60～60秒），按《Proceed》确认。 选择slop（指温度上升或下降的速率），输入温度的改变值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。 4）选择End，输入结束步骤。 5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。 6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。 编辑程序： 1、可以用《Cancel》键删除输错的值，输入新的值后按《Proceed》确认。 2、对于未输完的程序，要先输入END，按《Proceed》将程序储存后才能删除。 3、删除已经储存的程序：从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM，按《Proceed》，显示 主菜单，选择DELET，用《Select》选择删除。 4、查看程序的步骤：在主菜单上选择LIST，按《Proceed》，用《Select》将选择名称， 再按《Proceed》，显示程序的第一步，用《Select》键向前、向后翻页查看，此时不能改变程序的值。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul 体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul 混匀，70℃5min，立即冰浴 5*buffer 4.0ul 8.0ul dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul RNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul 混匀，37℃5min M-MLV 1.0ul 2.0ul 42℃60min ，70℃10min 反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求
PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。
Manual Software Version 5.00gr April 2005 Order-No. 050-800 TGradient 48 050-801 TGradient 96 Biometra biomedizinische Analytik GmbH Rudolf-Wissell-Str. 30, D-37079 Goettingen Tel.: 0551/50 686-0; Fax: 0551/50 686-66 email: info@https://www.doczj.com/doc/7d15887041.html, https://www.doczj.com/doc/7d15887041.html,
TG RADIENT Manual____________________________________________________________I 1INTRODUCTION (1) 2BEFORE YOU START (2) 2.1S AFETY PRECAUTIONS (2) 3FIRST STEPS WITH THE TGRADIENT (3) 3.1T HE TG RADIENT T HERMOCYCLER FRONT V IEW (3) 3.2T HE TG RADIENT REAR VIEW (4) 3.3T HE TG RADIENT CONTROL PANEL (5) 3.4I NITIAL SELF TEST (6) 3.5T HE TG RADIENT DISPLAY (6) 3.6H ANDLING OF THE ADJUSTABLE HEATED L ID (6) 3.7R ELEASING WHEEL IN CASE OF BLOCKED LID (7) 4CREATING A PROGRAM (8) 4.1S ELECT A DIRECTORY (8) 4.2S ELECT A PROGRAM STORE (8) 4.3E NTER NAME FOR SUBDIRECTORY (9) 4.4E NTER A PROGRAM NAME (9) 4.5E NTER THE LID TEMPERATURE (10) 4.6S ELECT / DESELECT PRE-HEATING OF THE LID (10) 4.7E NTER TEMPERATURE AND TIME SETTINGS (11) 4.8S ET TEMPERATURE GRADIENT (12) 4.9V IEW DIFFERENT TEMPERATURES OF THE GRADIENT IN THE BLOCK (12) 4.10S ET CYCLE NUMBER (13) 4.11C OOL BELOW AMBIENT TEMPERATURE (13) 4.12S AVE PROGRAM (14) 5VIEW/EDIT PROGRAM DATA (15) 5.1D ELETE / INSERT PROGRAM STEPS (15) 5.2C OPY PROGRAM (16) 5.3D ELETE PROGRAM (17) 6FURTHER PROGRAMMING OPTIONS (19) 6.1P ROGRAM TIME INCREMENTS (19) 6.2P ROGRAM TOUCH DOWN (20) 6.3A DJUST HEATING AND COOLING RAMPS (20) 7RUN PROGRAM (21) 7.1S ELECT AND START PROGRAM (21) 7.2D ISPLAY DURING OPERATION (22) 7.3V IEW REMAINING RUN TIME (23) 7.4V IEW CURRENT GRADIENT TEMPERATURES (23) 7.5P AUSE / STOP PROGRAM (24) 8SPECIAL FUNCTIONS (25) 8.1P RINT PROTOCOLS (25) 8.2S WITCH BEEP ON/OFF (25) 8.3S ELECT LANGUAGE (26) 8.4RS232 C ONTROL (26) 8.5B LOCK TYPE (26) 9MAINTENANCE (27) 10EXCHANGE OF MODULES (27) 11TROUBLE SHOOTING (28) 11.1S LOW HEATING AND COOLING (28) 11.2A DAPTATION OF PROTOCOLS FROM OTHER CYCLERS (28)